Name: studying normal tissue radiation effects using extracellular matrix hydrogels
Uploaded: 2019-07-24T13:00:00
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Gli autori ringraziano la dott.ssa Laura L. Bronsart per aver fornito le cellule GFP e luciferase-4T1, il Dr. Edward L. LaGory per un consiglio su 1-((4-(Xylylazo)xylyl]azo)-2-naphthol che staina, il Dr. Craig L. Duvall per IVIS e lyophilizer use, e Dr. Scott A. usare. Questa ricerca è stata sostenuta finanziariamente da NIH grant #R00CA201304.

Gli studi sugli animali sono stati effettuati in conformità con le linee guida istituzionali e i protocolli approvati dal Vanderbilt Institutional Animal Care and Use Committee.
1. Preparazione ed irradiazione ex vivo di MFP
<ol><li>Sacrificare i topi atimici Nu/Nu (8-10 settimane) usando l'asfissia di CO2 seguita dalla lussazione cervicale.</li>
	<li>Pulire la pelle con 70% di etanolo.</li>
	<li>Raccogliere pastiglie di grasso mammaria (MFP) da topi sacrificati utilizzando forbi...

<ol>
	<li>Hanahan, D., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+hallmarks+of+cancer.">The hallmarks of cancer.</a> Cell. 100 (1), 57-70 (2000).</li><li>Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+statistics,+2018.">Cancer statistics, 2018.</a> CA: A Cancer Journal for Clinicians. 68 (1), 7-30 (2018).</li><li>Lowery, A. J., Kell, M. R., Glynn, R. W., Kerin, M. J., Sweeney, K. 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A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+characterization+of+a+naturally+derived+lung+extracellular+matrix+hydrogel.">Development and characterization of a naturally derived lung extracellular matrix hydrogel.</a> Journal of Biomedical Materials Research Part A. 104 (8), 1922-1935 (2016).</li><li>Bonvillain, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Nonhuman+Primate+Model+of+Lung+Regeneration:+Detergent-Mediated+Decellularization+and+Initial+In+Vitro+Recellularization+with+Mesenchymal+Stem+Cells.">A Nonhuman Primate Model of Lung Regeneration: Detergent-Mediated Decellularization and Initial In Vitro Recellularization with Mesenchymal Stem Cells.</a> Tissue Engineering Part A. 18 (23-24), 2437-2452 (2012).</li><li>Brown, B. 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R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concentration-dependent+rheological+properties+of+ECM+hydrogel+for+intracerebral+delivery+to+a+stroke+cavity.">Concentration-dependent rheological properties of ECM hydrogel for intracerebral delivery to a stroke cavity.</a> Acta Biomaterialia. 27, 116-130 (2015).</li><li>Mierke, C. T., Frey, B., Fellner, M., Herrmann, M., Fabry, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin+5+1+facilitates+cancer+cell+invasion+through+enhanced+contractile+forces.">Integrin 5 1 facilitates cancer cell invasion through enhanced contractile forces.</a> Journal of Cell Science. 124 (3), 369-383 (2011).</li><li>Ahmadzadeh, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+the+two-way+feedback+between+contractility+and+matrix+realignment+reveals+a+nonlinear+mode+of+cancer+cell+invasion.">Modeling the two-way feedback between contractility and matrix realignment reveals a nonlinear mode of cancer cell invasion.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (9), E1617-E1626 (2017).</li></ol>

Questo metodo di formazione di idrogel dipende in gran parte dalla quantità di tessuto iniziale. Gli MFP Murine sono piccoli e il processo di decellularizzazione comporta una significativa riduzione del materiale (Tabella1). Il processo può essere ripetuto con più MFP per aumentare la resa finale. La fresatura è un altro passo importante che può portare alla perdita di materiale. Altri hanno dimostrato successo con un mulino criogenico, ma questo protocollo si basa sulla fresatura tramite un mortaio...

Il cancro è caratterizzato da un'eccessiva proliferazione di cellule che possono eludere l'apoptosi e anche metastasi a siti distanti1. Il cancro al seno è una delle forme più comuni tra le femmine negli Stati Uniti, con una stima di 266.000 nuovi casi e 40.000 decessi nel 20182. Un sottotipo particolarmente aggressivo e difficile da trattare è il cancro al seno triplo negativo (TNBC), che manca di recettore estrogeno (ER), recettore progesterone (PR), e fattore di crescita epidermica umana (HER2). La radioterapia è comunemente usata nel cancro al seno per eliminare le cellule tumorali residue dopo la lumpectomia, ma oltre il 13% dei pazienti TNBC sperimenta ancora recidiva nel sito tumorale primario3.
È noto che la radioterapia è efficace nel mitigare la metastasi e la recidiva perché la combinazione di lumpectomia e radiazione si traduce nella stessa sopravvivenza a lungo termine della mastectomia4. Tuttavia, recentemente è stato dimostrato che il trattamento delle radiazioni è associato alla ricorrenza locale al sito tumorale primario in impostazioni immunocompromesse5,6. Inoltre, è ben noto che la radiazione cambia la matrice extracellulare (ECM) del tessuto normale inducendo la fibrosi7. Pertanto, è importante comprendere il ruolo dei cambiamenti ECM indotti dalle radiazioni nella dettatura del comportamento delle cellule tumorali.
I tessuti decellularizzati sono stati utilizzati come modelli in vitro per studiare la malattia8,9. Questi tessuti decellularizzati conservano la composizione ECM e riassumono il complesso ECM in vivo. Questo tessuto decellularizzato ECM può essere ulteriormente elaborato e digerito per formare idrogel ECM ricostituiti che possono essere utilizzati per studiare la crescita cellulare e la funzione10,11. Ad esempio, gli idrogel iniettabili derivati dalla lipoaspirate umana decellularizzato e dal tessuto miocardico servivano come metodi non invasivi di ingegneria tissutale, e un idrogel derivato dal tessuto polmonare porcina è stato utilizzato come metodo in vitro di test pignoramento e vitalità delle cellule staminali mesenchymiche12,13,14. L'effetto dei normali danni da radiazioni tissutali sulle proprietà ECM, tuttavia, non è stato studiato.
Gli idrogel derivati dall'ECM hanno il più grande potenziale di studio in vitro dei fenomeni in vivo. Sono stati studiati diversi altri materiali, tra cui collagene, fibrina e matrigel, ma è difficile riassumere sinteticamente la composizione dell'ECM13. Un vantaggio dell'utilizzo di idrogel derivati da ECM è che l'ECM contiene le proteine e i fattori di crescita necessari per un particolare tessuto14,15. L'irradiazione del tessuto normale durante la lumpectomia provoca cambiamenti significativi all'ECM, e gli idrogel derivati da ECM possono essere utilizzati per studiare questo effetto in vitro. Questo metodo potrebbe portare a modelli di malattia più complessi e più accurati.
In questo studio, abbiamo sottoposto i cuscinetti a grasso mammario murino (MFP) alle radiazioni ex vivo. Le Unità multifunzione sono state decellularizzate e trasformate in soluzione pre-gel. Gli idrogel sono stati formati con cellule 4T1 incorporate, una linea cellulare Murine TNBC. Sono state esaminate le proprietà reologiche del materiale idrogel e sono state valutate le dinamiche delle cellule tumorali all'interno degli idrogel. Gli idrogel fabbricati da MFP irradiati hanno migliorato la proliferazione delle cellule tumorali. Studi futuri incorporeranno altri tipi di cellule per studiare le interazioni cellula-cellula nel contesto della recidiva del cancro dopo la terapia.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>10% Neutral Buffered Formalin, Cube with Spigot</td>
			<td>VWR</td>
			<td>16004-128</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-methylbutane</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>19387</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AR 2000ex Rheometer</td>
			<td>TA Instruments</td>
			<td>10D4335</td>
			<td>rheometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A1933-25G</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>calcein acetoxymethyl (calcein AM)</td>
			<td>Molecular Probes, Inc.</td>
			<td>C1430</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Luciferin Firefly, potassium salt</td>
			<td>Biosynth Chemistry &#38; Biology</td>
			<td>L-8820</td>
			<td>(S)-4,5-Dihydro-2-(6-hydroxy-2-benzothiazolyl)-4-thiazolecarboxylic acid potassium salt</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPX Mountant for Histology</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>06522-500ML</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate-buffered saline</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14040133</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin-Y with Phloxine</td>
			<td>Richard-Allan Scientific</td>
			<td>71304</td>
			<td>eosin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ethidium homodimer</td>
			<td>Molecular Probes, Inc.</td>
			<td>E1169</td>
			<td>ethidium homodimer-1 (EthD-1)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F0926-500ML</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisher Healthcare Tissue-Plus O.C.T. Compound</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>23-730-571</td>
			<td>cryostat embedding medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount-G</td>
			<td>SouthernBiotech</td>
			<td>0100-01</td>
			<td>aqueous based mounting medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FreeZone 4.5</td>
			<td>Labconco</td>
			<td>7751020</td>
			<td>lyophilizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342 Solution (20 mM)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>62249</td>
			<td>blue fluorescent dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>258148-500ML</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IVIS Lumina III</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>CLS136334</td>
			<td>bioluminescence imaging system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimtech Science Kimwipes</td>
			<td>Kimberly Clark</td>
			<td></td>
			<td>delicate task wipes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Propanol (Peroxide-Free/Sequencing), Fisher BioReagents</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1130-500</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oil Red O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>O0625-25G</td>
			<td>1-([4-(Xylylazo)xylyl]azo)-2-naphthol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OPS Diagnostics CryoGrinder</td>
			<td>OPS Diagnostics, LLC</td>
			<td>CG-08-02</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (10X), pH 7.4</td>
			<td>Quality Biological, Inc.</td>
			<td>119-069-151</td>
			<td>Phosphate-buffered saline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pepsin from porcine gastric mucosa</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6887-5G</td>
			<td>pepsin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peracetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>77240-100ML</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin-iFluor 594 Reagent (ab176757)</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab176757</td>
			<td>phalloidin conjugate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propylene glycol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>W294004-1KG-K</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Richard-Allan Scientific Signature Series Bluing Reagent</td>
			<td>Richard-Allan Scientific</td>
			<td>7301L</td>
			<td>bluing agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Richard-Allan Scientific Signature Series Hematoxylin 7211</td>
			<td>Richard-Allan Scientific</td>
			<td>7211</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI Medium 1640</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11875-093</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate, 98%</td>
			<td>Frontier Scientific</td>
			<td>JK559522</td>
			<td>deoxycholic acid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5016</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton x-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100-100ML</td>
			<td>t-Octylphenoxypolyethoxyethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200-056</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman qualitative filter paper, Grade 4</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>1004-110</td>
			<td>grade 4 qualitative filter paper</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylenes (Certified ACS), Fisher Chemical</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>X5-4</td>
			<td>-</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

studying normal tissue radiation effects using extracellular matrix hydrogels

La radiazione è una terapia per pazienti con carcinoma mammario triplo negativo. L'effetto della radiazione sulla matrice extracellulare (ECM) del tessuto mammario sano e il suo ruolo nella ricorrenza locale nel sito tumorale primario sono sconosciuti. Qui presentiamo un metodo per la decellularizzazione, la linfafazione e la fabbricazione di idrogel ECM derivati da cuscinetti di grasso mammari murno. I risultati sono presentati sull'efficacia del processo di decellularizzazione e sono stati valutati i parametri reologici. Le cellule del cancro al seno etichettate GFP e luciferasi incapsulate negli idrogel hanno dimostrato un aumento della proliferazione degli idrogel irradiati. Infine, la colorazione coniugata phalloidin è stata impiegata per visualizzare l'organizzazione del citoscheletro delle cellule tumorali incapsulate. Il nostro obiettivo è quello di presentare un metodo per la fabbricazione di idrogel per lo studio in vitro che imitano l'ambiente del tessuto mammario in vivo e la sua risposta alle radiazioni al fine di studiare il comportamento delle cellule tumorali.

Le Unità multifunzione sono state decellularizzate in seguito all'irradiazione mediante la procedura illustrata nella figura 1A. Vengono mostrati i PFP pre-decellularizzazione (Figura 1B) e post-decellularizzazione (Figura 1C). La decellularizzazione è stata confermata utilizzando la colorazione ematossilia ed eosina (H & E) e 1-([4-(Xylylazo)xylyl]-2-naphthol colorazione è stato utilizzato per valutare il contenuto lipidico (F...

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Studying Normal Tissue Radiation Effects using Extracellular Matrix Hydrogels

Studiare i normali effetti di radiazione dei tessuti utilizzando idrogel a matrice extracellulare

Questo protocollo presenta un metodo per la decellularizzazione e la successiva formazione di idrogel di cuscinetti di grasso mammari a seguito di irradiazione ex vivo.

Radiation is a therapy for patients with triple negative breast cancer. The effect of radiation on the extracellular matrix (ECM) of healthy breast tissue ...

Questo protocollo mostra che le radiazioni influenzano le proprietà della matrice extracellulare del tessuto adiposo nel cuscinetto di grasso mammario murino. L'aggiunta di radiazioni in un modello di decellularizzazione non è mai stata fatta prima. Questa tecnica utilizza diversi passaggi di lavaggio che servono ciascuno a uno scopo chimico unico nel processo di decellularizzazione.La specificità di questa tecnica consente lavaggi chimici più delicati, per preservare meglio le proprietà tissutali. La ricaduta del cancro al seno si verifica dopo la terapia, specialmente nei casi tripli negativi. Valutare come la matrice extracellulare irradiata altera il comportamento delle cellule tumorali porterà a importanti scoperte sui meccanismi di ricorrenza.Dopo aver irradiato i campioni, utilizzando una sorgente di cesio, trasferire le MFP irradiate e i mezzi RPMI completi in un armadio di biosicurezza. Riempire piatti di sei centimetri o 10 centimetri con mezzi sufficienti per immergere l'MFP. Incubare a 37 gradi Celsius, con 5% di anidride carbonica, per due giorni.In primo luogo, posizionare l'MFP in piatti di sei centimetri con cinque millilitri di soluzione Trypsin-EDTA. Spruzzare e pulire i piatti con il 70% di etanolo e incubare a 37 gradi Celsius per un'ora. Utilizzare filtri da 0,7 millilitri per lavare le MFP con acqua deionizzata, versando acqua sul tessuto tre volte.Utilizzare le forcep per massaggiare manualmente il tessuto tra un lavaggio e l'altro. Successivamente, asciugare brevemente il tessuto su un delicato compito pulirlo e pesarlo. Posizionare i tessuti essiccati in un becher pre-autoclavato, contenente una barra di agitazione di dimensioni appropriate e coprire i tessuti con 60 millilitri di 3%t-ottilfenossipotetossietanolo per grammo di tessuto.Mescolare per un'ora a temperatura ambiente. Quindi gettare il contenuto del becher in un colino. Risciacquare il becher con acqua deionizzata e versarlo sui tessuti.Ripetere questo processo di risciacquo altre due volte, assicurandosi di utilizzare le forcelle per massaggiare manualmente il tessuto tra un risciacquo e l'altro. Dopo questo, asciugare brevemente il tessuto su un delicato compito pulire e pesare. Riposizionare i tessuti e le barre di agitazione negli stessi becher e coprirli con 60 millilitri di acido deossicolico al 4% per grammo di tessuto.Mescolare a temperatura ambiente per un'ora. Quindi, gettare il contenuto del becher in un colino a rete, sciacquare il becher con acqua deionizzata e versarlo sui tessuti. Ripetere questo processo di risciacquo altre due volte, assicurandosi di utilizzare le forcelle per massaggiare manualmente il tessuto tra un risciacquo e l'altro.Asciugare brevemente il tessuto risciacquato su una delicata salvietta e pesarlo. Mettere i tessuti essiccati nello stesso becher, insieme all'acqua fresca deionizzata, integrata con 1%penicillina-streptomicina. Coprire saldamente il becher con pellicola di paraffina e lasciare a 4 gradi Celsius durante la notte.Il giorno dopo scolare il contenuto del becher in un colino, asciugare brevemente il tessuto su un delicato compito pulirlo e pesarlo. Quindi, posizionare l'MFP nello stesso becher con una barra di agitazione di dimensioni appropriate. Coprire il tessuto con 60 millilitri di una soluzione contenente il 4%etanolo e lo 0,1% di acido peracetico per grammo di tessuto.Mescolare a temperatura ambiente per due ore. Gettare il contenuto del becher in un colino da 0,7 millimetri. Utilizzare le forcelle per massaggiare manualmente il tessuto e riposizionare il contenuto nel becher.Lavare il tessuto coprendolo con 60 millilitri di 1X PBS per grammo di tessuto. Mescolare a temperatura ambiente per 15 minuti. Ripeti l'intero processo di lavaggio ancora una volta.Quindi, gettare il contenuto del becher in un colino di 0,7 millimetri. Utilizzando le forcelle, massaggiare manualmente il tessuto e riposizionare il contenuto nel becher. Lavare il tessuto coprendolo con 60 millilitri di acqua deionizzata per grammo di tessuto.Mescolare a temperatura ambiente per 15 minuti. Ripeti l'intero processo di lavaggio ancora una volta. Asciugare brevemente il tessuto lavato su una delicata salvietta e pesarlo.Gettare il tessuto e il contenuto in un colino e utilizzare le forcelle per massaggiare manualmente il tessuto. Riposizionare il contenuto nel becher e coprire i tessuti con 60 millilitri di 100%n-propanolo per grammo di tessuto. Mescolare a temperatura ambiente per un'ora.Quindi, asciugare brevemente il tessuto su un delicato compito pulirlo e pesarlo. Gettare il tessuto e il contenuto in un colino di 0,7 millimetri e utilizzare le forcelle per massaggiare manualmente il tessuto. Riposizionare il contenuto nel becher e lavare il tessuto coprendolo con 60 millilitri di acqua deionizzata per grammo di tessuto.Mescolare a temperatura ambiente per 15 minuti. Ripetere questo processo di lavaggio tre volte. Dopo questo, asciugare brevemente il tessuto su un delicato compito pulirlo e pesarlo.Trasferire il tessuto in un tubo etichettato da 15 millilitri e congelare a -80 gradi Celsius durante la notte. In primo luogo, riempire un contenitore poco profondo con azoto liquido. Rimuovere i campioni dal congelatore e pesare ogni MFP lyophilizzato.Posizionare un campione nella malta, utilizzare un guanto criogenico per tenere la malta nell'azoto liquido. Quindi, utilizzare un pestello, attaccato a un trapano mentre si tiene a mano, per fresare il campione. Fresare a intervalli di un minuto per controllare l'avanzamento e rimuovere la mano guantata dall'azoto liquido.Ripetere questo processo di fresatura per tutti i campioni, assicurandosi di spruzzare e pulire la malta e il pestello con etanolo tra ogni campione. Conservare i campioni in polvere in tubi da 15 millilitri a -80 gradi Celsius fino a quando non sono pronti per l'uso. Per iniziare, rimuovere i campioni dal congelatore e scongelare a temperatura ambiente.Mentre i campioni vengono scongelati, mescolare la pepsina in acido cloridrico per formare una soluzione di Pepsin-HCL. Quindi, aggiungere la polvere di campione e la soluzione Pepsin-HCL a un tubo da 15 millilitri, aggiungere una piccola barra di agitazione e mescolare per 48 ore. Dopo questo, metti i tubi sul ghiaccio per cinque minuti.Aggiungere 10X PBS a ciascun campione, in modo che la soluzione finale abbia una concentrazione di 1X PBS. Quindi, aggiungere il 10% di volume/volume, 0,1 idrossido di sodio molare ad ogni soluzione, per raggiungere il pH 7,4, utilizzando carta pH per testare ogni soluzione singolarmente. Utilizzando una soluzione di gel pH 7.4, rimescolare la GFP pellettata e la luciferasi etichettate 4T1 celle a una concentrazione di 500, 000 o 1.000.000 di cellule per millilitro di soluzione di gel.Aggiungere 16 microlitri di soluzione di cellule gel ad ogni pozzo di uno scivolo da camera da 16 po 'e incubare a 37 gradi Celsius per 30 minuti. Successivamente, aggiungere 100 microlitri di supporti RPMI completi a ciascun pozzo. Continuare a incubare a 37 gradi Celsius per 48 ore.Quindi, usa un microscopio a fluorescenza per osservare le cellule a una lunghezza d'onda di eccitazione di 519 nanometri e una lunghezza d'onda di emissione di 618 nanometri. In questo studio vengono studiati i normali effetti delle radiazioni tissutali, utilizzando idrogel a matrice extracellulare. La colorazione di ematossilina ed eosina è usata per confermare la decellularizzazione, attraverso la perdita di nuclei e altre tracce di DNA.Mentre la colorazione Oil Red O viene utilizzata per valutare il contenuto lipidico e confermare la ritenzione di una morfologia della dipasite. Le proprietà reologiche degli idrogel ECM sono valutate a 37 gradi Celsius. Il modulo di stoccaggio è superiore al modulo di perdita per tutte le condizioni, dimostrando una formazione stabile di idrogel.GFP e luciferasi etichettate 4T1 cellule carcinoma mammarie vengono quindi incapsulate negli idrogel. La proliferazione cellulare viene esaminata mediante microscopia a fluorescenza, mediante misurazioni dell'illuminescenza e colorazione di vitalità, 48 ore dopo l'incapsulamento. Gli idrogel irradiati mostrano una tendenza crescente nella proliferazione delle cellule tumorali.Il coniugato di phalloidina viene utilizzato per visualizzare l'F-Actin nelle cellule incapsulate. Ricordarsi di raffreddare la malta prima di posizionare il tessuto all'interno del mulino, una malta calda può portare a fresatura incompleta. Prestare attenzione quando si maneggiano n-propanale e pepsina, solo aprire n-propanali e altri agenti decellularizzanti sotto una cappa chimica.Se possibile, pesare la pepsina sotto una cappa chimica, in quanto vi è il pericolo di inalazione. I cambiamenti di composizione dell'ECM dopo l'irradiazione e la decellularizzazione possono essere valutati utilizzando la spettrometria di massa e la spettroscopia Raman. Inoltre, la struttura in fibra degli idrogel ECM può essere analizzata scansionando la microscopia elettronica.Questo metodo ha il potenziale per essere ampliato per esaminare gli effetti delle radiazioni non solo sulle cellule tumorali ma anche sulle cellule immunitarie, così come sui tessuti che sperimentano danni da radiazioni, a causa della terapia. Questa tecnica di decellularizzazione consentirà ai ricercatori di valutare le proprietà della matrice extracellulare del tessuto dopo la radiazione, che è un'importante opzione di trattamento nella maggior parte dei tumori.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Analyzing the Communication Between Monocytes and Primary Breast Cancer Cells in an Extracellular Matrix Extract (ECME)-based Three-dimensional System

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Analizzando la comunicazione tra i monociti e le cellule di cancro al seno primario in una tabella extracellulare estrarre (ECME)-sistema tridimensionale basato su

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Ricerca

Ricerca sul cancro

PET and MRI Guided Irradiation of a Glioblastoma Rat Model Using a Micro-irradiator

PET e MRI guidate irradiazione di un modello del ratto di Glioblastoma utilizzando un Micro-irradiatore

For decades, small animal radiation research was mostly performed using fairly crude experimental setups applying simple single-beam techniques without ...

Imaging Approaches to Assessments of Toxicological Oxidative Stress Using Genetically-encoded Fluorogenic Sensors

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While oxidative stress is a commonly cited toxicological mechanism, conventional methods to study it suffer from a number of shortcomings, including ...

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In order to construct an effective and realistic model for tongue squamous cell carcinoma (TSCC) in vitro, the methods were created to produce ...

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Cell Cycle-specific Measurement of &#947;H2AX and Apoptosis After Genotoxic Stress by Flow Cytometry

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Caratterizzazione degli effetti degli inibitori espastatici sull'invasione 3D dello spheroid del tumore mediante microscopia confocale ad alta risoluzione

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Studiare il cancro al seno triplo negativo utilizzando il modello di cancro al seno ortotopico

Triple-negative breast cancer (TNBC) is an aggressive breast cancer subtype with limited therapeutic options. When compared to patients with less ...

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Studiare gli effetti dei ligandi paracrini setosecreti dal tumore sull'attivazione dei macrofagi utilizzando la co-cultura con i supporti membrana permeabili

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