Name: studying normal tissue radiation effects using extracellular matrix hydrogels
Uploaded: 2019-07-24T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Studying Normal Tissue Radiation Effects using Extracellular Matrix Hydrogels at JoVE.com

Yazarlar Gfp-ve luciferase-4t1 hücreleri sağlamak için Dr. Laura L. Bronsart teşekkür ederiz, Dr. Edward L. lagory 1 üzerinde tavsiye için-([4-(xylylazo) xylyl] azo) -2-naphthol boyama, Dr. Craig L. Duvall Ivis ve kurutucu kullanımı için, ve Dr. Scott A. guelcher Reometre için Kullanın. Bu araştırma NıH Grant #R00CA201304 tarafından mali olarak destekleniyordu.

Hayvan çalışmaları, Vanderbilt Üniversitesi Kurumsal hayvan bakımı ve kullanım Komitesi tarafından onaylanan kurumsal yönergeler ve protokollere uygun olarak yapılmıştır.
1. MFP 'lerin hazırlanması ve ex vivo ışınlama
<ol><li>Co2 boğulma kullanarak atymic Nu/nu fareler (8 – 10 hafta) kurban servikal dislocation tarafından takip.</li>
	<li>70% etanol kullanarak cildi temizleyin.</li>
	<li>Tam rpmi medya içeren 15 ml konik tüp önceden sterilize makas ve for...

<ol>
	<li>Hanahan, D., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+hallmarks+of+cancer.">The hallmarks of cancer.</a> Cell. 100 (1), 57-70 (2000).</li><li>Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+statistics,+2018.">Cancer statistics, 2018.</a> CA: A Cancer Journal for Clinicians. 68 (1), 7-30 (2018).</li><li>Lowery, A. J., Kell, M. R., Glynn, R. W., Kerin, M. J., Sweeney, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Locoregional+recurrence+after+breast+cancer+surgery:+a+systematic+review+by+receptor+phenotype.">Locoregional recurrence after breast cancer surgery: a systematic review by receptor phenotype.</a> Breast Cancer Research and Treatment. 133 (3), 831-841 (2012).</li><li>Miller, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+treatment+and+survivorship+statistics,+2016.">Cancer treatment and survivorship statistics, 2016.</a> CA: A Cancer Journal for Clinicians. 66 (4), 271-289 (2016).</li><li>Vilalta, M., Rafat, M., Giaccia, A. J., Graves, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recruitment+of+Circulating+Breast+Cancer+Cells+Is+Stimulated+by+Radiotherapy.">Recruitment of Circulating Breast Cancer Cells Is Stimulated by Radiotherapy.</a> Cell Reports. 8 (2), 402-409 (2014).</li><li>Rafat, M., Aguilera, T. A., Vilalta, M., Bronsart, L. L., Soto, L. A., von Eyben, R., Golla, M. A., Ahrari, Y., Melemenidis, S., Afghahi, A., Jenkins, M. J., Kurian, A. W., Horst, K. C., Giaccia, A. J., Graves, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages+Promote+Circulating+Tumor+Cell-Mediated+Local+Recurrence+Following+Radiation+Therapy+in+Immunosuppressed+Patients.">Macrophages Promote Circulating Tumor Cell-Mediated Local Recurrence Following Radiation Therapy in Immunosuppressed Patients.</a> Cancer Res. 75 (15), 4241-4252 (2018).</li><li>Haubner, F., Ohmann, E., Pohl, F., Strutz, J., Gassner, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wound+healing+after+radiation+therapy:+Review+of+the+literature.">Wound healing after radiation therapy: Review of the literature.</a> Radiation Oncology. 7 (1), 1-9 (2012).</li><li>Beachley, V. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+matrix+arrays+for+high+throughput+screening+and+systems+analysis+of+cell+function.">Tissue matrix arrays for high throughput screening and systems analysis of cell function.</a> Nature Methods. 12 (12), 1197-1204 (2015).</li><li>Tian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ-specific+metastases+obtained+by+culturing+colorectal+cancer+cells+on+tissue-specific+decellularized+scaffolds.">Organ-specific metastases obtained by culturing colorectal cancer cells on tissue-specific decellularized scaffolds.</a> Nature Biomedical Engineering. 2 (6), 443-452 (2018).</li><li>Saldin, L. T., Cramer, M. C., Velankar, S. S., White, L. J., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix+hydrogels+from+decellularized+tissues:+Structure+and+function.">Extracellular matrix hydrogels from decellularized tissues: Structure and function.</a> Acta Biomaterialia. 49, 1-15 (2017).</li><li>Hinderer, S., Layland, S. L., Schenke-Layland, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ECM+and+ECM-like+materials+&#8212;+Biomaterials+for+applications+in+regenerative+medicine+and+cancer+therapy.">ECM and ECM-like materials &#8212; Biomaterials for applications in regenerative medicine and cancer therapy.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 97, 260-269 (2016).</li><li>Young, D. A., Ibrahim, D. O., Hu, D., Christman, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Injectable+hydrogel+scaffold+from+decellularized+human+lipoaspirate.">Injectable hydrogel scaffold from decellularized human lipoaspirate.</a> Acta Biomaterialia. 7 (3), 1040-1049 (2011).</li><li>Singelyn, J. M., Christman, K. L., Littlefield, R. B., Schup-Magoffin, P. J., DeQuach, J. A., Seif-Naraghi, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Naturally+derived+myocardial+matrix+as+an+injectable+scaffold+for+cardiac+tissue+engineering.">Naturally derived myocardial matrix as an injectable scaffold for cardiac tissue engineering.</a> Biomaterials. 30 (29), 5409-5416 (2009).</li><li>Pouliot, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+characterization+of+a+naturally+derived+lung+extracellular+matrix+hydrogel.">Development and characterization of a naturally derived lung extracellular matrix hydrogel.</a> Journal of Biomedical Materials Research Part A. 104 (8), 1922-1935 (2016).</li><li>Bonvillain, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Nonhuman+Primate+Model+of+Lung+Regeneration:+Detergent-Mediated+Decellularization+and+Initial+In+Vitro+Recellularization+with+Mesenchymal+Stem+Cells.">A Nonhuman Primate Model of Lung Regeneration: Detergent-Mediated Decellularization and Initial In Vitro Recellularization with Mesenchymal Stem Cells.</a> Tissue Engineering Part A. 18 (23-24), 2437-2452 (2012).</li><li>Brown, B. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+Three+Methods+for+the+Derivation+of+a+Biologic+Scaffold+Composed+of+Adipose+Tissue+Extracellular+Matrix.">Comparison of Three Methods for the Derivation of a Biologic Scaffold Composed of Adipose Tissue Extracellular Matrix.</a> Tissue Engineering Part C: Methods. 17 (4), 411-421 (2011).</li><li>Link, P. A., Pouliot, R. A., Mikhaiel, N. S., Young, B. M., Heise, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tunable+Hydrogels+from+Pulmonary+Extracellular+Matrix+for+3D+Cell+Culture.">Tunable Hydrogels from Pulmonary Extracellular Matrix for 3D Cell Culture.</a> Journal of Visualized Experiments. (119), 1-9 (2017).</li><li>Massensini, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concentration-dependent+rheological+properties+of+ECM+hydrogel+for+intracerebral+delivery+to+a+stroke+cavity.">Concentration-dependent rheological properties of ECM hydrogel for intracerebral delivery to a stroke cavity.</a> Acta Biomaterialia. 27, 116-130 (2015).</li><li>Mierke, C. T., Frey, B., Fellner, M., Herrmann, M., Fabry, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin+5+1+facilitates+cancer+cell+invasion+through+enhanced+contractile+forces.">Integrin 5 1 facilitates cancer cell invasion through enhanced contractile forces.</a> Journal of Cell Science. 124 (3), 369-383 (2011).</li><li>Ahmadzadeh, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+the+two-way+feedback+between+contractility+and+matrix+realignment+reveals+a+nonlinear+mode+of+cancer+cell+invasion.">Modeling the two-way feedback between contractility and matrix realignment reveals a nonlinear mode of cancer cell invasion.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (9), E1617-E1626 (2017).</li></ol>

Hidrojel oluşumu bu yöntem büyük ölçüde başlangıç dokusu miktarına bağlıdır. Murine MFP 'ler küçüktür ve deselülarizasyon süreci malzemenin önemli ölçüde azalmasına neden olur (Tablo 1). Son verimi artırmak için daha fazla MFP ile işlem tekrarlanabilir. Frezeleme, malzemenin kaybına yol açabilecek bir başka önemli adımdır. Diğerleri bir kriyojenik değirmen ile başarı göstermiştir, ancak bu protokol bir el harç ve bir havaneli eki ile elektrikli matkap ile frezelem...

Kanser apoptozis kaçınmak ve aynı zamanda uzak sitelere metastaz hücrelerin aşırı proliferasyon ile karakterize1. Meme kanseri ABD 'de kadınlar arasında en yaygın formlardan biridir, tahmini 266.000 yeni vaka ve 40.000 ölüm ile 20182. Özellikle agresif ve alt türü tedavi etmek zor üçlü negatif meme kanseri olduğunu (TNBC), hangi östrojen reseptörü yoksun (ER), progesteron reseptör (PR), ve insan epidermal büyüme faktörü (HER2). Radyasyon terapisi, lumpektomi sonrasında kalan tümör hücrelerini ortadan kaldırmak için meme kanserinde yaygın olarak kullanılır, ancak TNBC hastalarının% 13 ' ünden fazlası primer tümör bölgesinde nüks deneyimi yaşıyor3.
Lumpektomi ve radyasyon kombinasyonu mastektomi olarak aynı uzun vadeli hayatta kalma nedeniyle radyasyon tedavisinin metastaz ve nüks azaltıcı etkili olduğu bilinmektedir4. Bununla birlikte, son zamanlarda radyasyon tedavisinin, immünoterapi sağlayan ayarlarda primer tümör sitesine yerel nüks ile ilişkili olduğu gösterildi5,6. Ayrıca, radyasyon fibrozis inducing tarafından normal doku (ECM) ekstrasellüler matris değiştirir bilinmektedir7. Bu nedenle, tümör hücresi davranışlarını dikte ederek radyasyona bağlı ECM değişikliklerinin rolünü anlamak önemlidir.
Deselülarize dokularda hastalık8,9çalışma in vitro modelleri olarak kullanılmıştır. Bu deselülarized dokular ECM bileşimi korumak ve Complex in vivo ECM reapitulate. Bu deselülarize edilen doku ECM 'si, hücre büyümesini ve fonksiyonunu incelemek için kullanılabilecek yeniden oluşturulmuş ECM Hidrojeller oluşturmak için daha fazla işlenmiş ve sindirilebilir10,11. Örneğin, deselülarized insan lipoaspirate ve miyokard dokusundan elde edilen enjekte edilebilir hidrogeller, non-invaziv doku mühendisliği yöntemleri olarak hizmet vermiştir ve bir in vitro test yöntemi olarak domuz akciğer dokusundan elde edilen bir hidrojel kullanılmıştır mezenkimal kök hücre ataşmanı ve canlılığı12,13,14. Ancak, normal doku radyasyon hasarının ECM özelliklerine etkisi araştırılmamıştır.
ECM 'den elde edilen Hidrojeller, in vivo fenomenlerin in vitro çalışması için en büyük potansiyele sahiptir. Kollajen, fibrin ve matrigel de dahil olmak üzere birçok başka malzeme incelenmiştir, ancak ECM13' ün bileşimi için sentetik olarak reapitleştirmek zordur. ECM 'nin türevi hidrojellerin kullanmanın bir avantajı ECM 'nin belirli bir doku için gerekli proteinleri ve büyüme faktörlerini içerdiğinden14,15. Lumpektomi sırasında normal dokuların ışınlanması ECM 'de önemli değişikliklere neden olur ve ECM-türevi Hidrojeller bu etkiyi içinde vitro olarak incelemek için kullanılabilir. Bu yöntem, hastalığın daha karmaşık ve daha doğru in vitro modellerinde yol açabilir.
Bu çalışmada, duvar meme yağ yastıkları (MFP) radyasyon ex vivo maruz. MFP 'ler deselülarize edilmiş ve ön jel çözeltisi halinde yapılmıştır. Hydrogels Embedded 4T1 hücreler, bir murine TNBC hücre hattı ile kuruldu. Hidrojel materyalinin reolojik özellikleri incelenmiştir ve tümör hücre dinamikleri Hidrojeller içinde değerlendirildi. Radyasyon radyal MFPs gelişmiş tümör hücre proliferasyon imal. Gelecekteki çalışmalar, tedavi sonrasında Kanser nüks bağlamında hücre-hücre etkileşimlerini incelemek için diğer hücre türlerini dahil edecektir.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>10% Neutral Buffered Formalin, Cube with Spigot</td>
			<td>VWR</td>
			<td>16004-128</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-methylbutane</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>19387</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AR 2000ex Rheometer</td>
			<td>TA Instruments</td>
			<td>10D4335</td>
			<td>rheometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A1933-25G</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>calcein acetoxymethyl (calcein AM)</td>
			<td>Molecular Probes, Inc.</td>
			<td>C1430</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Luciferin Firefly, potassium salt</td>
			<td>Biosynth Chemistry &#38; Biology</td>
			<td>L-8820</td>
			<td>(S)-4,5-Dihydro-2-(6-hydroxy-2-benzothiazolyl)-4-thiazolecarboxylic acid potassium salt</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPX Mountant for Histology</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>06522-500ML</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate-buffered saline</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14040133</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin-Y with Phloxine</td>
			<td>Richard-Allan Scientific</td>
			<td>71304</td>
			<td>eosin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ethidium homodimer</td>
			<td>Molecular Probes, Inc.</td>
			<td>E1169</td>
			<td>ethidium homodimer-1 (EthD-1)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F0926-500ML</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisher Healthcare Tissue-Plus O.C.T. Compound</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>23-730-571</td>
			<td>cryostat embedding medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount-G</td>
			<td>SouthernBiotech</td>
			<td>0100-01</td>
			<td>aqueous based mounting medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FreeZone 4.5</td>
			<td>Labconco</td>
			<td>7751020</td>
			<td>lyophilizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342 Solution (20 mM)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>62249</td>
			<td>blue fluorescent dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>258148-500ML</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IVIS Lumina III</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>CLS136334</td>
			<td>bioluminescence imaging system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimtech Science Kimwipes</td>
			<td>Kimberly Clark</td>
			<td></td>
			<td>delicate task wipes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Propanol (Peroxide-Free/Sequencing), Fisher BioReagents</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1130-500</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oil Red O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>O0625-25G</td>
			<td>1-([4-(Xylylazo)xylyl]azo)-2-naphthol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OPS Diagnostics CryoGrinder</td>
			<td>OPS Diagnostics, LLC</td>
			<td>CG-08-02</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (10X), pH 7.4</td>
			<td>Quality Biological, Inc.</td>
			<td>119-069-151</td>
			<td>Phosphate-buffered saline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pepsin from porcine gastric mucosa</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6887-5G</td>
			<td>pepsin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peracetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>77240-100ML</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin-iFluor 594 Reagent (ab176757)</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab176757</td>
			<td>phalloidin conjugate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propylene glycol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>W294004-1KG-K</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Richard-Allan Scientific Signature Series Bluing Reagent</td>
			<td>Richard-Allan Scientific</td>
			<td>7301L</td>
			<td>bluing agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Richard-Allan Scientific Signature Series Hematoxylin 7211</td>
			<td>Richard-Allan Scientific</td>
			<td>7211</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI Medium 1640</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11875-093</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate, 98%</td>
			<td>Frontier Scientific</td>
			<td>JK559522</td>
			<td>deoxycholic acid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5016</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton x-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100-100ML</td>
			<td>t-Octylphenoxypolyethoxyethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200-056</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman qualitative filter paper, Grade 4</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>1004-110</td>
			<td>grade 4 qualitative filter paper</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylenes (Certified ACS), Fisher Chemical</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>X5-4</td>
			<td>-</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

studying normal tissue radiation effects using extracellular matrix hydrogels

Radyasyon Üçlü negatif meme kanseri olan hastalar için bir terapidir. Radyasyon, sağlıklı meme dokusu ve primer tümör bölgesinde lokal nüks rolündeki rol dışı matris (ECM) üzerinde etkisi bilinmiyor. Burada, duvar meme yağlı pedlerden elde edilen ECM hidrojellerin deselülarizasyon, lyophilization ve imalatı için bir yöntem sunuyoruz. Bulgular deselülarizasyon sürecinin etkinliğinde sunulmuştur ve reolojik parametreler değerlendirildi. GFP-ve luciferase-etiketli meme kanseri hücreleri hydrojels içinde kapsüllenmiş hidrojellerin proliferasyon bir artış göstermiştir. Son olarak, phalloidin Konjugat boyama kapsüllenmiş tümör hücrelerinin siterit organizasyonu görselleştirmek için kullanıldı. Hedefimiz, tümör hücresi davranışlarını incelemek için in vivo meme dokusu ortamını ve radyasyona olan tepkisini taklit eden in vitro çalışma için Hidrojeller üretebilmek için bir yöntem sunmadır.

MFP 'ler Şekil 1a'da gösterilen prosedürü kullanarak ışınlama sonrasında deselülarize edildi. MFPs öncesi deselülarizasyon (Şekil 1B) ve sonrası Deselülarizasyon (Şekil 1C) gösterilir. Deselülarizasyon hematoksislin ve eozin (H & E) boyama kullanılarak onaylandı ve 1-([4-(Xylylazo) xylyl] azo) -2-naphthol boyama lipid içeriğini değerlendirmek için kullanıldı (Şekil 2). ECM hidrojellerin reolojik ...

Watch this Scientific Journal Video about Studying Normal Tissue Radiation Effects using Extracellular Matrix Hydrogels at JoVE.com

Studying Normal Tissue Radiation Effects using Extracellular Matrix Hydrogels

Ekstrasellüler matris Hidrogeller kullanarak normal doku radyasyon etkileri eğitim

Bu protokol, deselülarizasyon ve ex vivo ışınlama sonrasında murine meme Yağ pedleri sonraki hidrojel oluşumu için bir yöntem sunar.

Radiation is a therapy for patients with triple negative breast cancer. The effect of radiation on the extracellular matrix (ECM) of healthy breast tissue ...

Bu protokol radyasyon murine meme yağ yastığı yağ dokusunun ekstrasellüler matriks özelliklerini etkilediğini göstermektedir. Bir decellularization modelinde radyasyon ilavesi daha önce yapılmamıştir. Bu teknik, her biri hücre dışılaştırma sürecinde benzersiz bir kimyasal amaca hizmet birkaç yıkama adımları kullanır.Bu tekniğin özgüllüğü daha iyi doku özelliklerini korumak için, nazik kimyasal yıkar sağlar. Meme kanseri nüks tedavi sonrasında oluşur, özellikle üçlü negatif olgularda. Irradiated ekstrasellüler matriks tümör hücre davranışını nasıl değiştirir değerlendirilmesi nüks mekanizmaları hakkında önemli keşifler yol açacaktır.Örnekler infüzyon sonra, bir sezyum kaynağı kullanarak, bir biyogüvenlik kabine içine ışınlanmış MFP ve tam RPMI medya aktarın. MFP'leri batıracak kadar ortamla altı santimetre veya 10 santimetrelik tabakları doldurun. 37 derecede kuluçkaya yat, %5 karbondioksitle, iki gün boyunca.İlk olarak, Trypsin-EDTA çözeltisi beş mililitre ile altı santimetre yemekleri MFP yerleştirin. Sprey ve bir saat boyunca 37 santigrat derece% 70 etanol ve kuluçka ile bulaşıkları silin. MFP'leri üç kez dokuüzerine su dökerek deiyonize suyla yıkamak için 0,7 mililitrelik süzgeçler kullanın.Yıkarlar arasında dokuel masaj için forceps kullanın. Daha sonra, kısa bir süre hassas bir görev silin ve tartmak üzerinde doku kuru. Kurutulmuş dokuları, uygun büyüklükte bir stir bar içeren bir ön otoklav kabına yerleştirin ve doku gramı başına %3 t-octylphenoxypolyethoxyetanol 60 mililitre ile dokuları kaplayın.Oda sıcaklığında bir saat karıştırın. Sonra kabın içindekileri bir süzgeçe at. Kabı deiyonize suyla durulayın ve bunu dokuların üzerine dökün.Bu durulama işlemini iki kez daha tekrarlayın, rinses arasında dokuel masaj için forceps kullandığınızdan emin olun. Bundan sonra, kısa bir süre hassas bir görev silin ve tartmak üzerinde doku kuru. Dokuları ve karıştırma çubuklarını aynı beare geri yerleştirin ve bunları doku gramı başına %4 deoksikolik asit 60 mililitre ile kaplayın.Bir saat oda sıcaklığında karıştırın. Daha sonra, bir örgü süzgeç içine kabın içeriğini dökümü, deiyonize su ile beher durulayın ve dokuların üzerine dökün. Bu durulama işlemini iki kez daha tekrarlayın, rinses arasında dokuel masaj için forceps kullandığınızdan emin olun.Kısa bir süre hassas bir görev üzerinde durulanan doku kuru ve tartmak. Aynı beher içine kurutulmuş dokular yerleştirin, taze deiyonize su ile birlikte, 1% penisilin-streptomisin ile desteklenmektedir. Kabı parafin filmle sıkıca kapatın ve bir gecede 4 derece santigrat derecede bırakın.Ertesi gün bir süzgeç içine beher içeriğini drenaj, kısa bir süre hassas bir görev silin ve tartmak üzerinde doku kuru. Daha sonra, MFP uygun büyüklükte bir karıştırma çubuğu ile aynı beher yerleştirin. Dokuyu gram doku başına %4 etanol ve %0,1 perastik asit içeren bir çözeltinin 60 mililitresi ile kapatın.İki saat oda sıcaklığında karıştırın. Kabın içindekileri 0.7 milimetrelik bir süzgeçe boşaltın. Dokuya elle masaj yapmak ve içindekileri kabın içine yerleştirmek için forceps kullanın.Doku gram başına 1X PBS 60 mililitre ile kaplayarak doku yıkayın. 15 dakika oda sıcaklığında karıştırın. Tüm bu yıkama işlemini bir kez daha tekrarlayın.Sonra, kabın içindekileri 0,7 milimetrelik bir süzgeçe boşaltın. Forceps kullanarak, el ile doku masaj ve kabın içine içeriğini geri yerleştirin. Doku gram başına deiyonize su 60 mililitre ile kaplayarak doku yıkayın.15 dakika oda sıcaklığında karıştırın. Tüm bu yıkama işlemini bir kez daha tekrarlayın. Yıkanmış dokuyu hassas bir görev üzerine kısa bir süre kurutun ve tarttı.Bir süzgeç içine doku ve içeriğini dökümü ve el ile doku masaj için forceps kullanın. İçeriği tekrar kabın içine yerleştirin ve dokugramı başına 100%n-propanol 60 mililitre ile dokuları kaplayın. Bir saat oda sıcaklığında karıştırın.Sonra, kısa bir süre hassas bir görev silin ve tartmak üzerinde doku kuru. Doku ve içeriğini 0,7 milimetrelik bir süzgeçe boşaltın ve dokuya elle masaj yapmak için çalgılar kullanın. İçeriği tekrar kabın içine yerleştirin ve dokuyu gram doku başına 60 mililitre deiyonize su ile kaplayarak yıkayın.15 dakika oda sıcaklığında karıştırın. Bu yıkama işlemini üç kez tekrarlayın. Bundan sonra, kısa bir süre hassas bir görev silin ve tartmak üzerinde doku kuru.Dokuyu etiketli 15 mililitrelik bir tüpe aktarın ve bir gecede negatif 80 derecede donun. İlk olarak, sıvı nitrojen ile sığ bir kap doldurun. Numuneleri dondurucudan çıkarın ve her lyophilized MFP tartın.Harç bir örnek yerleştirin, sıvı azot içinde harç tutmak için bir kriyojenik eldiven kullanın. Daha sonra, numuneyi frezelemek için el yapımı bir matkapla bağlı bir pestisit kullanın. İlerlemeyi kontrol etmek ve eldivenli eli sıvı nitrojenden çıkarmak için bir dakika aralıklarla değirmen.Tüm numuneler için bu frezeleme işlemini tekrarlayın, her numune nin arasında harç ve havaneli etanol ile püskürttüğe ve silindiğinden emin olun. Toz numuneleri 15 mililitrelik tüplerde kullanıma hazır olana kadar negatif 80 santigrat derecede saklayın. Başlamak için, dondurucudan örnekleri çıkarın ve oda sıcaklığında çözülün.Numuneler çözülürken, pepsin'i hidroklorik aside karıştırarak Pepsin-HCL çözeltisi oluşturun. Sonra, 15 mililitrelik bir tüp için örnek toz ve Pepsin-HCL çözeltisi ekleyin, küçük bir karıştırma çubuğu ekleyin ve 48 saat karıştırın. Bundan sonra, beş dakika buz üzerinde tüpler yerleştirin.Her numuneye 10X PBS ekleyin, böylece nihai çözelti 1X PBS konsantrasyonuna sahiptir. Daha sonra, her çözeltiyi ayrı ayrı test etmek için pH kağıt kullanarak pH 7.4'e ulaşmak için her çözeltiye %10 hacim/hacim, 0,1 molar sodyum hidroksit ekleyin. Bir pH 7.4 jel çözeltisi kullanarak, peletli GFP ve luciferase etiketli 4T1 hücrelerini mililitre başına 500, 000 veya 1, 000, 000 hücreli bir konsantrasyona geri alın.16 kuyulu bir hazneslayt her kuyuya jel hücre çözeltisi 16 mikrolitre ekleyin ve 30 dakika boyunca 37 derece santigrat de kuluçka. Bundan sonra, her kuyuya 100 mikrolitre tam RPMI ortamı ekleyin. 48 saat boyunca 37 derecede kuluçkaya yat.Daha sonra, hücreleri 519 nanometre ve 618 nanometre emisyon dalga boyunda gözlemlemek için bir floresan mikroskobu kullanın. Bu çalışmada, normal doku radyasyonu etkileri çalışılmıştır, ekstrasellüler matris hidrojeller kullanılarak. Hematoksilin ve eozin boyama decellularization onaylamak için kullanılır, çekirdekleri ve DNA diğer izleri kaybı yoluyla.Yağ Kırmızı O boyama lipid içeriğini değerlendirmek ve bir dipasite morfolojisi tutma onaylamak için kullanılır iken. ECM hidrojellerinin reolojik özellikleri 37 santigrat derecede değerlendirilir. Depolama modülü tüm koşullar için kayıp modülünden daha yüksektir ve hidrojel oluşumunu gösterir.GFP ve luciferase etiketli 4T1 meme karsinom hücreleri daha sonra hidrojellerde kapsüllenir. Hücre proliferasyonu floresan mikroskobu, illuminesans ölçümleri ve canlılık boyama ile, kapsülleme den 48 saat sonra incelenir. Işınlanmış hidrojeller tümör hücre çoğalmasında artan bir eğilim göstermektedir.Phalloidin konjuge kapsüllü hücrelerde F-Actin görselleştirmek için kullanılır. Değirmen içine doku yerleştirmeden önce harç soğutmak için unutmayın, sıcak bir harç eksik frezeleme yol açabilir. N-propanal ve pepsin kullanırken dikkatli olun, sadece bir kimyasal başlık altında n-propanal ve diğer desellüler ajanlar açın.Mümkünse, bir kimyasal başlık altında pepsin tartMak, teneffüs tehlikesi olduğu gibi. Işınlama ve hücreleşme sonrası ECM bileşimi değişiklikleri kütle spektrometresi ve Raman spektroskopisi ile değerlendirilebilir. Ayrıca ECM hidrojellerinin lif yapısı taramalı elektron mikroskobu ile analiz edilebilir.Bu yöntem, radyasyonun sadece tümör hücreleri değil, aynı zamanda bağışıklık hücreleri ve tedavi sonucunda radyasyon hasarı yaşayan dokular üzerindeki etkilerini incelemek için genişletilme potansiyeline sahiptir. Bu decellularization tekniği araştırmacılar radyasyon aşağıdaki dokunun ekstrasellüler matriks özelliklerini değerlendirmek için izin verecektir, hangi çoğu kanserlerde önemli bir tedavi seçeneğidir.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Analyzing the Communication Between Monocytes and Primary Breast Cancer Cells in an Extracellular Matrix Extract (ECME)-based Three-dimensional System

Analyzing the Communication Between Monocytes and Primary Breast Cancer Cells in an Extracellular Matrix Extract ECME-based Three-dimensional System

Monosit ve bir hücre dışı matriks içinde birincil meme kanseri hücreleri arasındaki iletişimi analiz özü (ECME)-üç boyutlu sistem tabanlı

Embedded in the extracellular matrix (ECM), normal and neoplastic epithelial cells intimately communicate with hematopoietic and non-hematopoietic cells, ...

PET and MRI Guided Irradiation of a Glioblastoma Rat Model Using a Micro-irradiator

Bir mikro-irradiator kullanarak Glioblastoma fare modeli ışınlama güdümlü evde beslenen hayvan ve MRI

For decades, small animal radiation research was mostly performed using fairly crude experimental setups applying simple single-beam techniques without ...

Imaging Approaches to Assessments of Toxicological Oxidative Stress Using Genetically-encoded Fluorogenic Sensors

Genetik olarak kodlanmış Fluorogenic sensörleri kullanarak toksikolojik oksidatif stres ilişkin Değerlendirmeler yaklaşımlar görüntüleme

While oxidative stress is a commonly cited toxicological mechanism, conventional methods to study it suffer from a number of shortcomings, including ...

Fabrication of Tongue Extracellular Matrix and Reconstitution of Tongue Squamous Cell Carcinoma In Vitro

Fabrication of Tongue Extracellular Matrix and Reconstitution of Tongue Squamous Cell Carcinoma In Vitro

Dil hücre dışı matriks ve dil Skuamöz Hücre Karsinomu Vitro sulandırma imalatı

In order to construct an effective and realistic model for tongue squamous cell carcinoma (TSCC) in vitro, the methods were created to produce ...

Extraction of Extracellular Vesicles from Whole Tissue

Hücre dışı veziküller çekme--dan tüm doku

Circulating and interstitial small membrane-bound extracellular vesicles (EVs) represent promising targets for the development of novel diagnostic or ...

Three-Dimensional Bone Extracellular Matrix Model for Osteosarcoma

Üç boyutlu kemik hücre dışı matriks modeli osteosarkom için

Osteosarcoma (OS) is the most common and a highly aggressive primary bone tumor. It is characterized with anatomic and histologic variations along with ...

Cell Cycle-specific Measurement of &#947;H2AX and Apoptosis After Genotoxic Stress by Flow Cytometry

Cell Cycle-specific Measurement of ÃƒÅ½Ã‚Â³H2AX and Apoptosis After Genotoxic Stress by Flow Cytometry

ΓH2AX ve Apoptosis'in Genotoksik Stres sonrası Akış Sitometrisi ile Hücre Döngüsüne Özgü Ölçümü

The presented method or slightly modified versions have been devised to study specific treatment responses and side effects of various anti-cancer ...

Characterization of the Effects of Migrastatic Inhibitors on 3D Tumor Spheroid Invasion by High-resolution Confocal Microscopy

Migrastatik İnhibitörlerin 3Boyutlu Tümör Spheroid İnvazyonu Üzerine Etkilerinin Yüksek Çözünürlüklü Konfokal Mikroskopi Ile Karakterizasyonu

Drug discovery and development in cancer research is increasingly being based on drug screens in a 3D format. Novel inhibitors targeting the migratory and ...

Studying Triple Negative Breast Cancer Using Orthotopic Breast Cancer Model

Ortotopik Meme Kanseri Modeli Kullanarak Üçlü Negatif Meme Kanseri Eğitimi

Triple-negative breast cancer (TNBC) is an aggressive breast cancer subtype with limited therapeutic options. When compared to patients with less ...

Studying the Effects of Tumor-Secreted Paracrine Ligands on Macrophage Activation using Co-Culture with Permeable Membrane Supports

Permeable Membran Destekleri ile Co-Culture kullanarak Tümör Salgılanan Parakrin Ligandların Makrofaj Aktivasyonu Üzerine Etkilerinin İnceleştirilmesi

Tumor-derived paracrine signaling is an overlooked component of local immunosuppression and can lead to a permissive environment for continued cancer ...