Name: studying normal tissue radiation effects using extracellular matrix hydrogels
Uploaded: 2019-07-24T13:00:00
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Os autores agradecem ao Dr. Laura L. Bronsart por fornecer as células GFP-e luciferase-4T1, Dr. Edward l. lagory para o Conselho em 1-([4-(xylylazo) xylyl] azo)-2-naphthol que mancha, Dr. Craig L. Duvall para ivis e uso do Liofilizador, e Dr. Scott A. guelcher para o Reômetro Usar. Esta pesquisa foi apoiada financeiramente pela concessão de NIH #R00CA201304.

Os estudos em animais foram realizados de acordo com as diretrizes e protocolos institucionais aprovados pelo Comitê institucional de cuidados e uso de animais da Universidade Vanderbilt.
1. preparação e irradiação ex vivo de MFPs
<ol><li>Sacrifique camundongos de nu/nu camundongos (8 – 10 semanas) usando o asfixia do co2 seguido pela deslocação cervical.</li>
	<li>Limpe a pele usando 70% de etanol.</li>
	<li>Colete almofadas de gordura mamárias (MFPs) de camundongos sac...

<ol>
	<li>Hanahan, D., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+hallmarks+of+cancer.">The hallmarks of cancer.</a> Cell. 100 (1), 57-70 (2000).</li><li>Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+statistics,+2018.">Cancer statistics, 2018.</a> CA: A Cancer Journal for Clinicians. 68 (1), 7-30 (2018).</li><li>Lowery, A. J., Kell, M. R., Glynn, R. W., Kerin, M. J., Sweeney, K. 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E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages+Promote+Circulating+Tumor+Cell-Mediated+Local+Recurrence+Following+Radiation+Therapy+in+Immunosuppressed+Patients.">Macrophages Promote Circulating Tumor Cell-Mediated Local Recurrence Following Radiation Therapy in Immunosuppressed Patients.</a> Cancer Res. 75 (15), 4241-4252 (2018).</li><li>Haubner, F., Ohmann, E., Pohl, F., Strutz, J., Gassner, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wound+healing+after+radiation+therapy:+Review+of+the+literature.">Wound healing after radiation therapy: Review of the literature.</a> Radiation Oncology. 7 (1), 1-9 (2012).</li><li>Beachley, V. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+matrix+arrays+for+high+throughput+screening+and+systems+analysis+of+cell+function.">Tissue matrix arrays for high throughput screening and systems analysis of cell function.</a> Nature Methods. 12 (12), 1197-1204 (2015).</li><li>Tian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ-specific+metastases+obtained+by+culturing+colorectal+cancer+cells+on+tissue-specific+decellularized+scaffolds.">Organ-specific metastases obtained by culturing colorectal cancer cells on tissue-specific decellularized scaffolds.</a> Nature Biomedical Engineering. 2 (6), 443-452 (2018).</li><li>Saldin, L. T., Cramer, M. C., Velankar, S. S., White, L. J., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix+hydrogels+from+decellularized+tissues:+Structure+and+function.">Extracellular matrix hydrogels from decellularized tissues: Structure and function.</a> Acta Biomaterialia. 49, 1-15 (2017).</li><li>Hinderer, S., Layland, S. L., Schenke-Layland, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ECM+and+ECM-like+materials+&#8212;+Biomaterials+for+applications+in+regenerative+medicine+and+cancer+therapy.">ECM and ECM-like materials &#8212; Biomaterials for applications in regenerative medicine and cancer therapy.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 97, 260-269 (2016).</li><li>Young, D. A., Ibrahim, D. O., Hu, D., Christman, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Injectable+hydrogel+scaffold+from+decellularized+human+lipoaspirate.">Injectable hydrogel scaffold from decellularized human lipoaspirate.</a> Acta Biomaterialia. 7 (3), 1040-1049 (2011).</li><li>Singelyn, J. M., Christman, K. L., Littlefield, R. B., Schup-Magoffin, P. J., DeQuach, J. A., Seif-Naraghi, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Naturally+derived+myocardial+matrix+as+an+injectable+scaffold+for+cardiac+tissue+engineering.">Naturally derived myocardial matrix as an injectable scaffold for cardiac tissue engineering.</a> Biomaterials. 30 (29), 5409-5416 (2009).</li><li>Pouliot, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+characterization+of+a+naturally+derived+lung+extracellular+matrix+hydrogel.">Development and characterization of a naturally derived lung extracellular matrix hydrogel.</a> Journal of Biomedical Materials Research Part A. 104 (8), 1922-1935 (2016).</li><li>Bonvillain, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Nonhuman+Primate+Model+of+Lung+Regeneration:+Detergent-Mediated+Decellularization+and+Initial+In+Vitro+Recellularization+with+Mesenchymal+Stem+Cells.">A Nonhuman Primate Model of Lung Regeneration: Detergent-Mediated Decellularization and Initial In Vitro Recellularization with Mesenchymal Stem Cells.</a> Tissue Engineering Part A. 18 (23-24), 2437-2452 (2012).</li><li>Brown, B. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+Three+Methods+for+the+Derivation+of+a+Biologic+Scaffold+Composed+of+Adipose+Tissue+Extracellular+Matrix.">Comparison of Three Methods for the Derivation of a Biologic Scaffold Composed of Adipose Tissue Extracellular Matrix.</a> Tissue Engineering Part C: Methods. 17 (4), 411-421 (2011).</li><li>Link, P. A., Pouliot, R. A., Mikhaiel, N. S., Young, B. M., Heise, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tunable+Hydrogels+from+Pulmonary+Extracellular+Matrix+for+3D+Cell+Culture.">Tunable Hydrogels from Pulmonary Extracellular Matrix for 3D Cell Culture.</a> Journal of Visualized Experiments. (119), 1-9 (2017).</li><li>Massensini, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concentration-dependent+rheological+properties+of+ECM+hydrogel+for+intracerebral+delivery+to+a+stroke+cavity.">Concentration-dependent rheological properties of ECM hydrogel for intracerebral delivery to a stroke cavity.</a> Acta Biomaterialia. 27, 116-130 (2015).</li><li>Mierke, C. T., Frey, B., Fellner, M., Herrmann, M., Fabry, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin+5+1+facilitates+cancer+cell+invasion+through+enhanced+contractile+forces.">Integrin 5 1 facilitates cancer cell invasion through enhanced contractile forces.</a> Journal of Cell Science. 124 (3), 369-383 (2011).</li><li>Ahmadzadeh, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+the+two-way+feedback+between+contractility+and+matrix+realignment+reveals+a+nonlinear+mode+of+cancer+cell+invasion.">Modeling the two-way feedback between contractility and matrix realignment reveals a nonlinear mode of cancer cell invasion.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (9), E1617-E1626 (2017).</li></ol>

Este método de formação de hidrogel é em grande parte dependente da quantidade de tecido inicial. Os MFPs murinos são pequenos, e o processo de descelularização resulta em uma redução significativa do material (tabela 1). O processo pode ser repetido com mais MFPs para aumentar o rendimento final. O fresamento é outro passo importante que pode levar à perda de material. Outros mostraram sucesso com um moinho criogênico, mas este protocolo é baseado na moagem através de uma argamassa de mão...

O câncer é caracterizado por excesso de proliferação de células que podem evadir a apoptose e também metastasizar para locais distantes1. O câncer de mama é uma das formas mais comuns entre as fêmeas nos EUA, com uma estimativa de 266.000 novos casos e 40.000 mortes em 20182. Um subtipo particularmente agressivo e difícil de tratar é o cancro da mama triplo negativo (TNBC), que carece de receptor de estrogênio (ER), receptor de progesterona (RP), e fator de crescimento epidérmico humano (HER2). A radioterapia é comumente usada no câncer de mama para eliminar células tumorais residuais após a lumpectomia, mas mais de 13% dos pacientes com TNBC ainda experimentam recidiva no sítio primário do tumor3.
Sabe-se que a radioterapia é efetiva na mitigação da metástase e recorrência, pois a combinação de lumpectomia e radiação resulta na mesma sobrevida em longo prazo que a mastectomia4. Entretanto, tem-se mostrado recentemente que o tratamento de radiação é associado com o retorno local ao local preliminar do tumor em ajustes imunocomprometidos5,6. Além disso, é bem sabido que a radiação modifica a matriz extracelular (ECM) do tecido normal induzindo fibrose7. Conseqüentemente, é importante compreender o papel de mudanças radiação-induzidas do ECM em diating o comportamento da pilha do tumor.
Os tecidos decelularizados têm sido utilizados como modelos in vitro para o estudo da doença8,9. Estes tecidos decelularizados preservam a composição do ECM e recapitulam o complexo ECM in vivo. Este ECM descelularizados do tecido pode mais ser processado e digerido para dar forma a hidrogéis reconstituídos do ECM que podem ser usados para estudar o crescimento da pilha e a função10,11. Por exemplo, os hidrogéis injetáveis derivados do lipoaspirado humano decelularizado e do tecido miocárdico serviram como métodos não invasivos de engenharia tecidual, e um hidrogel derivado do tecido pulmonar porcino foi utilizado como método in vitro de teste fixação e viabilidade de células-tronco mesenquimais12,13,14. O efeito de dano normal da radiação do tecido em Propriedades do ECM, entretanto, não foi investigado.
Os hidrogéis derivados do ECM têm o maior potencial para o estudo in vitro de fenômenos in vivo. Vários outros materiais foram estudados, incluindo colágeno, fibrina e matrigel, mas é difícil recapitular sinteticamente a composição do ECM13. Uma vantagem do uso de hidrogéis derivados de ECM é que o ECM contém as proteínas e fatores de crescimento necessários para um determinado tecido14,15. A irradiação do tecido normal durante lumpectomy causa mudanças significativas ao ECM, e os hidrogéis ECM-derivados podem ser usados para estudar este efeito in vitro. Este método poderia conduzir a uns modelos in vitro mais complexos e mais exatos da doença.
Neste estudo, nós sujeitamos almofadas gordas mamária murino (MFPs) à radiação ex vivo. Os MFPs foram descelularizados e feito na solução do pre-gel. Os hydrogels foram dados forma com as pilhas 4T1 encaixadas, uma linha celular murino de TNBC. As propriedades reológicas do material do hidrogel foram examinadas, e a dinâmica da pilha do tumor foi avaliada dentro dos hydrogels. Hidrogéis fabricados a partir de MFPs irradiados reforçada proliferação de células tumorais. Os estudos futuros incorporarão outros tipos da pilha para estudar interações da pilha-pilha no contexto do retorno do cancro depois da terapia.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>10% Neutral Buffered Formalin, Cube with Spigot</td>
			<td>VWR</td>
			<td>16004-128</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-methylbutane</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>19387</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AR 2000ex Rheometer</td>
			<td>TA Instruments</td>
			<td>10D4335</td>
			<td>rheometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A1933-25G</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>calcein acetoxymethyl (calcein AM)</td>
			<td>Molecular Probes, Inc.</td>
			<td>C1430</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Luciferin Firefly, potassium salt</td>
			<td>Biosynth Chemistry &#38; Biology</td>
			<td>L-8820</td>
			<td>(S)-4,5-Dihydro-2-(6-hydroxy-2-benzothiazolyl)-4-thiazolecarboxylic acid potassium salt</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPX Mountant for Histology</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>06522-500ML</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate-buffered saline</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14040133</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin-Y with Phloxine</td>
			<td>Richard-Allan Scientific</td>
			<td>71304</td>
			<td>eosin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ethidium homodimer</td>
			<td>Molecular Probes, Inc.</td>
			<td>E1169</td>
			<td>ethidium homodimer-1 (EthD-1)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F0926-500ML</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisher Healthcare Tissue-Plus O.C.T. Compound</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>23-730-571</td>
			<td>cryostat embedding medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount-G</td>
			<td>SouthernBiotech</td>
			<td>0100-01</td>
			<td>aqueous based mounting medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FreeZone 4.5</td>
			<td>Labconco</td>
			<td>7751020</td>
			<td>lyophilizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342 Solution (20 mM)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>62249</td>
			<td>blue fluorescent dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>258148-500ML</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IVIS Lumina III</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>CLS136334</td>
			<td>bioluminescence imaging system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimtech Science Kimwipes</td>
			<td>Kimberly Clark</td>
			<td></td>
			<td>delicate task wipes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Propanol (Peroxide-Free/Sequencing), Fisher BioReagents</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1130-500</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oil Red O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>O0625-25G</td>
			<td>1-([4-(Xylylazo)xylyl]azo)-2-naphthol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OPS Diagnostics CryoGrinder</td>
			<td>OPS Diagnostics, LLC</td>
			<td>CG-08-02</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (10X), pH 7.4</td>
			<td>Quality Biological, Inc.</td>
			<td>119-069-151</td>
			<td>Phosphate-buffered saline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pepsin from porcine gastric mucosa</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6887-5G</td>
			<td>pepsin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peracetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>77240-100ML</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin-iFluor 594 Reagent (ab176757)</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab176757</td>
			<td>phalloidin conjugate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propylene glycol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>W294004-1KG-K</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Richard-Allan Scientific Signature Series Bluing Reagent</td>
			<td>Richard-Allan Scientific</td>
			<td>7301L</td>
			<td>bluing agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Richard-Allan Scientific Signature Series Hematoxylin 7211</td>
			<td>Richard-Allan Scientific</td>
			<td>7211</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI Medium 1640</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11875-093</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate, 98%</td>
			<td>Frontier Scientific</td>
			<td>JK559522</td>
			<td>deoxycholic acid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5016</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton x-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100-100ML</td>
			<td>t-Octylphenoxypolyethoxyethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200-056</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman qualitative filter paper, Grade 4</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>1004-110</td>
			<td>grade 4 qualitative filter paper</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylenes (Certified ACS), Fisher Chemical</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>X5-4</td>
			<td>-</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

studying normal tissue radiation effects using extracellular matrix hydrogels

A radiação é uma terapia para pacientes com câncer de mama triplo negativo. O efeito da radiação na matriz extracelular (ECM) do tecido saudável do peito e de seu papel no retorno local no local preliminar do tumor é desconhecido. Aqui nós apresentamos um método para o decellularization, o lyophilization, e a fabricação de hidrogéis do ECM derivados das almofadas gordas mamária murino. Os resultados são apresentados sobre a efetividade do processo de descelularização, e os parâmetros reológicos foram avaliados. As células de câncer de mama com rótulo de GFP e luciferase encapsuladas nos hidrogéis demonstraram um aumento na proliferação de hidrogéis irradiados. Finalmente, a mancha do conjugado do faloidina foi empregada para visualizar a organização do citoesqueleto de pilhas encapsuladas do tumor. Nosso objetivo é apresentar um método para fabricar hidrogéis para estudo in vitro que imitam o ambiente do tecido mamário in vivo e sua resposta à radiação, a fim de estudar o comportamento das células tumorais.

Os MFPs foram descelularizados depois da irradiação usando o procedimento mostrado na Figura 1a. As MFPs pré-descelularizadas (Figura 1b) e pós-descelularização (Figura 1C) são mostradas. A descelularização foi confirmada com coloração de hematoxilina e eosina (H & E), e a coloração de 1-([4-(Xylylazo) xylyl] azo)-2-naftol foi utilizada para avaliar o teor lipídico (Figura,2). As propriedades reológicas dos...

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Studying Normal Tissue Radiation Effects using Extracellular Matrix Hydrogels

Estudando efeitos de radiação tecidual normais usando Hydrogels de matriz extracelular

Este protocolo apresenta um método para a decelularização e a formação subseqüente do hidrogel de almofadas gordas mamária murino que seguem a irradiação ex vivo.

Radiation is a therapy for patients with triple negative breast cancer. The effect of radiation on the extracellular matrix (ECM) of healthy breast tissue ...

Este protocolo mostra que a radiação influencia as propriedades da matriz extracelular do tecido adiposo na almofada de gordura mamária murina. A adição de radiação em um modelo de descelularização não foi feita antes. Esta técnica utiliza várias etapas de lavagem que cada uma serve a um propósito químico único no processo de descelularização.A especificidade desta técnica permite lavagens químicas mais suaves, para preservar melhor as propriedades teciduais. A recaída do câncer de mama ocorre após a terapia, especialmente em casos triplos negativos. Avaliar como a matriz extracelular irradiada altera o comportamento das células tumorais levará a descobertas importantes sobre mecanismos de recorrência.Depois de irradiar amostras, usando uma fonte de césio, transfira a mídia de MFP irradiada e a mídia RPMI completa para um armário de biossegurança. Encha pratos de seis centímetros ou 10 centímetros com mídia suficiente para submergir os MFP's. Incubar a 37 graus Celsius, com 5% de dióxido de carbono, por dois dias.Primeiro, coloque os MFP's em pratos de seis centímetros com cinco mililitros de solução Trypsin-EDTA. Pulverize e limpe os pratos com 70% de etanol e incubar a 37 graus Celsius por uma hora. Use 0,7 mililitros para lavar os MFP's com água desionizada, derramando água sobre o tecido três vezes.Use fórceps para massagear manualmente o tecido entre as lavagens. Em seguida, seque brevemente o tecido em uma tarefa delicada limpe e pese-o. Coloque os tecidos secos em um béquer pré-autoclaved, contendo uma barra de agitação de tamanho apropriado e cubra os tecidos com 60 mililitros de 3%t-octylphenoxypolyethoxyetanol por grama de tecido.Mexa por uma hora em temperatura ambiente. Em seguida, despeje o conteúdo do béquer em um coador. Enxágüe o béquer com água deionizada e despeje isso nos tecidos.Repita este processo de lavagem mais duas vezes, certificando-se de usar fórceps para massagear manualmente o tecido entre as enxágues. Depois disso, seque brevemente o tecido em uma tarefa delicada limpe e pese. Coloque os tecidos e as barras de mexida de volta nos mesmos béquers e cubra-os com 60 mililitros de ácido desoxicólico de 4% por grama de tecido.Mexa em temperatura ambiente por uma hora. Em seguida, despeje o conteúdo do béquer em um coador de malha, enxágue o béquer com água deionizada e despeje isso nos tecidos. Repita este processo de lavagem mais duas vezes, certificando-se de usar fórceps para massagear manualmente o tecido entre as enxágues.Seque brevemente o tecido enxaguado em uma tarefa delicada limpe e pese-o. Coloque os tecidos secos no mesmo béquer, juntamente com água deionizada fresca, suplementada com 1%penicilina-estreptomicina. Cubra o béquer firmemente com filme de parafina e saia a 4 graus Celsius durante a noite.No dia seguinte, drene o conteúdo do béquer em um coador, seque brevemente o tecido em uma delicada limpeza de tarefas e pese-o. Em seguida, coloque o MFP no mesmo béquer com uma barra de mexida de tamanho apropriado. Cubra o tecido com 60 mililitros de uma solução contendo 4% de etanol e 0,1% de ácido peracético por grama de tecido.Mexa em temperatura ambiente por duas horas. Despeje o conteúdo do béquer em um coador de 0,7 milímetros. Use fórceps para massagear manualmente o tecido e colocar o conteúdo de volta no béquer.Lave o tecido cobrindo-o com 60 mililitros de 1X PBS por grama de tecido. Mexa em temperatura ambiente por 15 minutos. Repita todo esse processo de lavagem mais uma vez.Em seguida, despeje o conteúdo do béquer em um coador de 0,7 milímetros. Usando fórceps, massageie manualmente o tecido e coloque o conteúdo de volta no béquer. Lave o tecido cobrindo-o com 60 mililitros de água deionizada por grama de tecido.Mexa em temperatura ambiente por 15 minutos. Repita todo esse processo de lavagem mais uma vez. Seque brevemente o tecido lavado em uma tarefa delicada limpe e pese-o.Despeje o tecido e o conteúdo em um coador e use fórceps para massagear manualmente o tecido. Coloque o conteúdo de volta no béquer e cubra os tecidos com 60 mililitros de 100% n-propanol por grama de tecido. Mexa em temperatura ambiente por uma hora.Em seguida, seque brevemente o tecido em uma tarefa delicada limpe e pese-o. Despeje o tecido e o conteúdo em um coador de 0,7 milímetros e use fórceps para massagear manualmente o tecido. Coloque o conteúdo de volta no béquer e lave o tecido cobrindo-o com 60 mililitros de água deionizada por grama de tecido.Mexa em temperatura ambiente por 15 minutos. Repita este processo de lavagem três vezes. Depois disso, seque brevemente o tecido em uma tarefa delicada limpe e pese-o.Transfira o tecido para um tubo de 15 mililitros rotulado e congele a 80 graus Celsius negativos durante a noite. Primeiro, encha um recipiente raso com nitrogênio líquido. Retire as amostras do congelador e pese cada MFP liofilizado.Coloque uma amostra na argamassa, use uma luva criogênica para segurar a argamassa no nitrogênio líquido. Em seguida, use um pilão, preso a uma broca portátil, para moer a amostra. Moer em intervalos de um minuto para verificar o progresso e remover a mão enluvada do nitrogênio líquido.Repita este processo de moagem para todas as amostras, certificando-se de pulverizar e limpar a argamassa e pilão com etanol entre cada amostra. Armazene as amostras em pó em tubos de 15 mililitros a 80 graus Celsius negativos até estar pronto para usar. Para começar, retire as amostras do congelador e descongele à temperatura ambiente.Enquanto as amostras estão descongelando, misture a pepsina em ácido clorídrico para formar uma solução Pepsin-HCL. Em seguida, adicione pó de amostra e a solução Pepsin-HCL a um tubo de 15 mililitros, adicione uma pequena barra de mexiça e mexa por 48 horas. Depois disso, coloque os tubos no gelo por cinco minutos.Adicione 10X PBS a cada amostra, de tal forma que a solução final tenha uma concentração de 1X PBS. Em seguida, adicione 10% de volume/volume, 0,1 hidróxido de sódio molar a cada solução, para atingir o pH 7.4, utilizando papel pH para testar cada solução individualmente. Utilizando uma solução de pH 7.4 gel, resuspenque as células GFP e luciferase de pelotas rotuladas 4T1 a uma concentração de 500, 000 ou 1.000.000 células por mililitro de solução de gel.Adicione 16 microliters de solução de célula de gel a cada poço de um escorregador de câmara de 16 poços e incubar a 37 graus Celsius por 30 minutos. Depois disso, adicione 100 microliters de mídia RPMI completa a cada poço. Continue incubando a 37 graus Celsius por 48 horas.Em seguida, use um microscópio de fluorescência para observar as células em um comprimento de onda de excitação de 519 nanômetros e um comprimento de onda de emissão de 618 nanômetros. Neste estudo, são estudados efeitos normais da radiação tecidual, utilizando hidrogéis de matriz extracelular. A hematoxilina e a coloração de eosina são usadas para confirmar a descelularização, através da perda de núcleos e outros traços de DNA.Enquanto a coloração de Óleo Vermelho O é usada para avaliar o conteúdo lipídudo e confirmar a retenção de uma morfologia de dipasite. As propriedades reológicas dos hidrogéis ECM são avaliadas a 37 graus Celsius. O módulo de armazenamento é maior do que o módulo de perda para todas as condições, demonstrando formação estável de hidrogel.GFP e luciferase rotuladas 4T1 células de carcinoma mamário são então encapsuladas nos hidrogéis. A proliferação celular é examinada por microscopia de fluorescência, por medições de illuminescência e coloração de viabilidade, 48 horas após o encapsulamento. Hidrogéis irradiados mostram uma tendência crescente de proliferação de células tumorais.O conjugado de falo é usado para visualizar F-Actin nas células encapsuladas. Lembre-se de esfriar a argamassa antes de colocar o tecido dentro do moinho, uma argamassa quente pode levar a moagem incompleta. Tenha cuidado ao manusear n-propanal e pepsina, apenas aberto n-propanal e outros agentes descelularizantes sob uma capa química.Se possível, pese a pepsina sob uma capa química, pois há perigo de inalação. Alterações na composição do ECM após a irradiação e descelularização podem ser avaliadas utilizando espectrometria de massa e espectroscopia de Raman. Além disso, a estrutura de fibra dos hidrogéis ECM pode ser analisada por meio da microscopia eletrônica de varredura.Este método tem o potencial de ser expandido para examinar os efeitos da radiação, não apenas células tumorais, mas também células imunes, bem como tecidos que sofrem danos causados pela radiação, como resultado da terapia. Essa técnica de descelularização permitirá aos pesquisadores avaliar as propriedades da matriz extracelular do tecido após a radiação, que é uma importante opção de tratamento na maioria dos cânceres.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Analyzing the Communication Between Monocytes and Primary Breast Cancer Cells in an Extracellular Matrix Extract (ECME)-based Three-dimensional System

Analyzing the Communication Between Monocytes and Primary Breast Cancer Cells in an Extracellular Matrix Extract ECME-based Three-dimensional System

Analisando a comunicação entre monócitos e células de câncer primário da mama em uma matriz Extracellular extrair (ECME)-sistema tridimensional baseado em

Embedded in the extracellular matrix (ECM), normal and neoplastic epithelial cells intimately communicate with hematopoietic and non-hematopoietic cells, ...

Pesquisa do câncer

PET and MRI Guided Irradiation of a Glioblastoma Rat Model Using a Micro-irradiator

PET e MRI guiada irradiação de um modelo do rato de Glioblastoma usando um Microdifusora

For decades, small animal radiation research was mostly performed using fairly crude experimental setups applying simple single-beam techniques without ...

Imaging Approaches to Assessments of Toxicological Oxidative Stress Using Genetically-encoded Fluorogenic Sensors

Abordagens para avaliação de estresse oxidativo toxicológico usando sensores Fluorogenic geneticamente codificado de imagem

While oxidative stress is a commonly cited toxicological mechanism, conventional methods to study it suffer from a number of shortcomings, including ...

Fabrication of Tongue Extracellular Matrix and Reconstitution of Tongue Squamous Cell Carcinoma In Vitro

Fabrication of Tongue Extracellular Matrix and Reconstitution of Tongue Squamous Cell Carcinoma In Vitro

Fabricação de língua matriz extracelular e reconstituição da língua Carcinoma de células escamosas In Vitro

In order to construct an effective and realistic model for tongue squamous cell carcinoma (TSCC) in vitro, the methods were created to produce ...

Extraction of Extracellular Vesicles from Whole Tissue

Extração de vesículas extracelulares de todo tecido

Circulating and interstitial small membrane-bound extracellular vesicles (EVs) represent promising targets for the development of novel diagnostic or ...

Three-Dimensional Bone Extracellular Matrix Model for Osteosarcoma

Modelo de matriz extracelular óssea tridimensional para osteossarcoma

Osteosarcoma (OS) is the most common and a highly aggressive primary bone tumor. It is characterized with anatomic and histologic variations along with ...

Cell Cycle-specific Measurement of &#947;H2AX and Apoptosis After Genotoxic Stress by Flow Cytometry

Cell Cycle-specific Measurement of ÃƒÅ½Ã‚Â³H2AX and Apoptosis After Genotoxic Stress by Flow Cytometry

Medição específica do ciclo celular de γH2AX e apoptose após estresse genotóxico por citometria de fluxo

The presented method or slightly modified versions have been devised to study specific treatment responses and side effects of various anti-cancer ...

Characterization of the Effects of Migrastatic Inhibitors on 3D Tumor Spheroid Invasion by High-resolution Confocal Microscopy

Caracterização dos efeitos de inibidores de Migrastatic na invasão do spheroid do tumor 3D pela microscopia confocal de alta resolução

Drug discovery and development in cancer research is increasingly being based on drug screens in a 3D format. Novel inhibitors targeting the migratory and ...

Studying Triple Negative Breast Cancer Using Orthotopic Breast Cancer Model

Estudando o câncer de mama triplo negativo usando modelo de câncer de mama ortotópico

Triple-negative breast cancer (TNBC) is an aggressive breast cancer subtype with limited therapeutic options. When compared to patients with less ...

Studying the Effects of Tumor-Secreted Paracrine Ligands on Macrophage Activation using Co-Culture with Permeable Membrane Supports

Estudando os efeitos dos ligantes paracrinos tumorais na ativação do macrófago usando a co-cultura com suportes permeáveis da membrana

Tumor-derived paracrine signaling is an overlooked component of local immunosuppression and can lead to a permissive environment for continued cancer ...