Name: studying normal tissue radiation effects using extracellular matrix hydrogels
Uploaded: 2019-07-24T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Studying Normal Tissue Radiation Effects using Extracellular Matrix Hydrogels at JoVE.com

Författarna tackar Dr Laura L. Bronsart för att tillhandahålla GFP-och luciferase-4T1 celler, Dr Edward l. lagory för råd om 1-([4-(xylylazo) xylyl] azo)- -2-Naphthol färgning, Dr. Craig l. Duvall för Ivis och lyophilizer bruk och Dr. Scott A. guelcher för skjuvreometer Använda. Denna forskning stöddes ekonomiskt av NIH Grant #R00CA201304.

Djurstudier har utförts i enlighet med institutionella riktlinjer och protokoll som godkänts av Vanderbilt University institutionella djuromsorg och användning kommittén.
1. beredning och ex vivo bestrålning av multifunktionsskrivare
<ol><li>Offra atymiska nu/nu möss (8 – 10 veckor) med hjälp av co2 kvävning följt av cervikal dislokation.</li>
	<li>Rengör huden med 70% etanol.</li>
	<li>Samla in mjölkfett kuddar (MFP) från offrade möss med Försteriliserad sax och t...

<ol>
	<li>Hanahan, D., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+hallmarks+of+cancer.">The hallmarks of cancer.</a> Cell. 100 (1), 57-70 (2000).</li><li>Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+statistics,+2018.">Cancer statistics, 2018.</a> CA: A Cancer Journal for Clinicians. 68 (1), 7-30 (2018).</li><li>Lowery, A. J., Kell, M. R., Glynn, R. W., Kerin, M. J., Sweeney, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Locoregional+recurrence+after+breast+cancer+surgery:+a+systematic+review+by+receptor+phenotype.">Locoregional recurrence after breast cancer surgery: a systematic review by receptor phenotype.</a> Breast Cancer Research and Treatment. 133 (3), 831-841 (2012).</li><li>Miller, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+treatment+and+survivorship+statistics,+2016.">Cancer treatment and survivorship statistics, 2016.</a> CA: A Cancer Journal for Clinicians. 66 (4), 271-289 (2016).</li><li>Vilalta, M., Rafat, M., Giaccia, A. J., Graves, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recruitment+of+Circulating+Breast+Cancer+Cells+Is+Stimulated+by+Radiotherapy.">Recruitment of Circulating Breast Cancer Cells Is Stimulated by Radiotherapy.</a> Cell Reports. 8 (2), 402-409 (2014).</li><li>Rafat, M., Aguilera, T. A., Vilalta, M., Bronsart, L. L., Soto, L. A., von Eyben, R., Golla, M. A., Ahrari, Y., Melemenidis, S., Afghahi, A., Jenkins, M. J., Kurian, A. W., Horst, K. C., Giaccia, A. J., Graves, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages+Promote+Circulating+Tumor+Cell-Mediated+Local+Recurrence+Following+Radiation+Therapy+in+Immunosuppressed+Patients.">Macrophages Promote Circulating Tumor Cell-Mediated Local Recurrence Following Radiation Therapy in Immunosuppressed Patients.</a> Cancer Res. 75 (15), 4241-4252 (2018).</li><li>Haubner, F., Ohmann, E., Pohl, F., Strutz, J., Gassner, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wound+healing+after+radiation+therapy:+Review+of+the+literature.">Wound healing after radiation therapy: Review of the literature.</a> Radiation Oncology. 7 (1), 1-9 (2012).</li><li>Beachley, V. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+matrix+arrays+for+high+throughput+screening+and+systems+analysis+of+cell+function.">Tissue matrix arrays for high throughput screening and systems analysis of cell function.</a> Nature Methods. 12 (12), 1197-1204 (2015).</li><li>Tian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ-specific+metastases+obtained+by+culturing+colorectal+cancer+cells+on+tissue-specific+decellularized+scaffolds.">Organ-specific metastases obtained by culturing colorectal cancer cells on tissue-specific decellularized scaffolds.</a> Nature Biomedical Engineering. 2 (6), 443-452 (2018).</li><li>Saldin, L. T., Cramer, M. C., Velankar, S. S., White, L. J., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix+hydrogels+from+decellularized+tissues:+Structure+and+function.">Extracellular matrix hydrogels from decellularized tissues: Structure and function.</a> Acta Biomaterialia. 49, 1-15 (2017).</li><li>Hinderer, S., Layland, S. L., Schenke-Layland, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ECM+and+ECM-like+materials+&#8212;+Biomaterials+for+applications+in+regenerative+medicine+and+cancer+therapy.">ECM and ECM-like materials &#8212; Biomaterials for applications in regenerative medicine and cancer therapy.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 97, 260-269 (2016).</li><li>Young, D. A., Ibrahim, D. O., Hu, D., Christman, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Injectable+hydrogel+scaffold+from+decellularized+human+lipoaspirate.">Injectable hydrogel scaffold from decellularized human lipoaspirate.</a> Acta Biomaterialia. 7 (3), 1040-1049 (2011).</li><li>Singelyn, J. M., Christman, K. L., Littlefield, R. B., Schup-Magoffin, P. J., DeQuach, J. A., Seif-Naraghi, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Naturally+derived+myocardial+matrix+as+an+injectable+scaffold+for+cardiac+tissue+engineering.">Naturally derived myocardial matrix as an injectable scaffold for cardiac tissue engineering.</a> Biomaterials. 30 (29), 5409-5416 (2009).</li><li>Pouliot, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+characterization+of+a+naturally+derived+lung+extracellular+matrix+hydrogel.">Development and characterization of a naturally derived lung extracellular matrix hydrogel.</a> Journal of Biomedical Materials Research Part A. 104 (8), 1922-1935 (2016).</li><li>Bonvillain, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Nonhuman+Primate+Model+of+Lung+Regeneration:+Detergent-Mediated+Decellularization+and+Initial+In+Vitro+Recellularization+with+Mesenchymal+Stem+Cells.">A Nonhuman Primate Model of Lung Regeneration: Detergent-Mediated Decellularization and Initial In Vitro Recellularization with Mesenchymal Stem Cells.</a> Tissue Engineering Part A. 18 (23-24), 2437-2452 (2012).</li><li>Brown, B. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+Three+Methods+for+the+Derivation+of+a+Biologic+Scaffold+Composed+of+Adipose+Tissue+Extracellular+Matrix.">Comparison of Three Methods for the Derivation of a Biologic Scaffold Composed of Adipose Tissue Extracellular Matrix.</a> Tissue Engineering Part C: Methods. 17 (4), 411-421 (2011).</li><li>Link, P. A., Pouliot, R. A., Mikhaiel, N. S., Young, B. M., Heise, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tunable+Hydrogels+from+Pulmonary+Extracellular+Matrix+for+3D+Cell+Culture.">Tunable Hydrogels from Pulmonary Extracellular Matrix for 3D Cell Culture.</a> Journal of Visualized Experiments. (119), 1-9 (2017).</li><li>Massensini, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concentration-dependent+rheological+properties+of+ECM+hydrogel+for+intracerebral+delivery+to+a+stroke+cavity.">Concentration-dependent rheological properties of ECM hydrogel for intracerebral delivery to a stroke cavity.</a> Acta Biomaterialia. 27, 116-130 (2015).</li><li>Mierke, C. T., Frey, B., Fellner, M., Herrmann, M., Fabry, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin+5+1+facilitates+cancer+cell+invasion+through+enhanced+contractile+forces.">Integrin 5 1 facilitates cancer cell invasion through enhanced contractile forces.</a> Journal of Cell Science. 124 (3), 369-383 (2011).</li><li>Ahmadzadeh, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+the+two-way+feedback+between+contractility+and+matrix+realignment+reveals+a+nonlinear+mode+of+cancer+cell+invasion.">Modeling the two-way feedback between contractility and matrix realignment reveals a nonlinear mode of cancer cell invasion.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (9), E1617-E1626 (2017).</li></ol>

Denna metod för hydrogel bildas är till stor del beroende på mängden start vävnad. Murina multifunktionsskrivare är små, och decellularization processen resulterar i en betydande minskning av material (tabell 1). Processen kan upprepas med fler multifunktionsskrivare för att öka den slutliga avkastningen. Fräsning är ett annat viktigt steg som kan leda till förlust av material. Andra har visat framgång med en kryogen kvarn, men detta protokoll är baserat på fräsning via en handhållen mur...

Cancer kännetecknas av överskott proliferation av celler som kan kringgå apoptos och även metastasera till avlägsna platser1. Bröstcancer är en av de vanligaste formerna bland kvinnor i USA, med uppskattningsvis 266 000 nya fall och 40 000 dödsfall i 20182. En särskilt aggressiv och svår att behandla subtyp är Triple negativ bröstcancer (TNBC), som saknar östrogen receptor (ER), progesteron receptor (PR), och Human Epidermal tillväxtfaktor (HER2). Strålbehandling används ofta i bröstcancer för att eliminera kvarvarande tumörceller efter lumpectomy, men över 13% av TNBC patienter fortfarande uppleva återfall på den primära tumör plats3.
Det är känt att strålbehandling är effektivt för att lindra metastaser och recidiv eftersom kombinationen av lumpectomy och strålning resulterar i samma långsiktiga överlevnad som mastektomi4. Emellertid, det har nyligen visat att strålbehandling är förknippad med lokala recidiv till den primära tumör platsen i immunkomprometterade inställningar5,6. Dessutom är det välkänt att strålningen förändrar den extracellulära matrisen (ECM) av normal vävnad genom att framkalla fibros7. Därför är det viktigt att förstå den roll som strålning-inducerad ECM förändringar i diktera tumör cell beteende.
Decellularized vävnader har använts som in vitro-modeller för att studera sjukdom8,9. Dessa decellularized vävnader bevara ECM sammansättning och recapitulate komplexet in vivo ECM. Denna decellularized vävnad ECM kan bearbetas ytterligare och smälta att bilda rekonstituerade ECM hydrogeler som kan användas för att studera celltillväxt och funktion10,11. Till exempel, injicerbara hydrogeler härrör från decellularized humant lipoaspirate och från myokardvävnad fungerat som icke-invasiva metoder för vävnadsteknik, och en hydrogel som härrör från svin lungvävnad utnyttjades som en in vitro-metod för testning mesenkymala stamcells fäste och bärkraft12,13,14. Effekten av normala vävnads strålningsskador på ECM-egenskaper har dock inte undersökts.
Hydrogels härledda från ECM har störst potential för in vitro-studier av in vivo fenomen. Flera andra material har studerats, inklusive kollagen, fibrin, och matrigel, men det är svårt att syntetiskt recapitulate sammansättningen av ECM13. En fördel med att använda ECM-härledda hydrogeler är att ECM innehåller nödvändiga proteiner och tillväxtfaktorer för en viss vävnad14,15. Bestrålning av normal vävnad under lumpectomy orsakar betydande förändringar i ECM, och ECM-härledda hydrogeler kan användas för att studera denna effekt in vitro-. Denna metod kan leda till mer komplexa och mer exakta in vitro-modeller av sjukdom.
I denna studie, vi utsattes murina bröst fett kuddar (MFP) till strålning ex vivo. Multifunktionsskrivare var decellularized och göras till pre-gel lösning. Hydrogels bildades med inbäddade 4T1-celler, en murin TNBC-celllinje. Hydrogelmaterialets reologiska egenskaper undersöktes, och tumörcelldynamiken utvärderades i hydrogeler. Hydrogels tillverkade av bestrålade multifunktionsskrivare förstärkt tumör cell spridning. Framtida studier kommer att omfatta andra celltyper för att studera cell-cell interaktioner i samband med canceråterfall efter behandling.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>10% Neutral Buffered Formalin, Cube with Spigot</td>
			<td>VWR</td>
			<td>16004-128</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-methylbutane</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>19387</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AR 2000ex Rheometer</td>
			<td>TA Instruments</td>
			<td>10D4335</td>
			<td>rheometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A1933-25G</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>calcein acetoxymethyl (calcein AM)</td>
			<td>Molecular Probes, Inc.</td>
			<td>C1430</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Luciferin Firefly, potassium salt</td>
			<td>Biosynth Chemistry &#38; Biology</td>
			<td>L-8820</td>
			<td>(S)-4,5-Dihydro-2-(6-hydroxy-2-benzothiazolyl)-4-thiazolecarboxylic acid potassium salt</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPX Mountant for Histology</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>06522-500ML</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate-buffered saline</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14040133</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin-Y with Phloxine</td>
			<td>Richard-Allan Scientific</td>
			<td>71304</td>
			<td>eosin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ethidium homodimer</td>
			<td>Molecular Probes, Inc.</td>
			<td>E1169</td>
			<td>ethidium homodimer-1 (EthD-1)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F0926-500ML</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisher Healthcare Tissue-Plus O.C.T. Compound</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>23-730-571</td>
			<td>cryostat embedding medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount-G</td>
			<td>SouthernBiotech</td>
			<td>0100-01</td>
			<td>aqueous based mounting medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FreeZone 4.5</td>
			<td>Labconco</td>
			<td>7751020</td>
			<td>lyophilizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342 Solution (20 mM)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>62249</td>
			<td>blue fluorescent dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>258148-500ML</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IVIS Lumina III</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>CLS136334</td>
			<td>bioluminescence imaging system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimtech Science Kimwipes</td>
			<td>Kimberly Clark</td>
			<td></td>
			<td>delicate task wipes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Propanol (Peroxide-Free/Sequencing), Fisher BioReagents</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1130-500</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oil Red O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>O0625-25G</td>
			<td>1-([4-(Xylylazo)xylyl]azo)-2-naphthol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OPS Diagnostics CryoGrinder</td>
			<td>OPS Diagnostics, LLC</td>
			<td>CG-08-02</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (10X), pH 7.4</td>
			<td>Quality Biological, Inc.</td>
			<td>119-069-151</td>
			<td>Phosphate-buffered saline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pepsin from porcine gastric mucosa</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6887-5G</td>
			<td>pepsin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peracetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>77240-100ML</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin-iFluor 594 Reagent (ab176757)</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab176757</td>
			<td>phalloidin conjugate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propylene glycol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>W294004-1KG-K</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Richard-Allan Scientific Signature Series Bluing Reagent</td>
			<td>Richard-Allan Scientific</td>
			<td>7301L</td>
			<td>bluing agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Richard-Allan Scientific Signature Series Hematoxylin 7211</td>
			<td>Richard-Allan Scientific</td>
			<td>7211</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI Medium 1640</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11875-093</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate, 98%</td>
			<td>Frontier Scientific</td>
			<td>JK559522</td>
			<td>deoxycholic acid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5016</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton x-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100-100ML</td>
			<td>t-Octylphenoxypolyethoxyethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200-056</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman qualitative filter paper, Grade 4</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>1004-110</td>
			<td>grade 4 qualitative filter paper</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylenes (Certified ACS), Fisher Chemical</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>X5-4</td>
			<td>-</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

studying normal tissue radiation effects using extracellular matrix hydrogels

Strålning är en terapi för patienter med trefaldig negativ bröstcancer. Effekten av strålning på den extracellulära matrisen (ECM) av friska bröstvävnad och dess roll i lokala recidiv på den primära tumör platsen är okända. Här presenterar vi en metod för decellularization, frystorkat, och tillverkning av ECM hydrogeler härrör från murina bröst fett kuddar. Resultaten presenteras på effektiviteten i decellularization processen, och rheologiska parametrar bedömdes. GFP-och luciferase-märkta bröstcancerceller inkapslade i hydrogeler visade en ökning av spridningen i bestrålade hydrogeler. Slutligen, phalloidin konjugatfärgning var anställd för att visualisera cytoskelettet organisation av inkapslade tumörceller. Vårt mål är att presentera en metod för fabricera hydrogeler för in vitro-studie som efterliknar in vivo bröstvävnad miljö och dess svar på strålning för att studera tumör cell beteende.

MFPs var decellularized efter bestrålning med hjälp av förfarandet som visas i figur 1a. MFPs pre-decellularization (figur 1b) och post-decellularization (figur 1c) visas. Decellularization bekräftades med hjälp av hematoxylin och eosin (H & E) färgning, och 1-([4-(Xylylazo) xylyl] azo) -2-naftol färgning användes för att utvärdera lipidhalten (figur 2). Reologiska egenskaper hos ECM-hydrogeler bedömdes också ...

Watch this Scientific Journal Video about Studying Normal Tissue Radiation Effects using Extracellular Matrix Hydrogels at JoVE.com

Studying Normal Tissue Radiation Effects using Extracellular Matrix Hydrogels

Studera normal vävnad strålningseffekter med hjälp av extracellulära matrix hydrogels

Detta protokoll presenterar en metod för decellularization och efterföljande hydrogel bildandet av murina mjölkfett kuddar efter ex vivo bestrålning.

Radiation is a therapy for patients with triple negative breast cancer. The effect of radiation on the extracellular matrix (ECM) of healthy breast tissue ...

Detta protokoll visar att strålningen påverkar extracellulära matris egenskaper av fettvävnad i murine bröstfett pad. Tillsats av strålning i en decellulariseringsmodell har inte gjorts tidigare. Denna teknik använder flera tvättsteg som var och en tjänar ett unikt kemiskt syfte i decellulariseringsprocessen.Specificitet av denna teknik möjliggör skonsammare kemiska tvättar, för att bättre bevara vävnadsegenskaper. Bröstcancer återfall inträffar efter terapi, särskilt i trippel negativa fall. Utvärdera hur den bestrålade extracellulära matrisen förändrar tumör cell beteende kommer att leda till viktiga upptäckter om återkommande mekanismer.Efter bestrålning av prover, med hjälp av en cesiumkälla, överför de bestrålade MFP:arna och kompletta RPMI-medier till ett skåp för biosäkerhet. Fyll sex centimeter eller 10 centimeter rätter med tillräckligt med media för att dränka MFP-talet. Inkubera vid 37 grader Celsius, med 5%koldioxid, i två dagar.Först, placera MFP:erna i sex centimeters rätter med fem milliliter Trypsin-EDTA-lösning. Spraya och torka disken med 70%etanol och inkubera i 37 grader Celsius i en timme. Använd 0,7 milliliter silar för att tvätta MFP: s med avjoniserat vatten, genom att hälla vatten över vävnaden tre gånger.Använd tåtaningar för att manuellt massera vävnaden mellan tvättarna. Därefter torka kort vävnaden på en känslig uppgift torka och väga den. Placera de torkade vävnaderna i en förlimmad bägare, innehållande en lämplig storlek rör bar och täck vävnaderna med 60 milliliter 3%t-oktylfenoxipolyetoxiethanol per gram vävnad.Rör om i en timme i rumstemperatur. Dumpa sedan bägarens innehåll i en sil. Skölj bägaren med avjoniserat vatten och häll detta på vävnaderna.Upprepa denna sköljningsprocess ytterligare två gånger, se till att använda tåten för att manuellt massera vävnaden mellan sköljningar. Efter detta, kort torka vävnaden på en känslig uppgift torka och väga. Placera vävnaderna och rör stängerna tillbaka i samma bägare och täck dem med 60 milliliter 4%deoxycholic syra per gram vävnad.Rör om i rumstemperatur i en timme. Därefter dumpa bägarens innehåll i en nätsil, skölj bägaren med avjoniserat vatten och häll detta på vävnaderna. Upprepa denna sköljningsprocess ytterligare två gånger, se till att använda tåten för att manuellt massera vävnaden mellan sköljningar.Kort torka den sköljda vävnaden på en känslig uppgift torka och väga den. Placera de torkade vävnaderna i samma bägare, tillsammans med färskt avjoniserat vatten, kompletterat med 1%penicillin-streptomycin. Täck bägaren tätt med paraffinfilm och låt stå vid 4 grader Celsius över natten.Nästa dag dränera bägaren innehållet i en sil, kort torka vävnaden på en känslig uppgift torka och väga den. Placera sedan MFP:s i samma bägare med en lämplig storlek rör bar. Täck vävnaden med 60 milliliter av en lösning som innehåller 4%etanol och 0,1%perättiksyra per gram vävnad.Rör i rumstemperatur i två timmar. Dumpa bägarens innehåll i en 0,7 millimeters sil. Använd tåtor för att manuellt massera vävnaden och placera innehållet tillbaka i bägaren.Tvätta vävnaden genom att täcka den med 60 milliliter 1X PBS per gram vävnad. Rör om i rumstemperatur i 15 minuter. Upprepa hela denna tvättprocess en gång till.Därefter dumpa bägarens innehåll i en 0,7 millimeter sil. Med hjälp av tåtal, massera manuellt vävnaden och placera innehållet tillbaka i bägaren. Tvätta vävnaden genom att täcka den med 60 milliliter avjoniserat vatten per gram vävnad.Rör om i rumstemperatur i 15 minuter. Upprepa hela denna tvättprocess en gång till. Kort torka den tvättade vävnaden på en känslig uppgift torka och väga den.Dumpa vävnaden och innehållet i en sil och använd tåtaningar för att manuellt massera vävnaden. Placera innehållet tillbaka i bägaren och täck vävnaderna med 60 milliliter på 100%n-propanol per gram vävnad. Rör om i rumstemperatur i en timme.Sedan, kort torka vävnaden på en känslig uppgift torka och väga den. Dumpa vävnaden och innehållet i en 0,7 millimeter sil och använd forceps för att manuellt massera vävnaden. Placera innehållet tillbaka i bägaren och tvätta vävnaden genom att täcka den med 60 milliliter avjoniserat vatten per gram vävnad.Rör om i rumstemperatur i 15 minuter. Upprepa denna tvättprocess tre gånger. Efter detta, kort torka vävnaden på en känslig uppgift torka och väga den.Överför vävnaden till ett märkt 15 milliliterrör och frys vid negativa 80 grader Celsius över natten. Fyll först en grund behållare med flytande kväve. Ta ut proverna ur frysen och väg varje lyofilaterad MFP.Placera ett prov i murbruket, använd en kryogen handske för att hålla murbruket i det flytande kvävet. Använd sedan en mortelstöt, fäst vid en handhållen borr, för att fräsa provet. Kvarn i en minuts mellanrum för att kontrollera förloppet och ta bort den handskar handen från det flytande kvävet.Upprepa denna fräsningsprocess för alla prover, se till att spruta och torka av mortel och mortel med etanol mellan varje prov. Förvara de pulveriserade proverna i 15 milliliterrör vid negativ 80 grader Celsius tills de är färdiga att användas. Till att börja med ta bort proverna från frysen och tina i rumstemperatur.Medan proverna tining, blanda pepsin i saltsyra för att bilda en Pepsin-HCL lösning. Därefter lägger provpulver och Pepsin-HCL-lösningen till ett 15 milliliterrör, tillsätt en liten omrörning och rör om i 48 timmar. Efter detta, placera rören på is i fem minuter.Tillsätt 10X PBS till varje prov, sådant att den slutliga lösningen har en koncentration på 1X PBS. Tillsätt sedan 10%volym/volym, 0,1 molar natriumhydroxid till varje lösning, för att nå pH 7.4, med hjälp av pH-papper för att testa varje lösning individuellt. Med hjälp av en pH 7.4 gellösning, resuspend pelleted GFP och luciferas märkt 4T1 celler till en koncentration av antingen 500, 000 eller 1, 000, 000 celler per milliliter av gellösning.Tillsätt 16 mikroliter gelcellslösning till varje brunn av en 16-brunns kammarrutschkana och inkubera i 37 grader Celsius i 30 minuter. Efter detta, lägga till 100 mikroliter av kompletta RPMI media till varje brunn. Fortsätt att inkubera vid 37 grader Celsius i 48 timmar.Använd sedan ett fluorescensmikroskop för att observera cellerna vid en excitationsvåglängd på 519 nanometer och en emissionsvåglängd på 618 nanometer. I denna studie, normala vävnadsstrålning effekter studeras, med hjälp av extracellulära matris hydrogeler. Hematoxylin och eosinfärgning används för att bekräfta decellularisering, genom förlust av kärnor och andra spår av DNA.Medan Oil Red O färgning används för att utvärdera lipidhalt och bekräfta kvarhållandet av en dipasite morfologi. De reologiska egenskaperna hos ECM-hydrogelerna bedöms vid 37 grader Celsius. Lagringsmodulusen är högre än förlustmodulusen för alla villkorar och att visa stabil hydrogelbildande.GFP och luciferas märkta 4T1 bröstcancer carcinom celler är sedan inkapslade i hydrogels. Cellproliferation undersöks genom fluorescensmikroskopi, genom illuminescence mätningar och viabilitet färgning, 48 timmar efter inkapsling. Bestrålade hydrogels visar en ökande trend i tumör cell spridning.Phalloidin konjugat används för att visualisera F-Aktin i de inkapslade cellerna. Kom ihåg att kyla murbruket innan du placerar vävnaden inuti kvarnen, en varm murbruk kan leda till ofullständig fräsning. Var försiktig vid hantering av n-propanal och pepsin, endast öppna n-propanala och andra decellularizationary medel under en kemisk huva.Om möjligt, väg pepsin under en kemisk huva, eftersom det finns risk för inandning. ECM-sammansättningens förändringar efter bestrålning och decellularisering kan utvärderas med hjälp av masspektrometri och Raman-spektroskopi. Dessutom kan fiberstrukturen hos ECM-hydrogelerna analyseras genom svepelektronmikroskopi.Denna metod har potential att utvidgas för att undersöka effekterna av strålning på, inte bara tumörceller utan även immunceller, samt vävnader som upplever strålningsskador, som ett resultat av terapi. Denna decellularization teknik kommer att göra det möjligt för forskare att utvärdera de extracellulära matrisegenskaper av vävnaden efter strålning, vilket är ett viktigt behandlingsalternativ i de flesta cancerformer.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Analyzing the Communication Between Monocytes and Primary Breast Cancer Cells in an Extracellular Matrix Extract (ECME)-based Three-dimensional System

Analyzing the Communication Between Monocytes and Primary Breast Cancer Cells in an Extracellular Matrix Extract ECME-based Three-dimensional System

Analysera kommunikationen mellan monocyter och primär bröstcancerceller i en extracellulär Matrix extrakt (ECME)-baserat tredimensionella System

Embedded in the extracellular matrix (ECM), normal and neoplastic epithelial cells intimately communicate with hematopoietic and non-hematopoietic cells, ...

PET and MRI Guided Irradiation of a Glioblastoma Rat Model Using a Micro-irradiator

PET och MRI guidad bestrålning av en Glioblastoma råtta modell med en mikro-irradiator

For decades, small animal radiation research was mostly performed using fairly crude experimental setups applying simple single-beam techniques without ...

Imaging Approaches to Assessments of Toxicological Oxidative Stress Using Genetically-encoded Fluorogenic Sensors

Imaging metoder för bedömningar av toxikologiska oxidativ Stress använder genetiskt-kodade Fluorogenic sensorer

While oxidative stress is a commonly cited toxicological mechanism, conventional methods to study it suffer from a number of shortcomings, including ...

Fabrication of Tongue Extracellular Matrix and Reconstitution of Tongue Squamous Cell Carcinoma In Vitro

Fabrication of Tongue Extracellular Matrix and Reconstitution of Tongue Squamous Cell Carcinoma In Vitro

Tillverkning av tunga extracellulära Matrix och beredning av tungan skivepitelcancer In Vitro

In order to construct an effective and realistic model for tongue squamous cell carcinoma (TSCC) in vitro, the methods were created to produce ...

Extraction of Extracellular Vesicles from Whole Tissue

Utvinning av extracellulära blåsor från hela vävnad

Circulating and interstitial small membrane-bound extracellular vesicles (EVs) represent promising targets for the development of novel diagnostic or ...

Three-Dimensional Bone Extracellular Matrix Model for Osteosarcoma

Tredimensionella ben extracellulärmatrix modell för osteosarkom

Osteosarcoma (OS) is the most common and a highly aggressive primary bone tumor. It is characterized with anatomic and histologic variations along with ...

Cell Cycle-specific Measurement of &#947;H2AX and Apoptosis After Genotoxic Stress by Flow Cytometry

Cell Cycle-specific Measurement of ÃƒÅ½Ã‚Â³H2AX and Apoptosis After Genotoxic Stress by Flow Cytometry

Cell cykelns specifika mätningar av γH2AX och apoptos efter genotoxisk stress genom flödescytometri

The presented method or slightly modified versions have been devised to study specific treatment responses and side effects of various anti-cancer ...

Characterization of the Effects of Migrastatic Inhibitors on 3D Tumor Spheroid Invasion by High-resolution Confocal Microscopy

Karakterisering av effekterna av Migrastatiska hämmare på 3D-tumör spheroid invasion av högupplöst Konfokal mikroskopi

Drug discovery and development in cancer research is increasingly being based on drug screens in a 3D format. Novel inhibitors targeting the migratory and ...

Studying Triple Negative Breast Cancer Using Orthotopic Breast Cancer Model

Studera Triple negativ bröstcancer med ortopotopic bröstcancer modell

Triple-negative breast cancer (TNBC) is an aggressive breast cancer subtype with limited therapeutic options. When compared to patients with less ...

Studying the Effects of Tumor-Secreted Paracrine Ligands on Macrophage Activation using Co-Culture with Permeable Membrane Supports

Studera effekterna av Tumörutsöndras Paracrine ligander på Makrofagaktivering med hjälp av co-kultur med permeabla membran stöder

Tumor-derived paracrine signaling is an overlooked component of local immunosuppression and can lead to a permissive environment for continued cancer ...