Name: studying normal tissue radiation effects using extracellular matrix hydrogels
Uploaded: 2019-07-24T13:00:00
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Los autores agradecen a la Dra. Laura L. Bronsart por proporcionar las células GFP- y luciferase-4T1, el Dr. Edward L. LaGory por consejos sobre 1-([4-(Xylylazo)xylyl]azo)-2-naphthol manchación, Dr. Craig L. Duvall para IVIS y uso de liofilizador, y Dr. Scott A. Guelcher para el rheómetro Uso. Esta investigación fue apoyada financieramente por la subvención de los NIH #R00CA201304.

Los estudios en animales se realizaron de acuerdo con las directrices y protocolos institucionales aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Vanderbilt.
1. Preparación y irradiación ex vivo de los equipos de multifunción
<ol><li>Sacrificar ratones Nu/Nu atímicos (8-10 semanas) usando asfixia porCO2 seguida de luxación cervical.</li>
	<li>Limpie la piel con 70% de etanol.</li>
	<li>Recoger almohadillas de grasa mamaria (MFP) de ra...

<ol>
	<li>Hanahan, D., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+hallmarks+of+cancer.">The hallmarks of cancer.</a> Cell. 100 (1), 57-70 (2000).</li><li>Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+statistics,+2018.">Cancer statistics, 2018.</a> CA: A Cancer Journal for Clinicians. 68 (1), 7-30 (2018).</li><li>Lowery, A. J., Kell, M. R., Glynn, R. W., Kerin, M. J., Sweeney, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Locoregional+recurrence+after+breast+cancer+surgery:+a+systematic+review+by+receptor+phenotype.">Locoregional recurrence after breast cancer surgery: a systematic review by receptor phenotype.</a> Breast Cancer Research and Treatment. 133 (3), 831-841 (2012).</li><li>Miller, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+treatment+and+survivorship+statistics,+2016.">Cancer treatment and survivorship statistics, 2016.</a> CA: A Cancer Journal for Clinicians. 66 (4), 271-289 (2016).</li><li>Vilalta, M., Rafat, M., Giaccia, A. J., Graves, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recruitment+of+Circulating+Breast+Cancer+Cells+Is+Stimulated+by+Radiotherapy.">Recruitment of Circulating Breast Cancer Cells Is Stimulated by Radiotherapy.</a> Cell Reports. 8 (2), 402-409 (2014).</li><li>Rafat, M., Aguilera, T. A., Vilalta, M., Bronsart, L. L., Soto, L. A., von Eyben, R., Golla, M. A., Ahrari, Y., Melemenidis, S., Afghahi, A., Jenkins, M. J., Kurian, A. W., Horst, K. C., Giaccia, A. J., Graves, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages+Promote+Circulating+Tumor+Cell-Mediated+Local+Recurrence+Following+Radiation+Therapy+in+Immunosuppressed+Patients.">Macrophages Promote Circulating Tumor Cell-Mediated Local Recurrence Following Radiation Therapy in Immunosuppressed Patients.</a> Cancer Res. 75 (15), 4241-4252 (2018).</li><li>Haubner, F., Ohmann, E., Pohl, F., Strutz, J., Gassner, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wound+healing+after+radiation+therapy:+Review+of+the+literature.">Wound healing after radiation therapy: Review of the literature.</a> Radiation Oncology. 7 (1), 1-9 (2012).</li><li>Beachley, V. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+matrix+arrays+for+high+throughput+screening+and+systems+analysis+of+cell+function.">Tissue matrix arrays for high throughput screening and systems analysis of cell function.</a> Nature Methods. 12 (12), 1197-1204 (2015).</li><li>Tian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ-specific+metastases+obtained+by+culturing+colorectal+cancer+cells+on+tissue-specific+decellularized+scaffolds.">Organ-specific metastases obtained by culturing colorectal cancer cells on tissue-specific decellularized scaffolds.</a> Nature Biomedical Engineering. 2 (6), 443-452 (2018).</li><li>Saldin, L. T., Cramer, M. C., Velankar, S. S., White, L. J., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix+hydrogels+from+decellularized+tissues:+Structure+and+function.">Extracellular matrix hydrogels from decellularized tissues: Structure and function.</a> Acta Biomaterialia. 49, 1-15 (2017).</li><li>Hinderer, S., Layland, S. L., Schenke-Layland, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ECM+and+ECM-like+materials+&#8212;+Biomaterials+for+applications+in+regenerative+medicine+and+cancer+therapy.">ECM and ECM-like materials &#8212; Biomaterials for applications in regenerative medicine and cancer therapy.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 97, 260-269 (2016).</li><li>Young, D. A., Ibrahim, D. O., Hu, D., Christman, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Injectable+hydrogel+scaffold+from+decellularized+human+lipoaspirate.">Injectable hydrogel scaffold from decellularized human lipoaspirate.</a> Acta Biomaterialia. 7 (3), 1040-1049 (2011).</li><li>Singelyn, J. M., Christman, K. L., Littlefield, R. B., Schup-Magoffin, P. J., DeQuach, J. A., Seif-Naraghi, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Naturally+derived+myocardial+matrix+as+an+injectable+scaffold+for+cardiac+tissue+engineering.">Naturally derived myocardial matrix as an injectable scaffold for cardiac tissue engineering.</a> Biomaterials. 30 (29), 5409-5416 (2009).</li><li>Pouliot, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+characterization+of+a+naturally+derived+lung+extracellular+matrix+hydrogel.">Development and characterization of a naturally derived lung extracellular matrix hydrogel.</a> Journal of Biomedical Materials Research Part A. 104 (8), 1922-1935 (2016).</li><li>Bonvillain, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Nonhuman+Primate+Model+of+Lung+Regeneration:+Detergent-Mediated+Decellularization+and+Initial+In+Vitro+Recellularization+with+Mesenchymal+Stem+Cells.">A Nonhuman Primate Model of Lung Regeneration: Detergent-Mediated Decellularization and Initial In Vitro Recellularization with Mesenchymal Stem Cells.</a> Tissue Engineering Part A. 18 (23-24), 2437-2452 (2012).</li><li>Brown, B. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+Three+Methods+for+the+Derivation+of+a+Biologic+Scaffold+Composed+of+Adipose+Tissue+Extracellular+Matrix.">Comparison of Three Methods for the Derivation of a Biologic Scaffold Composed of Adipose Tissue Extracellular Matrix.</a> Tissue Engineering Part C: Methods. 17 (4), 411-421 (2011).</li><li>Link, P. A., Pouliot, R. A., Mikhaiel, N. S., Young, B. M., Heise, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tunable+Hydrogels+from+Pulmonary+Extracellular+Matrix+for+3D+Cell+Culture.">Tunable Hydrogels from Pulmonary Extracellular Matrix for 3D Cell Culture.</a> Journal of Visualized Experiments. (119), 1-9 (2017).</li><li>Massensini, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concentration-dependent+rheological+properties+of+ECM+hydrogel+for+intracerebral+delivery+to+a+stroke+cavity.">Concentration-dependent rheological properties of ECM hydrogel for intracerebral delivery to a stroke cavity.</a> Acta Biomaterialia. 27, 116-130 (2015).</li><li>Mierke, C. T., Frey, B., Fellner, M., Herrmann, M., Fabry, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin+5+1+facilitates+cancer+cell+invasion+through+enhanced+contractile+forces.">Integrin 5 1 facilitates cancer cell invasion through enhanced contractile forces.</a> Journal of Cell Science. 124 (3), 369-383 (2011).</li><li>Ahmadzadeh, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+the+two-way+feedback+between+contractility+and+matrix+realignment+reveals+a+nonlinear+mode+of+cancer+cell+invasion.">Modeling the two-way feedback between contractility and matrix realignment reveals a nonlinear mode of cancer cell invasion.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (9), E1617-E1626 (2017).</li></ol>

Este método de formación de hidrogel depende en gran medida de la cantidad de tejido inicial. Las mFP de murine son pequeñas, y el proceso de descelularización da lugar a una reducción significativa del material (Tabla 1). El proceso se puede repetir con más equipos multifunción para aumentar el rendimiento final. El fresado es otro paso importante que puede conducir a la pérdida de material. Otros han demostrado éxito con un molino criogénico, pero este protocolo se basa en</...

El cáncer se caracteriza por la proliferación excesiva de células que pueden evadir la apoptosis y también hacer metástasis en sitios distantes1. El cáncer de mama es una de las formas más comunes entre las mujeres en los Estados Unidos, con un estimadode 266.000 nuevos casos y 40.000 muertes en 2018 2. Un subtipo particularmente agresivo y difícil de tratar es el cáncer de mama triple negativo (TNBC), que carece del receptor de estrógeno (ER), el receptor de progesterona (PR) y el factor de crecimiento epidérmico humano (HER2). La radioterapia se utiliza comúnmente en el cáncer de mama para eliminar las células tumorales residuales después de la tumorectomía, pero más del 13% de los pacientes con TNBC todavía experimentan recurrencia en el sitio primario del tumor3.
Se sabe que la radioterapia es eficaz para mitigar la metástasis y la recurrencia porque lacombinación de lumpectomía y radiación da como resultado la misma supervivencia a largo plazo que la mastectomía 4. Sin embargo, recientemente se ha demostrado que el tratamiento de radiaciónestá asociado con la recurrencia local al sitio del tumor primario en entornos inmunocomprometidos 5,6. Además, es bien sabido que la radiación cambia la matriz extracelular (ECM) del tejido normal induciendo la fibrosis7. Por lo tanto, es importante entender el papel de los cambios de ECM inducidos por la radiación en la dictación del comportamiento de las células tumorales.
Los tejidos descelularizados se hanutilizado como modelos in vitro para estudiar la enfermedad 8,9. Estos tejidos descelularizados preservan la composición de la ECM y recapitulan el complejo in vivo ECM. Este eCM de tejido descelularizado se puede procesar y digerir para formar hidrogeles ECM reconstituidos que se pueden utilizar para estudiar el crecimiento celular y la función10,11. Por ejemplo, los hidrogeles inyectables derivados del lipoaspirato humano descelularizado y del tejido miocárdico sirvieron como métodos no invasivos de ingeniería tisular, y un hidrogel derivado del tejido pulmonar porcino se utilizó como método in vitro de prueba accesorio de células madre mesenquimales y viabilidad12,13,14. Sin embargo, no se ha investigado el efecto del daño normal por radiación tisular en las propiedades de ECM.
Los hidrogeles derivados de ECM tienen el mayor potencial para el estudio in vitro de fenómenos in vivo. Se han estudiado otros materiales, incluyendo colágeno, fibrina y matrigel, pero es difícil recapitular sintéticamente la composición del ECM13. Una ventaja del uso de hidrogeles derivados de ECM es que el ECM contiene las proteínas y factores de crecimiento necesarios para un tejido en particular14,15. La irradiación de tejido normal durante la tumorectomía causa cambios significativos en el ECM, y los hidrogeles derivados de ECM se pueden utilizar para estudiar este efecto in vitro. Este método podría conducir a modelos in vitro más complejos y más precisos de la enfermedad.
En este estudio, sometimos almohadillas de grasa mamaria murinos (MFP) a radiación ex vivo. Los equipos multifunción se descelularizaron y se convirtieron en una solución pregel. Los hidrogeles se formaron con células 4T1 incrustadas, una línea celular de TNBC murina. Se examinaron las propiedades reológicas del material hidrogel y se evaluó la dinámica de las células tumorales dentro de los hidrogeles. Los hidrogeles fabricados a partir de equipos multifunción irradiados mejoraron la proliferación de células tumorales. Estudios futuros incorporarán otros tipos de células para estudiar las interacciones células celulares en el contexto de la recurrencia del cáncer después de la terapia.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>10% Neutral Buffered Formalin, Cube with Spigot</td>
			<td>VWR</td>
			<td>16004-128</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-methylbutane</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>19387</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AR 2000ex Rheometer</td>
			<td>TA Instruments</td>
			<td>10D4335</td>
			<td>rheometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A1933-25G</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>calcein acetoxymethyl (calcein AM)</td>
			<td>Molecular Probes, Inc.</td>
			<td>C1430</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Luciferin Firefly, potassium salt</td>
			<td>Biosynth Chemistry &#38; Biology</td>
			<td>L-8820</td>
			<td>(S)-4,5-Dihydro-2-(6-hydroxy-2-benzothiazolyl)-4-thiazolecarboxylic acid potassium salt</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPX Mountant for Histology</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>06522-500ML</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate-buffered saline</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14040133</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin-Y with Phloxine</td>
			<td>Richard-Allan Scientific</td>
			<td>71304</td>
			<td>eosin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ethidium homodimer</td>
			<td>Molecular Probes, Inc.</td>
			<td>E1169</td>
			<td>ethidium homodimer-1 (EthD-1)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F0926-500ML</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisher Healthcare Tissue-Plus O.C.T. Compound</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>23-730-571</td>
			<td>cryostat embedding medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount-G</td>
			<td>SouthernBiotech</td>
			<td>0100-01</td>
			<td>aqueous based mounting medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FreeZone 4.5</td>
			<td>Labconco</td>
			<td>7751020</td>
			<td>lyophilizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342 Solution (20 mM)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>62249</td>
			<td>blue fluorescent dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>258148-500ML</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IVIS Lumina III</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>CLS136334</td>
			<td>bioluminescence imaging system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimtech Science Kimwipes</td>
			<td>Kimberly Clark</td>
			<td></td>
			<td>delicate task wipes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Propanol (Peroxide-Free/Sequencing), Fisher BioReagents</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1130-500</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oil Red O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>O0625-25G</td>
			<td>1-([4-(Xylylazo)xylyl]azo)-2-naphthol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OPS Diagnostics CryoGrinder</td>
			<td>OPS Diagnostics, LLC</td>
			<td>CG-08-02</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (10X), pH 7.4</td>
			<td>Quality Biological, Inc.</td>
			<td>119-069-151</td>
			<td>Phosphate-buffered saline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pepsin from porcine gastric mucosa</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6887-5G</td>
			<td>pepsin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peracetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>77240-100ML</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin-iFluor 594 Reagent (ab176757)</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab176757</td>
			<td>phalloidin conjugate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propylene glycol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>W294004-1KG-K</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Richard-Allan Scientific Signature Series Bluing Reagent</td>
			<td>Richard-Allan Scientific</td>
			<td>7301L</td>
			<td>bluing agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Richard-Allan Scientific Signature Series Hematoxylin 7211</td>
			<td>Richard-Allan Scientific</td>
			<td>7211</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI Medium 1640</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11875-093</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate, 98%</td>
			<td>Frontier Scientific</td>
			<td>JK559522</td>
			<td>deoxycholic acid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5016</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton x-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100-100ML</td>
			<td>t-Octylphenoxypolyethoxyethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200-056</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman qualitative filter paper, Grade 4</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>1004-110</td>
			<td>grade 4 qualitative filter paper</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylenes (Certified ACS), Fisher Chemical</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>X5-4</td>
			<td>-</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

studying normal tissue radiation effects using extracellular matrix hydrogels

La radiación es una terapia para pacientes con cáncer de mama triple negativo. Se desconoce el efecto de la radiación en la matriz extracelular (ECM) del tejido mamario sano y su papel en la recurrencia local en el sitio del tumor primario. Aquí presentamos un método para la descelularización, liofilización y fabricación de hidrogeles ECM derivados de almohadillas de grasa mamaria murina. Se presentan resultados sobre la eficacia del proceso de descelularización, y se evaluaron los parámetros reológicos. Las células de cáncer de mama etiquetadas por GFP y luciferasse encapsuladas en los hidrogeles demostraron un aumento de la proliferación en hidrogeles irradiados. Finalmente, se empleó la tinción conjugada con phalloidin para visualizar la organización del citoesqueleto de las células tumorales encapsuladas. Nuestro objetivo es presentar un método para la fabricación de hidrogeles para el estudio in vitro que imitan el entorno del tejido mamario in vivo y su respuesta a la radiación con el fin de estudiar el comportamiento de las células tumorales.

Las mFP se descelularizaron tras la irradiación mediante el procedimiento que se muestra en la Figura 1A. Se muestran las mFP de predescelularización (figura1B)y postdescelularización (figura 1C). La descelularización se confirmó utilizando la tinción de hematoxilina y eosina (H & E), y se utilizó la tinción 1-([4-(Xylylazo)xylyl]azo)-2-naphthol para evaluar el contenido de lípidos (Figura 2). También se evaluar...

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Studying Normal Tissue Radiation Effects using Extracellular Matrix Hydrogels

Estudio de los efectos de radiación de tejido normal con hidrogeles de matriz extracelular

Este protocolo presenta un método para la descelularización y posterior formación de hidrogel de almohadillas de grasa mamaria murina después de la irradiación ex vivo.

Radiation is a therapy for patients with triple negative breast cancer. The effect of radiation on the extracellular matrix (ECM) of healthy breast tissue ...

Este protocolo muestra que la radiación influye en las propiedades de la matriz extracelular del tejido adiposo en la almohadilla de grasa mamaria murina. La adición de radiación en un modelo de decelularización no se ha hecho antes. Esta técnica utiliza varios pasos de lavado que cada uno sirve un propósito químico único en el proceso de descelularización.La especificidad de esta técnica permite lavados químicos más suaves, para preservar mejor las propiedades del tejido. La recaída del cáncer de mama ocurre después de la terapia, especialmente en casos triples negativos. Evaluar cómo la matriz extracelular irradiada altera el comportamiento de las células tumorales conducirá a descubrimientos importantes sobre los mecanismos de recurrencia.Después de irradiar muestras, utilizando una fuente de cesio, transfiera los MFP irradiados y los medios RPMI completos a un gabinete de bioseguridad. Llene los platos de seis centímetros o 10 centímetros con medios suficientes para sumergir los equipos multifunción. Incubar a 37 grados centígrados, con un 5% de dióxido de carbono, durante dos días.En primer lugar, coloque los MFP en platos de seis centímetros con cinco mililitros de solución Trypsin-EDTA. Rocíe y limpie los platos con 70% de etanol e incubar a 37 grados centígrados durante una hora. Utilice coladores de 0,7 mililitros para lavar los equipos multifunción con agua desionizada, vertiendo agua sobre el tejido tres veces.Utilice fórceps para masajear manualmente el tejido entre lavados. A continuación, seque brevemente el tejido en una delicada limpieza de tareas y sopesarlo. Coloque los tejidos secos en un vaso de precipitados preautoclavedo, que contenga una barra de agitación de tamaño adecuado y cubra los tejidos con 60 mililitros de 3%t-octylphenoxypolyethoxyethanol por gramo de tejido.Revuelva durante una hora a temperatura ambiente. Luego arroja el contenido del vaso de precipitados en un colador. Enjuague el vaso de precipitados con agua desionizada y vierta esto en los tejidos.Repita este proceso de enjuague dos veces más, asegurándose de usar fórceps para masajear manualmente el tejido entre enjuagues. Después de esto, seque brevemente el tejido en una delicada limpieza de la tarea y pesar. Coloque los tejidos y las barras de agitación de nuevo en los mismos vasos y cúbralos con 60 mililitros de 4% de ácido desoxicólico por gramo de tejido.Revuelva a temperatura ambiente durante una hora. A continuación, vierta el contenido del vaso de precipitados en un colador de malla, enjuague el vaso de precipitados con agua desionizada y vierta esto en los tejidos. Repita este proceso de enjuague dos veces más, asegurándose de usar fórceps para masajear manualmente el tejido entre enjuagues.Seque brevemente el tejido enjuagado en una delicada toallita de tarea y sopesarlo. Colocar los tejidos secos en el mismo vaso de precipitados, junto con agua fresca desionizada, complementada con 1%penicilina-estreptomicina. Cubrir el vaso de precipitados firmemente con película de parafina y salir a 4 grados Celsius durante la noche.Al día siguiente drenar el contenido del vaso de precipitados en un colador, secar brevemente el tejido en una delicada limpieza de la tarea y pesarlo. A continuación, coloque los equipos multifunción en el mismo vaso de precipitados con una barra de agitación de tamaño adecuado. Cubrir el tejido con 60 mililitros de una solución que contenga 4%etanol y 0,1%ácido peracético por gramo de tejido.Revuelva a temperatura ambiente durante dos horas. Volca el contenido del vaso de precipitados en un colador de 0,7 milímetros. Use fórceps para masajear manualmente el tejido y volver a colocar el contenido en el vaso de precipitados.Lavar el tejido cubriéndolo con 60 mililitros de 1X PBS por gramo de tejido. Revuelva a temperatura ambiente durante 15 minutos. Repita todo este proceso de lavado una vez más.A continuación, volque el contenido del vaso de precipitados en un colador de 0,7 milímetros. Usando fórceps, masajee manualmente el tejido y vuelva a colocar el contenido en el vaso de precipitados. Lavar el tejido cubriéndolo con 60 mililitros de agua desionizada por gramo de tejido.Revuelva a temperatura ambiente durante 15 minutos. Repita todo este proceso de lavado una vez más. Seque brevemente el tejido lavado en una delicada toallita de tarea y sopesarlo.Vierta el tejido y el contenido en un colador y use fórceps para masajear manualmente el tejido. Coloque el contenido de nuevo en el vaso de precipitados y cubra los tejidos con 60 mililitros de 100%n-propanol por gramo de tejido. Revuelva a temperatura ambiente durante una hora.Luego, seque brevemente el tejido en una delicada toallita de tarea y sopesarlo. Vierta el tejido y el contenido en un colador de 0,7 milímetros y use fórceps para masajear manualmente el tejido. Coloque el contenido de nuevo en el vaso de precipitados y lave el tejido cubriéndolo con 60 mililitros de agua desionizada por gramo de tejido.Revuelva a temperatura ambiente durante 15 minutos. Repita este proceso de lavado tres veces. Después de esto, seque brevemente el tejido en una delicada limpieza de la tarea y sopesarlo.Transfiera el tejido a un tubo etiquetado de 15 mililitros y congele a 80 grados Celsius negativos durante la noche. Primero, llene un recipiente poco profundo con nitrógeno líquido. Retire las muestras del congelador y pese cada impresora multifunción liofilizada.Coloque una muestra en el mortero, use un guante criogénico para sostener el mortero en el nitrógeno líquido. A continuación, utilice un pestillo, unido a un taladro de mano, para fresar la muestra. Fresar en intervalos de un minuto para comprobar el progreso y retirar la mano enguanada del nitrógeno líquido.Repita este proceso de molienda para todas las muestras, asegurándose de rociar y limpiar el mortero y el pestillo con etanol entre cada muestra. Almacene las muestras en polvo en tubos de 15 mililitros a 80 grados Celsius negativos hasta que estén listas para usar. Para comenzar, retire las muestras del congelador y descongele a temperatura ambiente.Mientras las muestras se descongelan, mezcle la pepsina en ácido clorhídrico para formar una solución de Pepsin-HCL. A continuación, agregue el polvo de muestra y la solución Pepsin-HCL a un tubo de 15 mililitros, agregue una pequeña barra de agitación y revuelva durante 48 horas. Después de esto, coloque los tubos en hielo durante cinco minutos.Agregue 10X PBS a cada muestra, de manera que la solución final tenga una concentración de 1X PBS. A continuación, añada un 10% de volumen/volumen, 0,1 molar de hidróxido sódico a cada solución, para alcanzar el pH 7.4, utilizando papel de pH para probar cada solución individualmente. Usando una solución de gel de pH 7.4, resuspender la GFP peletada y la luciferasa etiquetadas 4T1 a una concentración de 500, 000 o 1.000, 000 células por mililitro de solución de gel.Agregue 16 microlitros de solución de células de gel a cada pozo de un portaobjetos de cámara de 16 pozos e incubar a 37 grados centígrados durante 30 minutos. Después de esto, agregue 100 microlitros de medios RPMI completos a cada pozo. Continúe incubando a 37 grados centígrados durante 48 horas.Luego, utilice un microscopio de fluorescencia para observar las células a una longitud de onda de excitación de 519 nanómetros y una longitud de onda de emisión de 618 nanómetros. En este estudio, se estudian los efectos normales de la radiación tisular, utilizando hidrogeles de matriz extracelular. La tinción de hematoxilina y eosina se utiliza para confirmar la descelularización, a través de la pérdida de núcleos y otros rastros de ADN.Mientras que la tinción de aceite rojo O se utiliza para evaluar el contenido de lípidos y confirmar la retención de una morfología dipasím. Las propiedades reológicas de los hidrogeles ECM se evalúan a 37 grados centígrados. El módulo de almacenamiento es mayor que el módulo de pérdida para todas las condiciones, demostrando la formación estable de hidrogeles.Las células de carcinoma mamario 4T1 etiquetadas con GFP y luciferasa se encapsulan en los hidrogeles. La proliferación celular se examina mediante microscopía de fluorescencia, mediante mediciones de iluminación y tinción de viabilidad, 48 horas después de la encapsulación. Los hidrogeles irradiados muestran una tendencia creciente en la proliferación de células tumorales.El conjugado de faloide se utiliza para visualizar F-Actin en las células encapsuladas. Recuerde enfriar el mortero antes de colocar el tejido dentro del molino, un mortero caliente puede conducir a un fresado incompleto. Tenga cuidado al manipular n-propanal y pepsina, solo abra n-propanal y otros agentes decellularizatorios bajo una capucha química.Si es posible, sopese la pepsina bajo una capucha química, ya que hay peligro de inhalación. Los cambios en la composición del ECM después de la irradiación y la decelularización se pueden evaluar mediante espectrometría de masas y espectroscopia de Raman. Además, la estructura de fibra de los hidrogeles ECM se puede analizar mediante microscopía electrónica de barrido.Este método tiene el potencial de ampliarse para examinar los efectos de la radiación en, no sólo las células tumorales, sino también las células inmunes, así como los tejidos que experimentan daño por radiación, como resultado de la terapia. Esta técnica de descelularización permitirá a los investigadores evaluar las propiedades de la matriz extracelular del tejido después de la radiación, que es una opción de tratamiento importante en la mayoría de los cánceres.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Analyzing the Communication Between Monocytes and Primary Breast Cancer Cells in an Extracellular Matrix Extract (ECME)-based Three-dimensional System

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Análisis de la comunicación entre monocitos y las células de cáncer de mama primario en una matriz extracelular extracto (ECME)-sistema tridimensional basado en

Embedded in the extracellular matrix (ECM), normal and neoplastic epithelial cells intimately communicate with hematopoietic and non-hematopoietic cells, ...

Investigación

Investigación sobre el cáncer

PET and MRI Guided Irradiation of a Glioblastoma Rat Model Using a Micro-irradiator

PET y resonancia magnética guiada por irradiación de un modelo de rata de Glioblastoma usando un Micro-irradiador

For decades, small animal radiation research was mostly performed using fairly crude experimental setups applying simple single-beam techniques without ...

Imaging Approaches to Assessments of Toxicological Oxidative Stress Using Genetically-encoded Fluorogenic Sensors

Enfoques de evaluación de estrés oxidativo toxicológico mediante sensores codificados genéticamente fluorógenos la proyección de imagen

While oxidative stress is a commonly cited toxicological mechanism, conventional methods to study it suffer from a number of shortcomings, including ...

Fabrication of Tongue Extracellular Matrix and Reconstitution of Tongue Squamous Cell Carcinoma In Vitro

Fabrication of Tongue Extracellular Matrix and Reconstitution of Tongue Squamous Cell Carcinoma In Vitro

Fabricación de la matriz extracelular de la lengua y reconstitución de células escamosas de lengua In Vitro

In order to construct an effective and realistic model for tongue squamous cell carcinoma (TSCC) in vitro, the methods were created to produce ...

Extraction of Extracellular Vesicles from Whole Tissue

Extracción de vesículas extracelulares de todo tejido

Circulating and interstitial small membrane-bound extracellular vesicles (EVs) represent promising targets for the development of novel diagnostic or ...

Three-Dimensional Bone Extracellular Matrix Model for Osteosarcoma

Modelo de matriz extracelular ósea tridimensional para el Osteosarcoma

Osteosarcoma (OS) is the most common and a highly aggressive primary bone tumor. It is characterized with anatomic and histologic variations along with ...

Cell Cycle-specific Measurement of &#947;H2AX and Apoptosis After Genotoxic Stress by Flow Cytometry

Cell Cycle-specific Measurement of ÃƒÅ½Ã‚Â³H2AX and Apoptosis After Genotoxic Stress by Flow Cytometry

Medición específica del ciclo celular de la éH2AX y la apoptosis después del estrés genotóxico por citometría de flujo

The presented method or slightly modified versions have been devised to study specific treatment responses and side effects of various anti-cancer ...

Characterization of the Effects of Migrastatic Inhibitors on 3D Tumor Spheroid Invasion by High-resolution Confocal Microscopy

Caracterización de los efectos de los inhibidores migratorios en la invasión de esferoides de tumores 3D por microscopía confocal de alta resolución

Drug discovery and development in cancer research is increasingly being based on drug screens in a 3D format. Novel inhibitors targeting the migratory and ...

Studying Triple Negative Breast Cancer Using Orthotopic Breast Cancer Model

Estudio del triple cáncer de mama negativo con el modelo de cáncer de mama ortotópico

Triple-negative breast cancer (TNBC) is an aggressive breast cancer subtype with limited therapeutic options. When compared to patients with less ...

Studying the Effects of Tumor-Secreted Paracrine Ligands on Macrophage Activation using Co-Culture with Permeable Membrane Supports

Estudio de los efectos de los ligandos paracrinos secretos de tumor en la activación de macrófagos utilizando co-cultivo con soportes de membrana permeable

Tumor-derived paracrine signaling is an overlooked component of local immunosuppression and can lead to a permissive environment for continued cancer ...