Name: studying normal tissue radiation effects using extracellular matrix hydrogels
Uploaded: 2019-07-24T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Studying Normal Tissue Radiation Effects using Extracellular Matrix Hydrogels at JoVE.com

Forfatterne takker Dr. Laura L. Bronsart for å gi GFP-og luciferase-4T1 celler, Dr. Edward L. LaGory for råd om 1-([4-(Xylylazo) xylyl] AZO) -2-naphthol farging, Dr. Craig L. Duvall for IVIS og lyophilizer bruk, og Dr. Scott A. Guelcher for rheometer Bruke. Denne forskningen ble økonomisk støttet av NIH stipend #R00CA201304.

Dyrestudier ble utført i samsvar med institusjonelle retningslinjer og protokoller godkjent av Vanderbilt University institusjonelle Animal Care og use Committee.
1. forberedelse og ex vivo-bestråling av MFP-er
<ol><li>Offer athymic nu/nu mus (8 – 10 uker) ved bruk av CO2 kvelning etterfulgt av cervical forvridning.</li>
	<li>Rengjør huden med 70% etanol.</li>
	<li>Samle bryst fett pads (MFP) fra ofret mus ved hjelp av pre-sterilisert saks og tang i et 15 mL konisk rør som i...

<ol>
	<li>Hanahan, D., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+hallmarks+of+cancer.">The hallmarks of cancer.</a> Cell. 100 (1), 57-70 (2000).</li><li>Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+statistics,+2018.">Cancer statistics, 2018.</a> CA: A Cancer Journal for Clinicians. 68 (1), 7-30 (2018).</li><li>Lowery, A. J., Kell, M. R., Glynn, R. W., Kerin, M. J., Sweeney, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Locoregional+recurrence+after+breast+cancer+surgery:+a+systematic+review+by+receptor+phenotype.">Locoregional recurrence after breast cancer surgery: a systematic review by receptor phenotype.</a> Breast Cancer Research and Treatment. 133 (3), 831-841 (2012).</li><li>Miller, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+treatment+and+survivorship+statistics,+2016.">Cancer treatment and survivorship statistics, 2016.</a> CA: A Cancer Journal for Clinicians. 66 (4), 271-289 (2016).</li><li>Vilalta, M., Rafat, M., Giaccia, A. J., Graves, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recruitment+of+Circulating+Breast+Cancer+Cells+Is+Stimulated+by+Radiotherapy.">Recruitment of Circulating Breast Cancer Cells Is Stimulated by Radiotherapy.</a> Cell Reports. 8 (2), 402-409 (2014).</li><li>Rafat, M., Aguilera, T. A., Vilalta, M., Bronsart, L. L., Soto, L. A., von Eyben, R., Golla, M. A., Ahrari, Y., Melemenidis, S., Afghahi, A., Jenkins, M. J., Kurian, A. W., Horst, K. C., Giaccia, A. J., Graves, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages+Promote+Circulating+Tumor+Cell-Mediated+Local+Recurrence+Following+Radiation+Therapy+in+Immunosuppressed+Patients.">Macrophages Promote Circulating Tumor Cell-Mediated Local Recurrence Following Radiation Therapy in Immunosuppressed Patients.</a> Cancer Res. 75 (15), 4241-4252 (2018).</li><li>Haubner, F., Ohmann, E., Pohl, F., Strutz, J., Gassner, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wound+healing+after+radiation+therapy:+Review+of+the+literature.">Wound healing after radiation therapy: Review of the literature.</a> Radiation Oncology. 7 (1), 1-9 (2012).</li><li>Beachley, V. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+matrix+arrays+for+high+throughput+screening+and+systems+analysis+of+cell+function.">Tissue matrix arrays for high throughput screening and systems analysis of cell function.</a> Nature Methods. 12 (12), 1197-1204 (2015).</li><li>Tian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ-specific+metastases+obtained+by+culturing+colorectal+cancer+cells+on+tissue-specific+decellularized+scaffolds.">Organ-specific metastases obtained by culturing colorectal cancer cells on tissue-specific decellularized scaffolds.</a> Nature Biomedical Engineering. 2 (6), 443-452 (2018).</li><li>Saldin, L. T., Cramer, M. C., Velankar, S. S., White, L. J., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix+hydrogels+from+decellularized+tissues:+Structure+and+function.">Extracellular matrix hydrogels from decellularized tissues: Structure and function.</a> Acta Biomaterialia. 49, 1-15 (2017).</li><li>Hinderer, S., Layland, S. L., Schenke-Layland, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ECM+and+ECM-like+materials+&#8212;+Biomaterials+for+applications+in+regenerative+medicine+and+cancer+therapy.">ECM and ECM-like materials &#8212; Biomaterials for applications in regenerative medicine and cancer therapy.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 97, 260-269 (2016).</li><li>Young, D. A., Ibrahim, D. O., Hu, D., Christman, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Injectable+hydrogel+scaffold+from+decellularized+human+lipoaspirate.">Injectable hydrogel scaffold from decellularized human lipoaspirate.</a> Acta Biomaterialia. 7 (3), 1040-1049 (2011).</li><li>Singelyn, J. M., Christman, K. L., Littlefield, R. B., Schup-Magoffin, P. J., DeQuach, J. A., Seif-Naraghi, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Naturally+derived+myocardial+matrix+as+an+injectable+scaffold+for+cardiac+tissue+engineering.">Naturally derived myocardial matrix as an injectable scaffold for cardiac tissue engineering.</a> Biomaterials. 30 (29), 5409-5416 (2009).</li><li>Pouliot, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+characterization+of+a+naturally+derived+lung+extracellular+matrix+hydrogel.">Development and characterization of a naturally derived lung extracellular matrix hydrogel.</a> Journal of Biomedical Materials Research Part A. 104 (8), 1922-1935 (2016).</li><li>Bonvillain, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Nonhuman+Primate+Model+of+Lung+Regeneration:+Detergent-Mediated+Decellularization+and+Initial+In+Vitro+Recellularization+with+Mesenchymal+Stem+Cells.">A Nonhuman Primate Model of Lung Regeneration: Detergent-Mediated Decellularization and Initial In Vitro Recellularization with Mesenchymal Stem Cells.</a> Tissue Engineering Part A. 18 (23-24), 2437-2452 (2012).</li><li>Brown, B. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+Three+Methods+for+the+Derivation+of+a+Biologic+Scaffold+Composed+of+Adipose+Tissue+Extracellular+Matrix.">Comparison of Three Methods for the Derivation of a Biologic Scaffold Composed of Adipose Tissue Extracellular Matrix.</a> Tissue Engineering Part C: Methods. 17 (4), 411-421 (2011).</li><li>Link, P. A., Pouliot, R. A., Mikhaiel, N. S., Young, B. M., Heise, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tunable+Hydrogels+from+Pulmonary+Extracellular+Matrix+for+3D+Cell+Culture.">Tunable Hydrogels from Pulmonary Extracellular Matrix for 3D Cell Culture.</a> Journal of Visualized Experiments. (119), 1-9 (2017).</li><li>Massensini, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concentration-dependent+rheological+properties+of+ECM+hydrogel+for+intracerebral+delivery+to+a+stroke+cavity.">Concentration-dependent rheological properties of ECM hydrogel for intracerebral delivery to a stroke cavity.</a> Acta Biomaterialia. 27, 116-130 (2015).</li><li>Mierke, C. T., Frey, B., Fellner, M., Herrmann, M., Fabry, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin+5+1+facilitates+cancer+cell+invasion+through+enhanced+contractile+forces.">Integrin 5 1 facilitates cancer cell invasion through enhanced contractile forces.</a> Journal of Cell Science. 124 (3), 369-383 (2011).</li><li>Ahmadzadeh, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+the+two-way+feedback+between+contractility+and+matrix+realignment+reveals+a+nonlinear+mode+of+cancer+cell+invasion.">Modeling the two-way feedback between contractility and matrix realignment reveals a nonlinear mode of cancer cell invasion.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (9), E1617-E1626 (2017).</li></ol>

Denne metoden for hydrogel formasjon er i stor grad avhengig av mengden av starter vev. Murine MFP-er er små, og decellularization prosessen resulterer i en betydelig reduksjon av materiale (tabell 1). Prosessen kan gjentas med flere MFP-er for å øke den endelige avkastningen. Fresing er et annet viktig skritt som kan føre til tap av materiale. Andre har vist suksess med en kryogene mill, men denne protokollen er basert på fresing via en håndholdt mørtel og elektrisk drill med en morter vedlegg<su...

Kreft er preget av overflødig spredning av celler som kan unngå apoptose og også metastase til fjerntliggende områder1. Brystkreft er en av de vanligste formene blant kvinner i USA, med anslagsvis 266 000 nye tilfeller og 40 000 dødsfall i 20182. En spesielt aggressiv og vanskelig å behandle under type er trippel negativ brystkreft (TNBC), som mangler østrogen reseptor (ER), progesteron reseptor (PR), og menneskelig epidermal vekstfaktor (HER2). Strålebehandling er vanligvis brukt i brystkreft å eliminere gjenværende tumorceller etter lumpectomy, men over 13% av TNBC pasienter fortsatt oppleve gjentakelse på den primære tumor området3.
Det er kjent at strålebehandling er effektiv i begrensende metastasering og gjentakelse fordi kombinasjonen av lumpectomy og stråling resulterer i samme langsiktige overlevelse som mastektomi4. Men det har nylig blitt vist at strålebehandling er forbundet med lokale tilbakefall til den primære tumor området i immunsupprimerte innstillinger5,6. Dessuten er det velkjent at stråling endrer ekstracellulære matrise (ECM) av normalt vev ved å indusere fibrose7. Derfor er det viktig å forstå rollen til stråling-indusert ECM endringer i dikterer tumor celle atferd.
Decellularized vev har blitt brukt som in vitro-modeller for å studere sykdom8,9. Disse decellularized vev bevarer ECM-sammensetning og recapitulate komplekset in vivo ECM. Denne decellularized tissue ECM kan videre behandles og fordøyd å danne rekonstituert ECM hydrogeler som kan brukes til å studere cellevekst og funksjon10,11. For eksempel, injiserbare hydrogeler avledet fra decellularized menneskelige liposaspiratet og fra hjerteinfarkt vev fungert som ikke-invasiv metoder for vev engineering, og en hydrogel avledet fra svin lunge vev ble utnyttet som en in vitro metode for testing mesenchymal Stem Cell vedlegg og levedyktighet12,13,14. Effekten av normal vevs stråling skade på ECM-egenskaper, men har ikke blitt undersøkt.
Hydrogeler avledet fra ECM har størst potensial for in vitro studie av in vivo fenomener. Flere andre materialer har blitt studert, inkludert kollagen, fibrin og matrigel, men det er vanskelig å syntetisk recapitulate sammensetningen av ECM13. En fordel med å bruke ECM-avledet hydrogeler er at ECM inneholder de nødvendige proteiner og vekstfaktorer for en bestemt vev14,15. Bestråling av normalt vev under lumpectomy forårsaker betydelige endringer i ECM, og ECM-avledet hydrogeler kan brukes til å studere denne effekten in vitro. Denne metoden kan føre til mer komplekse og mer nøyaktige in vitro modeller av sykdom.
I denne studien har vi utsatt murine bryst fett pads (MFP-er) til stråling ex vivo. MFP-er ble decellularized og laget i pre-gel-løsning. Hydrogeler ble dannet med innebygde 4T1 celler, en murine TNBC cellelinje. De reologiske egenskapene til det hydrogel materialet ble undersøkt, og tumor celle dynamikk ble evaluert i hydrogeler. Hydrogeler fabrikkert fra bestrålt MFP-er forbedret tumor celle spredning. Fremtidige studier vil innlemme andre celletyper for å studere celle-celle interaksjoner i sammenheng med kreft gjentakelse etter behandling.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>10% Neutral Buffered Formalin, Cube with Spigot</td>
			<td>VWR</td>
			<td>16004-128</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-methylbutane</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>19387</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AR 2000ex Rheometer</td>
			<td>TA Instruments</td>
			<td>10D4335</td>
			<td>rheometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A1933-25G</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>calcein acetoxymethyl (calcein AM)</td>
			<td>Molecular Probes, Inc.</td>
			<td>C1430</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Luciferin Firefly, potassium salt</td>
			<td>Biosynth Chemistry &#38; Biology</td>
			<td>L-8820</td>
			<td>(S)-4,5-Dihydro-2-(6-hydroxy-2-benzothiazolyl)-4-thiazolecarboxylic acid potassium salt</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPX Mountant for Histology</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>06522-500ML</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate-buffered saline</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14040133</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin-Y with Phloxine</td>
			<td>Richard-Allan Scientific</td>
			<td>71304</td>
			<td>eosin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ethidium homodimer</td>
			<td>Molecular Probes, Inc.</td>
			<td>E1169</td>
			<td>ethidium homodimer-1 (EthD-1)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F0926-500ML</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisher Healthcare Tissue-Plus O.C.T. Compound</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>23-730-571</td>
			<td>cryostat embedding medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount-G</td>
			<td>SouthernBiotech</td>
			<td>0100-01</td>
			<td>aqueous based mounting medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FreeZone 4.5</td>
			<td>Labconco</td>
			<td>7751020</td>
			<td>lyophilizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342 Solution (20 mM)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>62249</td>
			<td>blue fluorescent dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>258148-500ML</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IVIS Lumina III</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>CLS136334</td>
			<td>bioluminescence imaging system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimtech Science Kimwipes</td>
			<td>Kimberly Clark</td>
			<td></td>
			<td>delicate task wipes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Propanol (Peroxide-Free/Sequencing), Fisher BioReagents</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1130-500</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oil Red O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>O0625-25G</td>
			<td>1-([4-(Xylylazo)xylyl]azo)-2-naphthol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OPS Diagnostics CryoGrinder</td>
			<td>OPS Diagnostics, LLC</td>
			<td>CG-08-02</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (10X), pH 7.4</td>
			<td>Quality Biological, Inc.</td>
			<td>119-069-151</td>
			<td>Phosphate-buffered saline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pepsin from porcine gastric mucosa</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6887-5G</td>
			<td>pepsin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peracetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>77240-100ML</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin-iFluor 594 Reagent (ab176757)</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab176757</td>
			<td>phalloidin conjugate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propylene glycol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>W294004-1KG-K</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Richard-Allan Scientific Signature Series Bluing Reagent</td>
			<td>Richard-Allan Scientific</td>
			<td>7301L</td>
			<td>bluing agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Richard-Allan Scientific Signature Series Hematoxylin 7211</td>
			<td>Richard-Allan Scientific</td>
			<td>7211</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI Medium 1640</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11875-093</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate, 98%</td>
			<td>Frontier Scientific</td>
			<td>JK559522</td>
			<td>deoxycholic acid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5016</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton x-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100-100ML</td>
			<td>t-Octylphenoxypolyethoxyethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200-056</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman qualitative filter paper, Grade 4</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>1004-110</td>
			<td>grade 4 qualitative filter paper</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylenes (Certified ACS), Fisher Chemical</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>X5-4</td>
			<td>-</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

studying normal tissue radiation effects using extracellular matrix hydrogels

Stråling er en terapi for pasienter med trippel negativ brystkreft. Effekten av stråling på ekstracellulære matrise (ECM) av sunne brystvevet og dens rolle i lokale gjentakelse på den primære tumor området er ukjent. Her presenterer vi en metode for decellularization, lyophilization og fabrikasjon av ECM-hydrogeler avledet fra murine melkefett pads. Resultatene er presentert på effektiviteten av decellularization prosessen, og reologiske parametre ble vurdert. GFP-og luciferase-merket brystkreftceller innkapslet i hydrogeler demonstrerte en økning i spredning i bestrålt hydrogeler. Til slutt, phalloidin bøye farging ble brukt til å visualisere cytoskeleton organisering av innkapslet tumorceller. Vårt mål er å presentere en metode for fabrikere hydrogeler for in vitro studie som etterligner in vivo brystvevet miljø og dens reaksjon på stråling for å studere tumor celle atferd.

MFP-er ble decellularized etter bestråling ved bruk av prosedyren vist i figur 1a. MFP-decellularization (figur 1B) og post-Decellularization (figur 1C) vises. Decellularization ble bekreftet ved hjelp av hematoksylin og eosin (H & E) farging, og 1-([4-(Xylylazo) xylyl] AZO) -2-naphthol farging ble brukt til å evaluere lipid innhold (figur 2). Reologiske egenskaper for ECM-hydrogeler ble også vurdert ved 37 ° c (<stro...

Watch this Scientific Journal Video about Studying Normal Tissue Radiation Effects using Extracellular Matrix Hydrogels at JoVE.com

Studying Normal Tissue Radiation Effects using Extracellular Matrix Hydrogels

Studere normal tissue stråling virkninger benytter ekstracellulære matrise Hydrogeler

Denne protokollen presenterer en metode for decellularization og påfølgende hydrogel dannelse av murine bryst fett pads etter ex vivo bestråling.

Radiation is a therapy for patients with triple negative breast cancer. The effect of radiation on the extracellular matrix (ECM) of healthy breast tissue ...

Denne protokollen viser at stråling påvirker ekstracellulære matriseegenskaper av fettvev i murine mammary fett pad. Tilsetning av stråling i en decellulariseringsmodell har ikke blitt gjort før. Denne teknikken bruker flere vasketrinn som hver tjener et unikt kjemisk formål i decellulariseringsprosessen.Spesifisitet av denne teknikken gjør det mulig for mildere kjemiske vasker, for bedre å bevare vevsegenskaper. Brystkreft tilbakefall oppstår etter terapi, spesielt i trippel negative tilfeller. Evaluering av hvordan den bestrålte ekstracellulære matrisen endrer tumorcelleatferd, vil føre til viktige funn om tilbakefallsmekanismer.Etter bestråling av prøver, ved hjelp av en cesiumkilde, overfører du den bestrålte MFPs og komplette RPMI-medier til et biosikkerhetsskap. Fyll seks centimeter eller 10 centimeter retter med nok medier til å senke MFP-ene. Inkuber ved 37 grader Celsius, med 5% karbondioksid, i to dager.Først plasserer MFP-ene i seks centimeter retter med fem milliliter Trypsin-EDTA-løsning. Spray og tørk oppvasken med 70% etanol og inkuber ved 37 grader Celsius i en time. Bruk 0,7 milliliter siler til å vaske MFP-ene med deionisert vann, ved å helle vann over vevet tre ganger.Bruk tang til å massere vevet manuelt mellom vaskene. Tørk deretter vevet kort på en delikat oppgaveslett og veie det. Legg det tørkede vevet i et forhåndsdisponert beger, som inneholder en passende rørestang i riktig størrelse og dekk vevet med 60 milliliter med 3% t-okylfenoksypolyetoksyetanol per gram vev.Rør i en time ved romtemperatur. Deretter dumper du begerets innhold i en sil. Skyll begeret med deionisert vann og hell dette på vevet.Gjenta denne skylleprosessen to ganger til, og sørg for å bruke tang til å massere vevet manuelt mellom skyllingene. Etter dette tørker du kort vevet på en delikat oppgavesletting og veier. Legg vevet og rørbarene tilbake i de samme begerne og dekk dem med 60 milliliter 4% deoksykolsyre per gram vev.Rør ved romtemperatur i en time. Deretter dumper du begerets innhold i en nettsil, skyllbegeret med deionisert vann og hell dette på vevet. Gjenta denne skylleprosessen to ganger til, og sørg for å bruke tang til å massere vevet manuelt mellom skyllingene.Tørk kort det skyllede vevet på en delikat oppgavesletting og veie det. Legg det tørkede vevet i samme beger, sammen med friskt deionisert vann, supplert med 1% penicillin-streptomycin. Dekk begeret tett med parafinfilm og la det stå på 4 grader Celsius over natten.Neste dag drenere begerinnholdet i en sil, tørk kort vevet på en delikat oppgaveslett og veie det. Deretter plasserer du MFP-ene i samme beger med en passende rørestang i riktig størrelse. Dekk vevet med 60 milliliter av en løsning som inneholder 4% etanol og 0,1% peracetisk syre per gram vev.Rør ved romtemperatur i to timer. Dump begerets innhold i en 0,7 millimeter sil. Bruk tang til å massere vevet manuelt og plassere innholdet tilbake i begeret.Vask vevet ved å dekke det med 60 milliliter 1X PBS per gram vev. Rør ved romtemperatur i 15 minutter. Gjenta hele denne vaskeprosessen en gang til.Deretter dumper du begerets innhold i en 0,7 millimeter sil. Bruk tang, masser vevet manuelt og legg innholdet tilbake i begeret. Vask vevet ved å dekke det med 60 milliliter av deionisert vann per gram vev.Rør ved romtemperatur i 15 minutter. Gjenta hele denne vaskeprosessen en gang til. Tørk kort det vasket vevet på en delikat oppgaveslett og veie det.Dump vevet og innholdet i en sil og bruk tang til å massere vevet manuelt. Legg innholdet tilbake i begeret og dekk vevet med 60 milliliter på 100% n-propanol per gram vev. Rør ved romtemperatur i en time.Tørk deretter kort vevet på en delikat oppgaveslett og veie det. Dump vevet og innholdet i en 0,7 millimeter sil og bruk tang til å massere vevet manuelt. Legg innholdet tilbake i begeret og vask vevet ved å dekke det med 60 milliliter av deionisert vann per gram vev.Rør ved romtemperatur i 15 minutter. Gjenta denne vaskeprosessen tre ganger. Etter dette tørker du kort vevet på en delikat oppgavesletting og veier det.Overfør vevet til et merket 15 milliliter rør og frys ved negative 80 grader Celsius over natten. Fyll først en grunn beholder med flytende nitrogen. Fjern prøvene fra fryseren og vei hver lyofiliserte MFP.Plasser en prøve i mørtelen, bruk en kryogen hanske for å holde mørtelen i det flytende nitrogenet. Deretter bruker du en pestle, festet til en håndholdt drill, for å male prøven. Fres i ett minutt intervaller for å sjekke fremdriften og fjerne hanskehånden fra flytende nitrogen.Gjenta denne freseprosessen for alle prøver, sørg for å sprøyte og tørke mørtelen og plage med etanol mellom hver prøve. Oppbevar de pulveriserte prøvene i 15 milliliter rør ved negative 80 grader Celsius til de er klare til bruk. For å begynne, fjern prøvene fra fryseren og tin ved romtemperatur.Mens prøvene tiner, bland pepsin i saltsyre for å danne en Pepsin-HCL-løsning. Deretter legger du til prøvepulver og Pepsin-HCL-løsningen til et 15 milliliter rør, tilsett en liten rørestang og rør i 48 timer. Etter dette, plasser rørene på is i fem minutter.Legg til 10X PBS i hver prøve, slik at den endelige løsningen har en konsentrasjon på 1X PBS. Deretter legger du til 10 % volum/volum, 0,1 molarnatriumhydroksid i hver løsning, for å nå pH 7.4, ved hjelp av pH-papir for å teste hver løsning individuelt. Bruk en pH 7.4 gelløsning, resuspend pelleted GFP og luciferase merket 4T1 celler til en konsentrasjon på enten 500, 000 eller 1, 000, 000 celler per milliliter gel løsning.Tilsett 16 mikroliter gelcelleoppløsning til hver brønn av en 16-brønns kammersklie og inkuber ved 37 grader Celsius i 30 minutter. Etter dette legger du til 100 mikroliter med komplette RPMI-medier i hver brønn. Fortsett å inkubere ved 37 grader Celsius i 48 timer.Deretter bruker du et fluorescensmikroskop til å observere cellene ved en eksitasjonsbølgelengde på 519 nanometer og en utslippsbølgelengde på 618 nanometer. I denne studien studeres normale vevsstrålingseffekter ved hjelp av ekstracellulære matrisehydrogeler. Hematoksylin og eosinfarging brukes til å bekrefte decellularisering, gjennom tap av kjerner og andre spor av DNA.Mens Olje Rød O farging brukes til å evaluere lipid innhold og bekrefte oppbevaring av en dipasite morfologi. De revologiske egenskapene til ECM-hydrogelene vurderes ved 37 grader Celsius. Lagringsmodulen er høyere enn tapsmodulen for alle forhold, noe som viser stabil hydrogeldannelse.GFP og luciferase merket 4T1 brystkarsinomceller innkapslet deretter i hydrogelene. Cellespredning undersøkes av fluorescensmikroskopi, ved illuminescensmålinger og levedyktighetsfarging, 48 timer etter innkapsling. Bestrålte hydrogeler viser en økende trend i tumorcellespredning.Falloidin konjugat brukes til å visualisere F-Actin i innkapslede celler. Husk å kjøle mørtelen før du plasserer vevet inne i møllen, en varm mørtel kan føre til ufullstendig fresing. Vær forsiktig når du håndterer n-propanal og pepsin, bare åpne n-propanal og andre decellulariseringsmidler under en kjemisk hette.Hvis mulig, veie pepsin under en kjemisk hette, da det er fare for innånding. ECM-sammensetningsendringer etter bestråling og decellularisering kan evalueres ved hjelp av massespektrometri og Raman-spektroskopi. I tillegg kan fiberstrukturen til ECM-hydrogelene analyseres ved å skanne elektronmikroskopi.Denne metoden har potensial til å bli utvidet til å undersøke effekten av stråling på, ikke bare tumorceller, men også immunceller, samt vev som opplever strålingsskader, som følge av terapi. Denne decellulariseringsteknikken vil tillate forskere å evaluere de ekstracellulære matriseegenskapene til vevet etter stråling, noe som er et viktig behandlingsalternativ hos de fleste kreftformer.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Analyzing the Communication Between Monocytes and Primary Breast Cancer Cells in an Extracellular Matrix Extract (ECME)-based Three-dimensional System

Analyzing the Communication Between Monocytes and Primary Breast Cancer Cells in an Extracellular Matrix Extract ECME-based Three-dimensional System

Analysere kommunikasjonen mellom monocytter og primære brystkreft celler i en ekstracellulær Matrix ekstrakt (ECME)-basert tredimensjonale System

Embedded in the extracellular matrix (ECM), normal and neoplastic epithelial cells intimately communicate with hematopoietic and non-hematopoietic cells, ...

PET and MRI Guided Irradiation of a Glioblastoma Rat Model Using a Micro-irradiator

PET og MRI guidet bestråling av en Glioblastoma rotte modell med en mikro-irradiator

For decades, small animal radiation research was mostly performed using fairly crude experimental setups applying simple single-beam techniques without ...

Imaging Approaches to Assessments of Toxicological Oxidative Stress Using Genetically-encoded Fluorogenic Sensors

Imaging tilnærminger til vurderinger av toksikologiske oksidativt Stress bruker genetisk kodet Fluorogenic sensorer

While oxidative stress is a commonly cited toxicological mechanism, conventional methods to study it suffer from a number of shortcomings, including ...

Fabrication of Tongue Extracellular Matrix and Reconstitution of Tongue Squamous Cell Carcinoma In Vitro

Fabrication of Tongue Extracellular Matrix and Reconstitution of Tongue Squamous Cell Carcinoma In Vitro

Fabrikasjon av tungen ekstracellulær Matrix og rekonstituering tungen Squamous celle Carcinoma In Vitro

In order to construct an effective and realistic model for tongue squamous cell carcinoma (TSCC) in vitro, the methods were created to produce ...

Extraction of Extracellular Vesicles from Whole Tissue

Utvinning av ekstracellulære blemmer fra hele vev

Circulating and interstitial small membrane-bound extracellular vesicles (EVs) represent promising targets for the development of novel diagnostic or ...

Three-Dimensional Bone Extracellular Matrix Model for Osteosarcoma

Tredimensjonale bein ekstracellulær Matrix modell for Osteosarcoma

Osteosarcoma (OS) is the most common and a highly aggressive primary bone tumor. It is characterized with anatomic and histologic variations along with ...

Cell Cycle-specific Measurement of &#947;H2AX and Apoptosis After Genotoxic Stress by Flow Cytometry

Cell Cycle-specific Measurement of ÃƒÅ½Ã‚Â³H2AX and Apoptosis After Genotoxic Stress by Flow Cytometry

Celle syklus-spesifikk måling av γH2AX og apoptose etter gentoksisk stress av Flow flowcytometri

The presented method or slightly modified versions have been devised to study specific treatment responses and side effects of various anti-cancer ...

Characterization of the Effects of Migrastatic Inhibitors on 3D Tumor Spheroid Invasion by High-resolution Confocal Microscopy

Karakterisering av effekter av Migrastatic hemmere på 3D tumor spheroid Invasion av høy oppløsning Konfokalmikroskopi mikroskopi

Drug discovery and development in cancer research is increasingly being based on drug screens in a 3D format. Novel inhibitors targeting the migratory and ...

Studying Triple Negative Breast Cancer Using Orthotopic Breast Cancer Model

Studere trippel negativ brystkreft ved hjelp ortotopisk brystkreft modell

Triple-negative breast cancer (TNBC) is an aggressive breast cancer subtype with limited therapeutic options. When compared to patients with less ...

Studying the Effects of Tumor-Secreted Paracrine Ligands on Macrophage Activation using Co-Culture with Permeable Membrane Supports

Studere effekter av tumor-utskilt paracrine ligander på macrophage aktivisering bruker co-kultur med gjennomtrengelig membran støtter

Tumor-derived paracrine signaling is an overlooked component of local immunosuppression and can lead to a permissive environment for continued cancer ...