Name: studying normal tissue radiation effects using extracellular matrix hydrogels
Uploaded: 2019-07-24T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Studying Normal Tissue Radiation Effects using Extracellular Matrix Hydrogels at JoVE.com

Авторы благодарят д-р Лаура Л. Бронсарт для предоставления GFP- и luciferase-4T1 клетки, д-р Эдвард Л. Лагори за советом по 1 -(No 4-(Xylylazo)xylyl'azo)-2-нафталь окрашивания, д-р Крейг Л. Дюваль для IVIS и лиофилизатор использования, и д-р Скотт Гюль Использовать. Это исследование было финансово поддержано грантом NIH #R00CA201304.

Исследования на животных проводились в соответствии с институциональными руководящими принципами и протоколами, утвержденными Комитетом по институциональному уходу и использованию животных Университета Вандербильта.
1. Подготовка и ex vivo облучение MFPs
<ol><li>Пожертвова?...

<ol>
	<li>Hanahan, D., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+hallmarks+of+cancer.">The hallmarks of cancer.</a> Cell. 100 (1), 57-70 (2000).</li><li>Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+statistics,+2018.">Cancer statistics, 2018.</a> CA: A Cancer Journal for Clinicians. 68 (1), 7-30 (2018).</li><li>Lowery, A. J., Kell, M. R., Glynn, R. W., Kerin, M. J., Sweeney, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Locoregional+recurrence+after+breast+cancer+surgery:+a+systematic+review+by+receptor+phenotype.">Locoregional recurrence after breast cancer surgery: a systematic review by receptor phenotype.</a> Breast Cancer Research and Treatment. 133 (3), 831-841 (2012).</li><li>Miller, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+treatment+and+survivorship+statistics,+2016.">Cancer treatment and survivorship statistics, 2016.</a> CA: A Cancer Journal for Clinicians. 66 (4), 271-289 (2016).</li><li>Vilalta, M., Rafat, M., Giaccia, A. J., Graves, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recruitment+of+Circulating+Breast+Cancer+Cells+Is+Stimulated+by+Radiotherapy.">Recruitment of Circulating Breast Cancer Cells Is Stimulated by Radiotherapy.</a> Cell Reports. 8 (2), 402-409 (2014).</li><li>Rafat, M., Aguilera, T. A., Vilalta, M., Bronsart, L. L., Soto, L. A., von Eyben, R., Golla, M. A., Ahrari, Y., Melemenidis, S., Afghahi, A., Jenkins, M. J., Kurian, A. W., Horst, K. C., Giaccia, A. J., Graves, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages+Promote+Circulating+Tumor+Cell-Mediated+Local+Recurrence+Following+Radiation+Therapy+in+Immunosuppressed+Patients.">Macrophages Promote Circulating Tumor Cell-Mediated Local Recurrence Following Radiation Therapy in Immunosuppressed Patients.</a> Cancer Res. 75 (15), 4241-4252 (2018).</li><li>Haubner, F., Ohmann, E., Pohl, F., Strutz, J., Gassner, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wound+healing+after+radiation+therapy:+Review+of+the+literature.">Wound healing after radiation therapy: Review of the literature.</a> Radiation Oncology. 7 (1), 1-9 (2012).</li><li>Beachley, V. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+matrix+arrays+for+high+throughput+screening+and+systems+analysis+of+cell+function.">Tissue matrix arrays for high throughput screening and systems analysis of cell function.</a> Nature Methods. 12 (12), 1197-1204 (2015).</li><li>Tian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ-specific+metastases+obtained+by+culturing+colorectal+cancer+cells+on+tissue-specific+decellularized+scaffolds.">Organ-specific metastases obtained by culturing colorectal cancer cells on tissue-specific decellularized scaffolds.</a> Nature Biomedical Engineering. 2 (6), 443-452 (2018).</li><li>Saldin, L. T., Cramer, M. C., Velankar, S. S., White, L. J., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix+hydrogels+from+decellularized+tissues:+Structure+and+function.">Extracellular matrix hydrogels from decellularized tissues: Structure and function.</a> Acta Biomaterialia. 49, 1-15 (2017).</li><li>Hinderer, S., Layland, S. L., Schenke-Layland, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ECM+and+ECM-like+materials+&#8212;+Biomaterials+for+applications+in+regenerative+medicine+and+cancer+therapy.">ECM and ECM-like materials &#8212; Biomaterials for applications in regenerative medicine and cancer therapy.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 97, 260-269 (2016).</li><li>Young, D. A., Ibrahim, D. O., Hu, D., Christman, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Injectable+hydrogel+scaffold+from+decellularized+human+lipoaspirate.">Injectable hydrogel scaffold from decellularized human lipoaspirate.</a> Acta Biomaterialia. 7 (3), 1040-1049 (2011).</li><li>Singelyn, J. M., Christman, K. L., Littlefield, R. B., Schup-Magoffin, P. J., DeQuach, J. A., Seif-Naraghi, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Naturally+derived+myocardial+matrix+as+an+injectable+scaffold+for+cardiac+tissue+engineering.">Naturally derived myocardial matrix as an injectable scaffold for cardiac tissue engineering.</a> Biomaterials. 30 (29), 5409-5416 (2009).</li><li>Pouliot, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+characterization+of+a+naturally+derived+lung+extracellular+matrix+hydrogel.">Development and characterization of a naturally derived lung extracellular matrix hydrogel.</a> Journal of Biomedical Materials Research Part A. 104 (8), 1922-1935 (2016).</li><li>Bonvillain, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Nonhuman+Primate+Model+of+Lung+Regeneration:+Detergent-Mediated+Decellularization+and+Initial+In+Vitro+Recellularization+with+Mesenchymal+Stem+Cells.">A Nonhuman Primate Model of Lung Regeneration: Detergent-Mediated Decellularization and Initial In Vitro Recellularization with Mesenchymal Stem Cells.</a> Tissue Engineering Part A. 18 (23-24), 2437-2452 (2012).</li><li>Brown, B. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+Three+Methods+for+the+Derivation+of+a+Biologic+Scaffold+Composed+of+Adipose+Tissue+Extracellular+Matrix.">Comparison of Three Methods for the Derivation of a Biologic Scaffold Composed of Adipose Tissue Extracellular Matrix.</a> Tissue Engineering Part C: Methods. 17 (4), 411-421 (2011).</li><li>Link, P. A., Pouliot, R. A., Mikhaiel, N. S., Young, B. M., Heise, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tunable+Hydrogels+from+Pulmonary+Extracellular+Matrix+for+3D+Cell+Culture.">Tunable Hydrogels from Pulmonary Extracellular Matrix for 3D Cell Culture.</a> Journal of Visualized Experiments. (119), 1-9 (2017).</li><li>Massensini, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concentration-dependent+rheological+properties+of+ECM+hydrogel+for+intracerebral+delivery+to+a+stroke+cavity.">Concentration-dependent rheological properties of ECM hydrogel for intracerebral delivery to a stroke cavity.</a> Acta Biomaterialia. 27, 116-130 (2015).</li><li>Mierke, C. T., Frey, B., Fellner, M., Herrmann, M., Fabry, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin+5+1+facilitates+cancer+cell+invasion+through+enhanced+contractile+forces.">Integrin 5 1 facilitates cancer cell invasion through enhanced contractile forces.</a> Journal of Cell Science. 124 (3), 369-383 (2011).</li><li>Ahmadzadeh, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+the+two-way+feedback+between+contractility+and+matrix+realignment+reveals+a+nonlinear+mode+of+cancer+cell+invasion.">Modeling the two-way feedback between contractility and matrix realignment reveals a nonlinear mode of cancer cell invasion.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (9), E1617-E1626 (2017).</li></ol>

Этот метод гидрогеля во многом зависит от количества стартовой ткани. M'urine MFPs малы, и процесс децеллюляризации приводит к значительному сокращению материала(Таблица 1). Процесс может быть повторен с более MFPs увеличить конечную доходность. Мельница является еще одним важным шаг...

Рак характеризуется избыточным пролиферацией клеток, которые могут избежать апоптоза, а также метастазировать в отдаленные места1. Рак молочной железы является одной из наиболее распространенных форм среди женщин в США, по оценкам, 266000 новых случаев и 40000 смертей в 2018году 2. Особенно агрессивным и трудным для лечения подтипа является тройной отрицательный рак молочной железы (TNBC), который не хватает рецепторов эстрогена (ER), рецептор прогестерона (PR), и человека эпидермального фактора роста (HER2). Лучевая терапия обычно используется при раке молочной железы для устранения остаточных опухолевых клеток после lumpectomy, но более 13% пациентов TNBC по-прежнему испытывают рецидив на первичном сайте опухоли3.
Известно, что лучевая терапия эффективна в смягчении метастазирования и рецидивов, поскольку сочетание лампэктомии и радиации приводит к такому же долгосрочному выживанию, как мастэктомия4. Тем не менее, недавно было показано, что лучевая терапия связана с местным рецидивом первичного участка опухоли в условиях иммунокомпромисса5,6. Также хорошо известно, что излучение изменяет внеклеточную матрицу (ЭКМ) нормальной ткани, вызывая фиброз7. Поэтому важно понимать роль вызванных радиацией изменений ЭКМ в диктовке поведения опухолевых клеток.
Децеллюляризованные ткани были использованы вкачестве моделей in vitro для изучения болезни 8,9. Эти децеллюлярные ткани сохраняют состав ECM и резюмируют комплекс in vivo ECM. Эта децеллюляризованная ткань ECM может быть дополнительно обработана и переварена, чтобы сформировать восстановленные гидрогели ECM, которые могут быть использованы для изучения роста клеток и функции10,11. Например, инъекционные гидрогели, полученные из децеллюлярного липоаспиратии человека и из ткани миокарда, служили неинвазивными методами тканевой инженерии, а гидрогель, полученный из ткани свиного легкого, использовался в качестве метода тестирования in vitro мезенхимальных стволовых клеток вложения и жизнеспособности12,13,14. Влияние нормального повреждения тканей радиации на свойства ECM, однако, не было исследовано.
Гидрогели, полученные из ECM, обладают наибольшим потенциалом для изучения in vitro явлений in vivo. Было изучено несколько других материалов, в том числе коллаген, фибрин и матригель, но трудно синтетически резюмировать состав ECM13. Преимущество использования Гидрогелей, полученных из ECM, заключается в том, что ECM содержит необходимые белки и факторы роста для конкретной ткани14,15. Облучение нормальной ткани во время lumpectomy вызывает значительные изменения в ECM, и ECM полученных гидрогелей могут быть использованы для изучения этого эффекта в пробирке. Этот метод может привести к более сложным и более точным в пробирке модели болезни.
В этом исследовании, мы подвергли murine молочных жировых прокладок (MFPs) радиации ex vivo. MFPs были decellularized и сделаны в раствор pre-геля. Гидрогели были сформированы со встроенными 4T1 клетки, линии murine TNBC ячейки. Были изучены реологические свойства гидрогеля, а также оценена динамика опухолевых клеток в гидрогелях. Гидрогели, изготовленные из облученных MFPs, усиливали пролиферацию опухолевых клеток. Будущие исследования будут включать другие типы клеток для изучения клеточных взаимодействий в контексте рецидива рака после терапии.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>10% Neutral Buffered Formalin, Cube with Spigot</td>
			<td>VWR</td>
			<td>16004-128</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-methylbutane</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>19387</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AR 2000ex Rheometer</td>
			<td>TA Instruments</td>
			<td>10D4335</td>
			<td>rheometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A1933-25G</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>calcein acetoxymethyl (calcein AM)</td>
			<td>Molecular Probes, Inc.</td>
			<td>C1430</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Luciferin Firefly, potassium salt</td>
			<td>Biosynth Chemistry &#38; Biology</td>
			<td>L-8820</td>
			<td>(S)-4,5-Dihydro-2-(6-hydroxy-2-benzothiazolyl)-4-thiazolecarboxylic acid potassium salt</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPX Mountant for Histology</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>06522-500ML</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate-buffered saline</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14040133</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin-Y with Phloxine</td>
			<td>Richard-Allan Scientific</td>
			<td>71304</td>
			<td>eosin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ethidium homodimer</td>
			<td>Molecular Probes, Inc.</td>
			<td>E1169</td>
			<td>ethidium homodimer-1 (EthD-1)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F0926-500ML</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisher Healthcare Tissue-Plus O.C.T. Compound</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>23-730-571</td>
			<td>cryostat embedding medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount-G</td>
			<td>SouthernBiotech</td>
			<td>0100-01</td>
			<td>aqueous based mounting medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FreeZone 4.5</td>
			<td>Labconco</td>
			<td>7751020</td>
			<td>lyophilizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342 Solution (20 mM)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>62249</td>
			<td>blue fluorescent dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>258148-500ML</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IVIS Lumina III</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>CLS136334</td>
			<td>bioluminescence imaging system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimtech Science Kimwipes</td>
			<td>Kimberly Clark</td>
			<td></td>
			<td>delicate task wipes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Propanol (Peroxide-Free/Sequencing), Fisher BioReagents</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1130-500</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oil Red O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>O0625-25G</td>
			<td>1-([4-(Xylylazo)xylyl]azo)-2-naphthol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OPS Diagnostics CryoGrinder</td>
			<td>OPS Diagnostics, LLC</td>
			<td>CG-08-02</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (10X), pH 7.4</td>
			<td>Quality Biological, Inc.</td>
			<td>119-069-151</td>
			<td>Phosphate-buffered saline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pepsin from porcine gastric mucosa</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6887-5G</td>
			<td>pepsin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peracetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>77240-100ML</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin-iFluor 594 Reagent (ab176757)</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab176757</td>
			<td>phalloidin conjugate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propylene glycol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>W294004-1KG-K</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Richard-Allan Scientific Signature Series Bluing Reagent</td>
			<td>Richard-Allan Scientific</td>
			<td>7301L</td>
			<td>bluing agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Richard-Allan Scientific Signature Series Hematoxylin 7211</td>
			<td>Richard-Allan Scientific</td>
			<td>7211</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI Medium 1640</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11875-093</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate, 98%</td>
			<td>Frontier Scientific</td>
			<td>JK559522</td>
			<td>deoxycholic acid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5016</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton x-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100-100ML</td>
			<td>t-Octylphenoxypolyethoxyethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200-056</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman qualitative filter paper, Grade 4</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>1004-110</td>
			<td>grade 4 qualitative filter paper</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylenes (Certified ACS), Fisher Chemical</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>X5-4</td>
			<td>-</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

studying normal tissue radiation effects using extracellular matrix hydrogels

Радиация – это терапия для пациентов с тройным отрицательным раком молочной железы. Влияние излучения на внеклеточную матрицу (ЭКМ) здоровой ткани молочной железы и ее роль в локальном рецидиве на первичном участке опухоли неизвестны. Здесь мы представляем метод децеллюляризации, лиофилизации и изготовления гидрогелей ECM, полученных из murine mammary жировых прокладок. Представлены результаты по эффективности процесса децеллюляризации, оценены реологические параметры. GFP- и люциферазы помечены раковых клеток молочной железы инкапсулированных в гидрогелях продемонстрировали увеличение пролиферации в облученных гидрогелей. Наконец, фаллоидный конъюгированный окрашивание было использовано для визуализации цитоскелетной организации инкапсулированных опухолевых клеток. Наша цель состоит в том, чтобы представить метод для изготовления гидрогелей для исследования in vitro, которые имитируют среду ткани молочной железы in vivo и ее реакцию на радиацию для изучения поведения опухолевых клеток.

MFPs были decellularized после облучения с помощью процедуры, показанной на рисунке 1A. MFPs pre-decellularization (Рисунок 1B) и post-decellularization (рисунок 1C) показаны. Децеллюляризация была подтверждена с использованием гематоксилина и эозина (H и E) окрашивания, и 1-(No 4-(Xy...

Watch this Scientific Journal Video about Studying Normal Tissue Radiation Effects using Extracellular Matrix Hydrogels at JoVE.com

Studying Normal Tissue Radiation Effects using Extracellular Matrix Hydrogels

Изучение нормальных эффектов радиации тканей с помощью внеклеточных гидрогелей матрицы

Этот протокол представляет метод для децеллюляризации и последующего гидрогеля формирования murine молочных жировых прокладок после облучения ex vivo.

Radiation is a therapy for patients with triple negative breast cancer. The effect of radiation on the extracellular matrix (ECM) of healthy breast tissue ...

Этот протокол показывает, что излучение влияет на внеклеточные матричные свойства жировой ткани в мурине молочной жировой прокладки. Добавление излучения в модель децеллюляризации не было сделано раньше. Этот метод использует несколько шагов стирки, каждый из которых служит уникальной химической цели в процессе децеллюляризации.Специфика этого метода позволяет более мягко химическое мытье, чтобы лучше сохранить свойства тканей. Рак молочной железы рецидив происходит после терапии, особенно в тройных негативных случаях. Оценка того, как облученая внеклеточная матрица изменяет поведение опухолевых клеток, приведет к важным открытиям о механизмах рецидивов.После облучения образцов, используя источник цезия, передать облученных MFP и полный RPMI средств массовой информации в кабинет биобезопасности. Заполните шесть сантиметров или 10 сантиметров тарелки с достаточным количеством средств массовой информации, чтобы погрузить MFP's. Инкубационный при 37 градусах по Цельсию, с 5%углекислым газом, в течение двух дней.Во-первых, поместите MFP в шестиметровой посуде с пятью миллилитров решения Trypsin-EDTA. Спрей и протрите посуду с 70% этанола и инкубировать при 37 градусов по Цельсию в течение одного часа. Используйте 0,7 миллилитровых ситечкой для мытья MFP с деионизированной водой, наливая воду над тканью три раза.Используйте типсы, чтобы вручную массировать ткани между моет. Далее, кратко высушить ткань на деликатной задачей протрите и взвесить его. Поместите высушенные ткани в предварительно автоматический стакан, содержащий соответствующий размер перемешать бар и покрыть ткани с 60 миллилитров 3%t-octylphenoxypolyethoxyethanol на грамм ткани.Перемешать в течение одного часа при комнатной температуре. Затем сбросите содержимое стакана в ситечко. Промыть стакан деионизированной водой и залить его на ткани.Повторите этот процесс полоскания еще два раза, убедившись, что использовать типсы вручную массаж ткани между полосканиями. После этого, кратко высушить ткань на деликатной задачей протрите и взвесить. Поместите ткани и бары перемешать обратно в те же стаканы и покрыть их 60 миллилитров 4%деоксихолевая кислота на грамм ткани.Перемешать при комнатной температуре в течение одного часа. Затем сбросите содержимое стакана в сетчатый ситечко, промойте стакан деионизированной водой и вылейте его на ткани. Повторите этот процесс полоскания еще два раза, убедившись, что использовать типсы вручную массаж ткани между полосканиями.Кратко высушите промытую ткань на деликатной задаче протрите и взвесите ее. Поместите высушенные ткани в тот же стакан, вместе со свежей деионизированной водой, дополненной 1%пенициллин-стрептомицин. Обложка стакан плотно с парафиновой пленкой и оставить при 4 градусах по Цельсию на ночь.На следующий день слейте содержимое стакана в ситечко, кратко высушите ткань на деликатной задаче протрите и взвесите ее. Затем поместите MFP в тот же стакан с соответствующим размером перемешать бар. Обложка ткани с 60 миллилитров раствора, содержащего 4%этанола и 0,1% ператетической кислоты на грамм ткани.Перемешать при комнатной температуре в течение двух часов. Сбросите содержимое стакана в 0,7-миллиметровый ситечко. Используйте типсы, чтобы вручную массировать ткани и поместить содержимое обратно в стакан.Вымойте ткань, покрыв ее 60 миллилитров 1X PBS на грамм ткани. Перемешать при комнатной температуре в течение 15 минут. Повторите весь этот процесс стирки еще раз.Затем сбросите содержимое стакана в 0,7-миллиметровый ситечко. Используя типсы, вручную массируйте ткани и поместите содержимое обратно в стакан. Вымойте ткань, покрыв ее 60 миллилитров деионизированной воды на грамм ткани.Перемешать при комнатной температуре в течение 15 минут. Повторите весь этот процесс стирки еще раз. Кратко высушите промытую ткань на деликатной задаче протрите и взвесите ее.Свалить ткани и содержимое в ситечко и использовать миппы для ручного массажа тканей. Поместите содержимое обратно в стакан и покройте ткани 60 миллилитров 100%n-пропанола на грамм ткани. Перемешать при комнатной температуре в течение одного часа.Затем, кратко высушить ткань на деликатной задачей протрите и взвесить его. Сбросите ткань и содержимое в 0,7-миллиметровый ситечко и используйте типсы для ручного массажа тканей. Поместите содержимое обратно в стакан и мыть ткани, покрывая его 60 миллилитров деионизированной воды на грамм ткани.Перемешать при комнатной температуре в течение 15 минут. Повторите этот процесс мытья три раза. После этого, кратко высушить ткань на деликатной задачей протрите и взвесить его.Перенесите ткань в помеченную 15 миллилитровую трубку и заморозьте при минус 80 градусах по Цельсию на ночь. Во-первых, заполнить мелкий контейнер с жидким азотом. Удалите образцы из морозильной камеры и взвесить каждый лиофилизированных MFP.Поместите один образец в раствор, используйте криогенную перчатку, чтобы держать раствор в жидком азоте. Затем используйте пестик, прикрепленный к ручной дрелью, для фрезерования образца. Мельница в одну минуту интервалы, чтобы проверить прогресс и удалить перчатку руку из жидкого азота.Повторите этот процесс фрезерования для всех образцов, убедившись, что спрей и протрите раствор и пестик с этанолом между каждым образцом. Храните порошкообразные образцы в 15 миллилитровых трубках при отрицательном 80 градусов по Цельсию до готовности к использованию. Для начала удалите образцы из морозильной камеры и оттаивать при комнатной температуре.В то время как образцы оттаивают, смешайте пепсин в соляную кислоту, чтобы сформировать раствор Pepsin-HCL. Затем добавьте образец порошка и раствор Pepsin-HCL в 15-миллилитровую трубку, добавьте небольшой батончик и перемешайте в течение 48 часов. После этого поместите трубки на лед на пять минут.Добавьте 10X PBS к каждому образцу, так что окончательное решение имеет концентрацию 1X PBS. Затем добавьте 10%volume/volume, 0.1 молярный гидроксид натрия к каждому раствору, чтобы достичь pH 7.4, используя бумагу pH для проверки каждого решения индивидуально. Используя раствор рН 7,4 геля, повторно посовещен гранулированное GFP и люцифераза помечены 4T1 клеток в концентрации либо 500000 или 1000000 клеток на миллилитр геля раствора.Добавьте 16 микролитров раствора гель-клеток к каждому колодец 16-хорошо камерной горки и инкубировать при 37 градусах по Цельсию в течение 30 минут. После этого добавьте 100 микролитров полного RPMI-медиа к каждой колодец. Продолжайте инкубировать при 37 градусах по Цельсию в течение 48 часов.Затем используйте флуоресцентный микроскоп для наблюдения за клетками на восклицающей длине волны 519 нанометров и длине волны выбросов 618 нанометров. В этом исследовании, нормальные эффекты излучения тканей изучаются, используя внеклеточные матричные гидрогели. Гематоксилин и эозин окрашивание используется для подтверждения децеллюляризации, через потерю ядер и других следов ДНК.В то время как масло Красного O окрашивания используется для оценки содержания липидов и подтвердить сохранение морфологии дипасита. Реологические свойства гидрогелей ЭКМ оцениваются в 37 градусов по Цельсию. Модуль хранения выше, чем модуль потери для всех условий, демонстрируя стабильное образование гидрогеля.GFP и люцифераза помечены 4T1 клетки молочной карциномы затем инкапсулируются в гидрогелях. Распространение клеток изучается с помощью микроскопии флуоресценции, измерениями иллюминации и окрашивания жизнеспособности, через 48 часов после инкапсуляции. Облученые гидрогели показывают растущую тенденцию к распространению опухолевых клеток.Фаллоидин конъюгируется используется для визуализации F-Actin в инкапсулированных клетках. Не забудьте охладить раствор перед размещением ткани внутри мельницы, теплый раствор может привести к неполному фрезеровать. Используйте осторожность при обращении с n-пропанальным и пепсином, только открытым n-пропанальным и другими децеллюлярными агентами под химическим капотом.Если возможно, взвесить пепсин под химическим капюшоном, так как существует опасность вдыхания. Изменения состава ЭКМ после облучения и децеллюляризации можно оценить с помощью масс-спектрометрии и рамановской спектроскопии. Кроме того, структуру волокна гидрогелей ECM можно проанализировать путем сканирования электронной микроскопии.Этот метод имеет потенциал для расширения для изучения воздействия радиации на не только опухолевые клетки, но и иммунные клетки, а также ткани, которые испытывают повреждения излучения, в результате терапии. Этот метод децеллюляризации позволит исследователям оценить внеклеточные матричные свойства ткани после облучения, что является важным вариантом лечения в большинстве видов рака.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Analyzing the Communication Between Monocytes and Primary Breast Cancer Cells in an Extracellular Matrix Extract (ECME)-based Three-dimensional System

Analyzing the Communication Between Monocytes and Primary Breast Cancer Cells in an Extracellular Matrix Extract ECME-based Three-dimensional System

Анализируя связь между моноцитов и первичных груди раковые клетки в внеклеточного матрикса экстракт (ECME)-на основе трехмерной системы

Embedded in the extracellular matrix (ECM), normal and neoplastic epithelial cells intimately communicate with hematopoietic and non-hematopoietic cells, ...

PET and MRI Guided Irradiation of a Glioblastoma Rat Model Using a Micro-irradiator

ПЭТ и МРТ руководствуясь облучения глиобластома мышиной модели с помощью микро облучатель

For decades, small animal radiation research was mostly performed using fairly crude experimental setups applying simple single-beam techniques without ...

Imaging Approaches to Assessments of Toxicological Oxidative Stress Using Genetically-encoded Fluorogenic Sensors

Imaging подходы для оценки токсикологической оксидативного стресса, используя генетически закодированный Fluorogenic датчики

While oxidative stress is a commonly cited toxicological mechanism, conventional methods to study it suffer from a number of shortcomings, including ...

Fabrication of Tongue Extracellular Matrix and Reconstitution of Tongue Squamous Cell Carcinoma In Vitro

Fabrication of Tongue Extracellular Matrix and Reconstitution of Tongue Squamous Cell Carcinoma In Vitro

Изготовление язык внеклеточного матрикса и воссоздание язык плоскоклеточный рак в пробирке

In order to construct an effective and realistic model for tongue squamous cell carcinoma (TSCC) in vitro, the methods were created to produce ...

Extraction of Extracellular Vesicles from Whole Tissue

Извлечение внеклеточного Vesicles из цельной ткани

Circulating and interstitial small membrane-bound extracellular vesicles (EVs) represent promising targets for the development of novel diagnostic or ...

Three-Dimensional Bone Extracellular Matrix Model for Osteosarcoma

Внеклеточная матрица модель трехмерных костей для остеосаркомы

Osteosarcoma (OS) is the most common and a highly aggressive primary bone tumor. It is characterized with anatomic and histologic variations along with ...

Cell Cycle-specific Measurement of &#947;H2AX and Apoptosis After Genotoxic Stress by Flow Cytometry

Cell Cycle-specific Measurement of ÃƒÅ½Ã‚Â³H2AX and Apoptosis After Genotoxic Stress by Flow Cytometry

Специфический цикл клеток Измерение З2АКС и Апоптоза после генотоксического стресса с помощью цитометрии потока

The presented method or slightly modified versions have been devised to study specific treatment responses and side effects of various anti-cancer ...

Characterization of the Effects of Migrastatic Inhibitors on 3D Tumor Spheroid Invasion by High-resolution Confocal Microscopy

Характеристика влияния миграстатических ингибиторов на 3D-вторжение опухолевых сфероидов с помощью конфокальной микроскопии высокого разрешения

Drug discovery and development in cancer research is increasingly being based on drug screens in a 3D format. Novel inhibitors targeting the migratory and ...

Studying Triple Negative Breast Cancer Using Orthotopic Breast Cancer Model

Изучение Тройной отрицательный рак молочной железы Использование ортотопической модели рака молочной железы

Triple-negative breast cancer (TNBC) is an aggressive breast cancer subtype with limited therapeutic options. When compared to patients with less ...

Studying the Effects of Tumor-Secreted Paracrine Ligands on Macrophage Activation using Co-Culture with Permeable Membrane Supports

Изучение влияния опухолевых паракринных лигандов на активацию макрофагов с помощью совместной культуры с проницаемой мембраной поддержкой

Tumor-derived paracrine signaling is an overlooked component of local immunosuppression and can lead to a permissive environment for continued cancer ...