Name: identification of orexin and endocannabinoid receptors in adult zebrafish using immunoperoxidase and immunofluorescence methods
Uploaded: 2019-06-25T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Identification of Orexin and Endocannabinoid Receptors in Adult Zebrafish Using Immunoperoxidase and Immunofluorescence Methods at JoVE.com

وقد دعمت هذه الدراسة من قبل Fondi Ricerca di Ateneo (FRA) 2015-2016، جامعة سانيو.

1. بروتوكول المناعة
ملاحظة: تم الحصول على سمكة الحمار الوحشي من قبل البروفيسور أوميد سفاري (قسم المصايد، كلية الموارد الطبيعية والبيئة، جامعة فردوسي مشهد، مشهد، إيران)10.
<ol><li>تشريح الأنسجة
	<ol>
<li>التضحية بسمك حمار وحشي عن طريق الغمر في الماء المثلج (5 أج...

إعداد عينة
يعد إعداد العينات الخطوة الحاسمة الأولى في IHC. بروتوكول موثوق به يسمح للحفاظ على مورفولوجيا الخلايا، وبنية الأنسجة، ومكافحة الجينات. تتطلب هذه الخطوة جمع الأنسجة الصحيحة، والتثبيت، وتقسيم22،23. الغرض من التثبيت هو الح?...

المناعية هي (IHC) هو أسلوب كلاسيكي راسخة تستخدم لتحديد مكونات الخلوية أو الأنسجة (المستضدات) عن طريق تفاعل الأجسام المضادة المستضد1،2. ويمكن استخدامه لتحديد توطين وتوزيع الجزيئات الحيوية المستهدفة داخل الأنسجة. IHC يستخدم التفاعلات المناعية والكيميائية للكشف عن المستضدات في أقسام الأنسجة3. وتشمل العلامات الرئيسية المستخدمة في تصور التفاعلات الأجسام المضادة المستضد الأصباغ الفلورسنت (الفلور وناعي) وتفاعلات لون الركيزة الانزيم (المناعية، وكلاهما مترافق مع الأجسام المضادة4. باستخدام المراقبة المجهرية من الممكن تحديد توطين الأنسجة المسماة، والذي يتوافق تقريبا مع توطين مستضد الهدف في الأنسجة.
توجد طريقتان لتفاعلات الفلورسنت أو الكرومية للكشف عن البروتين: طريقة الكشف المباشر، التي يتم فيها تسمية الأجسام المضادة الأولية المحددة مباشرة؛ وطريقة الكشف غير المباشر، التي يتم فيها unconjugated الأجسام المضادة الأولية في حين أن الأجسام المضادة الثانوية يحمل التسمية5،6،7. الأسلوب غير المباشر له بعض المزايا، والتي هي أساسا تضخيم الإشارة. وعلاوة على ذلك، وخلافا لغيرها من التقنيات الجزيئية والخلوية، مع الفلور المناعي، فمن الممكن لتصور التوزيع، والترجمة، وتعبير مشترك من اثنين أو أكثر من البروتينات معبرة بشكل تفاضلي داخل الخلايا والأنسجة7. يعتمد اختيار طريقة الكشف المستخدمة على التفاصيل التجريبية.
حتى الآن، IHC يستخدم على نطاق واسع في البحوث الأساسية كأداة قوية وأساسية لفهم توزيع وتوطين المؤشرات الحيوية والتنميط العام للبروتينات المختلفة في الأنسجة البيولوجية من الإنسان إلى اللافقاريات8، 9 , 10 , 11. تساعد هذه التقنية على عرض خريطة للتعبير البروتيني في عدد كبير من الأعضاء الحيوانية الطبيعية والمتغيرة وأنواع الأنسجة المختلفة، مما يدل على احتمال انخفاض أو ارتفاع تنظيم التعبير الناجم عن التغيرات الفسيولوجية والمرضية. IHC هو تقنية حساسة للغاية تتطلب الدقة والاختيار الصحيح للأساليب للحصول على النتائج المثلى12. أولا وقبل كل شيء، يمكن أن تؤدي العديد من العوامل المختلفة مثل التثبيت، والتفاعل المتبادل، واسترجاع مستضد، وحساسية الأجسام المضادة إلى إشارات سلبية إيجابية كاذبة وكاذبة13. اختيار الأجسام المضادة هي واحدة من أهم الخطوات في IHC ويعتمد على خصوصية مستضد وتقاربه مع البروتين والأنواع قيد التحقيق7.
في الآونة الأخيرة، قمنا بتحسين تقنية IHC للكشف عن أعضاء أنظمة أوريكسين /هيبوكرين وإندوكانابينويد في أنسجة حمار وحشي للبالغين. لقد ركزنا بشكل رئيسي على التثبيت، وتضمين الأنسجة باستخدام نهجين مختلفين، وتقسيم وتركيب (التي يمكن أن تؤثر على الدقة والتفاصيل أثناء التحليل المجهري)، وحجب (لمنع إيجابيات كاذبة والحد من الخلفية)14. الخصائص الهامة الأخرى هي خصوصية الأجسام المضادة والانتقائية وإمكانية استنساخ بروتوكولات IHC الفردية. مفتاح توفير خصوصية الأجسام المضادة هو استخدام الضوابط السلبية (بما في ذلك لا الأجسام المضادة الأولية أو الأنسجة التي يعرف أنها لا تعبر عن البروتينات المستهدفة) وكذلك الضوابط الإيجابية (بما في ذلك الأنسجة التي من المعروف أن تعبر عن البروتينات المستهدفة)15 . يتم اختيار الأجسام المضادة لIHC على أساس نوع محدد (احتمال أنها تتفاعل مع مستضد الفائدة) والأجسام المضادة المضادة للكشف عن أنظمة الكشف التي تستخدم4،5،6 7. في حالة مناعي، يتم تحديد لون رد الفعل عن طريق اختيار الكروموسومات المعجل، وعادة ثنائي أمينوبنزيدين (البني)16. من ناحية أخرى، يستخدم immunofluorescence الأجسام المضادة المترافقة مع فلوروفور لتصور التعبير البروتين في أقسام الأنسجة المجمدة ويسمح لتحليل سهلة من البروتينات متعددة فيما يتعلق نظام الكشف الكروموجينيك 5 , 7.
في تقنية مناعية، يتم اقتران الأجسام المضادة الثانوية بالبيوتين، وهو جزيء من الوصلات قادر على تجنيد جزيء مراسل كرومي المنشأ [مجمع فيفين-بيوتين (ABC)]، مما يؤدي إلى تضخيم إشارة تلطيخ. مع طريقة مراسل ABC، يتفاعل الإنزيم البيروكسيديز مع 3،3'-ثنائيأمينو بنزيدين (DAB)، مما ينتج تلطيخ اللون البني بشكل مكثف حيث يرتبط الإنزيم بالأجسام المضادة الثانوية، والتي يمكن تحليلها بعد ذلك بمجهر ضوء عادي. ABC تلطيخ، بسبب تقارب عالية من avidin للالبيوتين، وتنتج رد فعل سريع والأمثل، مع عدد قليل من الأجسام المضادة الثانوية تعلق على موقع التفاعل الأجسام المضادة الأولية. تسمح طريقة الكشف الزحيجية هذه بتحليل كثافة الإشارة، حيث توفر بيانات شبه كمية تستند إلى ارتباط مستويات الإشارة البني بمستويات التعبير البروتيني18.
مع تقنيات الفلور المناعي، يمكن الكشف المتزامن عن البروتينات المتعددة نظرًا لقدرة الفلوروكروم المختلفة على انبعاث الضوء على أطوال موجية فريدة من نوعها، ولكن من المهم اختيار الفلوروكروم بعناية لتقليل التداخل الطيفي 5- وعلاوة على ذلك، فإن استخدام الأجسام المضادة الأولية في مختلف الأنواع المضيفة يقلل من الصعوبات المتعلقة بالتفاعل المتبادل. في هذه الحالة، كل الأجسام المضادة الثانوية الخاصة بالأنواع تعترف بنوع واحد فقط من الأجسام المضادة الأولية. المراسلون الفلورسنت هي جزيئات عضوية صغيرة، بما في ذلك المشتقات التجارية، مثل أصباغ أليكسا فلور.
وتستخدم العديد من النماذج الحيوانية لفهم الظروف الفسيولوجية والمرضية معينة. حتى الآن، ثبت أن يتم حفظ العديد من المسارات الأيضية على مدى التطور. ولذلك ، يمكن لدراسات IHC في الكائنات الحية النموذجية مثل حمار وحشي توفير نظرة ثاقبة في نشأة وصيانة الظروف المرضية وغير المرضية17. ومن أهداف هذا التقرير توضيح بروتوكولات IHC التي يمكن تنفيذها على أنسجة أسماك حمار وحشي للبالغين وتستخدم للحصول على صور مفصلة لتوزيع وتوطين OXA وOX-2R وCB1R على المستويين المحيطي والمركزي. كما أُبلغ عن بروتوكولات لتطبيق طريقتين رئيسيتين غير مباشرتين من أساليب IHC في الأنسجة المحيطية والمركزية لسمك حمار وحشي بالغ. ويوصف هو الأسلوب غير المباشر، الذي يسمح لتضخيم إشارة في الحالات التي يتم فيها اقتران الأجسام المضادة الثانوية إلى صبغة الفلورسنت (طريقة الفلور المناعي) أو مراسل الإنزيم (طريقة immunoperoxidase). وتملك كل من أساليب الكشف عن الكروموجينيك والفلورسنت مزايا وعيوب. وذكرت في هذا البروتوكول هو استخدام IHC، أساسا الفلور المناعي، في حمار وحشي الكبار، وهو نموذج الحيوان المستخدمة على نطاق واسع لدراسة النظم التي يتم حفظها التطورية عبر الظروف الفسيولوجية والمرضية المختلفة.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anti CB1</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab23703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti OX-2R</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-8074</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-OXA</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc8070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aquatex</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1,085,620,050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylated rabbit anti-goat</td>
			<td>Vector Lab</td>
			<td>BA-5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>citric acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>251275</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Nikon Eclipse Ti2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat</td>
			<td>Leica Biosystem</td>
			<td>CM3050S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>32670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital Camera</td>
			<td>Leica Biosystem</td>
			<td>DFC320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital Camera for confocal microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>DS-Qi2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti goat Alexa fluor 488-conjugated secondary antibodies</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A11055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti goat Alexa fluor 594-conjugated secondary antibodies</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A11058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti rabbit Alexa fluor 488-conjugated secondary antibodies</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A21206</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti rabbit Alexa fluor 594-conjugated secondary antibodies</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A21207</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol absolute</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20,821,330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Frozen section compound</td>
			<td>Leica Biosystem</td>
			<td>FSC 22 Frozen Section Media</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H2O2</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>31642</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20,252,290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImmPACT DAB</td>
			<td>Vector lab</td>
			<td>SK4105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Leica Biosystem</td>
			<td>DMI6000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td>Leica Biosystem</td>
			<td>RM2125RT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S9763</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4H2O</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S9638</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S8045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Donkey Serum</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D9663</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Rabbit Serum</td>
			<td>Vector lab</td>
			<td>S-5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>paraffin wax</td>
			<td>Carlo Erba</td>
			<td>46793801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraphormaldeyde</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium citrate dihydrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>W302600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Fluka Analytical</td>
			<td>93420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VectaStain Elite ABC Kit</td>
			<td>Vector lab</td>
			<td>PK6100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene Pure</td>
			<td>Carlo Erba</td>
			<td>392603</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of orexin and endocannabinoid receptors in adult zebrafish using immunoperoxidase and immunofluorescence methods

الكيمياء المناعية (IHC) هي تقنية حساسة للغاية ومحددة تشارك في الكشف عن المستضدات المستهدفة في أقسام الأنسجة مع الأجسام المضادة المسماة. وهي عملية متعددة الخطوات حيث التحسين من كل خطوة أمر بالغ الأهمية للحصول على إشارة محددة الأمثل. ومن خلال IHC، يمكن الكشف عن توزيع وتوطين المؤشرات الحيوية المحددة، مما يكشف عن معلومات عن الحفظ التطوري. وعلاوة على ذلك، يسمح IHC لفهم التعبير وتوزيع التغيرات من المؤشرات الحيوية في الحالات المرضية، مثل السمنة. IHC، أساسا تقنية الفلور المناعي، يمكن استخدامها في حمار وحشي الكبار للكشف عن تنظيم وتوزيع الجزيئات المحفوظة في الحساسية، ولكن بروتوكول IHC القياسية ليست estasblished. أوريكسين وإندوكانابينويد هما نظامان مُحافظان بشدة على التحكم في تناول الطعام وأمراض السمنة. ذكرت هنا هي بروتوكولات تستخدم للحصول على معلومات حول الببتيد أوريكسين (OXA), مستقبلات أوريكسين (OX-2R), ومستقبلات القنب (CB1R) توطين وتوزيع في الأمعاء والدماغ من نماذج أسماك حمار وحشي الكبار الطبيعية والناجمة عن النظام الغذائي (DIO). كما تم وصف طرق للمناعة ومزدوج الفلور المناعي، فضلا عن إعداد الكواشف، والتثبيت، وتضمين البارافين، والحماية بالتبريد من أنسجة حمار وحشي والاستعداد لخطوة حجب النشاط الذاتية والخلفية مكافحة البقع. يتم الحصول على مجموعة كاملة من المعلمات من التجارب IHC السابقة، والتي من خلالها أظهرنا كيف يمكن أن يساعد الفلور المناعي في فهم OXs، OX-2R، وتوزيع CB1R، وتوطين، والحفاظ على التعبير في أسماك حمار وحشي للبالغين الانسجه. الصور الناتجة مع كثافة إشارة محددة للغاية أدى إلى تأكيد أن حمار وحشي هي نماذج الحيوانات المناسبة للدراسات المناعية الكيميائية للتوزيع، وتوطين، والحفاظ التطوري للعلامات الحيوية محددة في الظروف الفسيولوجية والمرضية. البروتوكولات المعروضة هنا ينصح لتجارب IHC في حمار وحشي الكبار.

وتظهر البيانات التمثيلية لتلطيخ المناعة في الشكل 1 والشكل 2. تحليل الهيزوميكائي المناعي لتوزيع OX-A وOX-2R في القناة الهضمية للسمك الوحشي الكبار أظهرت مواقع توطين مختلفة من OX-A وOX-2R وزيادات في التعبير في الخلايا المعوية من دي ويدي زيبرافيش. لوحظت تلطيخ بني مكثف ?...

Watch this Scientific Journal Video about Identification of Orexin and Endocannabinoid Receptors in Adult Zebrafish Using Immunoperoxidase and Immunofluorescence Methods at JoVE.com

Identification of Orexin and Endocannabinoid Receptors in Adult Zebrafish Using Immunoperoxidase and Immunofluorescence Methods

تحديد مستقبلات أوريكسين وإندوكانابينويد في أسماك حمار وحشي للبالغين باستخدام المناعية وطريقة الفلور المناعي

وترد هنا بروتوكولات للتوصيف المناعي وتوطين الببتيد أوريكسين، مستقبلات أوريكسين، ومستقبلات إندوكانابينويد في الأمعاء وأدمغة من السمنة الطبيعية والناجمة عن النظام الغذائي (DIO) نماذج حمار وحشي الكبار باستخدام المناعية ومزدوج وسائل الفلور المناعي.

Immunohistochemistry (IHC) is a highly sensitive and specific technique involved in the detection of target antigens in tissue sections with labeled ...

حاليا، يتم استخدام الكيمياء المناعية مع زيادة وتيرة لتحديد وجود علامات جزيئية محددة والتغيرات في حالة الأمراض، مما يعطي الجذر لإمكانية إجراء تحليل كمي. وتستخدم الكيمياء المناعية، وأساسا تقنية المناعةfluorescence، في اليرقات ونموذج الحمار الوحشي الكبار، ولكن لا يعرف سوى القليل عن بروتوكول المناعة الجيدة للحمار الوحشي. هنا، نحن وصف وتوضيح بروتوكول التي يمكن استخدامها لدراسة الحفظ التطوري للبروتينات الهامة في حمار وحشي بالغ.بروتوكول جيد للكيمياء المناعية في حمار وحشي بالغ يمكن أن تساعد على أساس فائدة هذا النموذج الحيواني لدراسة التعبير المورفولوجي وتوزيع الجزيئات الحيوية المحافظة للغاية. يمكن أن تساعد هذه الطريقة أيضًا في تحليل التعديلات المحتملة لهذه الجزيئات الحيوية بسبب الحالات المرضية المرتبطة بطب فيزيولوجيا المرضي البشري. ومن خلال هذا الإجراء، ستكون الدكتورة ليا تونسي، طالبة دكتوراه من مختبري.لبدء هذا الإجراء، نقل كتل الأنسجة المجمدة المعدة إلى التبريد في ناقص 20 درجة مئوية. قطع كتلة في أقسام الإكلالي أو القوس من 10 ميكرومتر. ثم، وجمع الأنسجة في أقسام المسلسل البديل على الشرائح الزجاج لاصقة مناسبة للكيمياء المناعية، وتخزينها في ناقص 20 درجة مئوية حتى جاهزة للمضي قدما.أولاً، استخدم قلماً مقاوماً للمذيبات لترسيم منطقة الأنسجة على الشريحة. شطف الأقسام ثلاث مرات لمدة خمس دقائق كل باستخدام 0.1-مولار عازلة الفوسفات. بعد ذلك، حل 0.3 ملليلتر من تريتون X-100 في 100 ملليلتر من 0.1-مولار الفوسفات العازلة لإعداد تريتون X-100 0.3٪ حل 0.1٪ مصل حمار طبيعي في عازلة الفوسفات التي تحتوي على 0.3٪ تريتون X-100 لإعداد الحل حظر.احتضان المقاطع مع حل مصل حمار العادي المذاب في permeabilization العازلة PB-Triton X-100 0.3٪ لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ل Permeabilize غشاء الخلية ومنع مواقع الربط غير محددة. أولاً، شطف الأقسام ثلاث مرات لمدة خمس دقائق لكل منها مع 0.1-مولار الفوسفات العازلة. أضف مزيجًا من الأجسام المضادة الأولية المخففة في PB-T، وحضن الأقسام بين عشية وضحاها في صندوق رطب في درجة حرارة الغرفة.في اليوم التالي ، شطف الأقسام ثلاث مرات لمدة خمس دقائق لكل منها مع 0.1 -مضروس الفوسفات العازلة. احتضان الأقسام في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعتين في مزيج مناسب من الأجسام المضادة الثانوية المخففة في PB-T. للبدء ، شطف المقاطع ثلاث مرات لمدة خمس دقائق مع كل 0.1 - عازلة فوسفات المولر.حل 1.5 ميكرولترات من DAPI في ثلاثة ملليلتر من الفوسفات العازلة لإعداد DAPI صبغة نووية. مضادّة اقطع في الصبغة. ثم، استخدام متوسطة التركيب لتغطي الشرائح لتحقيق الاستقرار في الأنسجة وصمة عار للاستخدام على المدى الطويل.يمكن تخزين عينات الفلورسنت في الظلام عند أربع درجات مئوية. كرر بروتوكول المناعةfluorescence، وإما حذف الأجسام المضادة الأولية أو الثانوية، أو استبدال antiserum الأساسية أو الثانوية مع عازلة الفوسفات لإعداد السيطرة السلبية. بعد ذلك، كرر بروتوكول الفلوروسنس المناعي، وامتصاص كل جسم مضاد أساسي مسبقًا مع وجود فائض من الببتيد النسبي.كرر بروتوكول الفلوروسين المناعي على شرائح من دماغ الماوس لإعداد السيطرة الإيجابية. باستخدام مجهر confocal مجهزة مرحلة X-Y-Z الآلية, كاميرا رقمية, واكتساب وتحليل البرمجيات, مراقبة وتحليل المقاطع المثبطة للمناعة. الحصول على الصور الرقمية مع أهداف 5x و 20x و 40x.التقاط صور لكل قسم في التكبير منخفضة في كل من القنوات المتاحة لتكوين المونتاج منخفضة التكبير. تطبيع الصور الفلورية إلى أقصى درجات التباين والتراكب. في جميع أنحاء منطقة الاهتمام ، وجمع المسلسل Z - أكوام من الصور من خلال ست طائرات التنسيق مع الخطوات المحورية من واحد إلى 1.8 ميكرومتر.تنفيذ هذه المجموعة لكل قناة على حدة. بعد ذلك ، استخدم برنامج فك الفولتية لـ فك الوضوح للصور من خلال تطبيق 10 تكرارات ، وطي صور المستوى Z التسلسلية في صورة إسقاط قصوى واحدة. استخدم برنامج تحرير الصور المناسب لضبط الصور الدقيقة للضوء والتباين.يُظهر التحليل المناعي الكيميائي لتوزيع OX-A وOX-2R في القناة الهضمية للسممر الوحشي البالغ مواقع توطين مختلفة لـ OX-A و OX-2R وزيادة التعبير في الخلايا المعوية لسمك الحمار الوحشي ديو. لوحظ تلطيخ بني مكثف لـ OX-A في خلايا الأمعاء المتوسطة والأمعاء الأمامية. يعطي التعبير المناعي لـ OX-A إشارات واضحة في مقصورات الأمعاء المختلفة ، ويتناقص من الأمامي نحو الأمعاء الوسيطة.ويلاحظ نتائج مماثلة لOX-2R immunoexpression في الأمعاء من ديو والسيطرة على الحمية حمار وحشي. ويرافق زيادة إشارة OX-A في ديو حمار وحشي بالغ من قبل فرط التعبير من OX-2R في مقصورات الأمعاء الأخرى. تحليل دقيق لصور مناعية يظهر زيادة OX-2R/CB1R الكولوكية في الأمعاء من ديو حمار وحشي بالغ مقارنة مع الحمار الوحشي التحكم في النظام الغذائي.ويلاحظ حالة مماثلة في مناطق الدماغ المختلفة، مثل التيلسيفال الظهري، تحت المهاد، tectum البصرية، التاركاليس التروس، ونواة منتشر من الفص السفلي. عن طريق مضاعفة التحسس بالمناعة مع أوريكسين-A وCB1R التكلس, ويلاحظ أن هناك زيادة في الكوليكساليثان في الخلايا العصبية orexinergic من تحت المهاد, يرافقه زيادة أوريكسين-A إشارة الفلورسنت. تظهر هذه النتائج كيف يمكن أن تساعد الفلوروسينة المناعية المزدوجة في تحديد التعبير البروتيني المحفوظ فسيولوجيًا ، وتكلس البروتينات المستهدفة ، وتغييرات توزيعها و / أو التعبير عنها في الظروف المرضية المختلفة.باستخدام الفلورا المناعية ، يمكننا فهم أفضل لتشارك في توزيع الجزيئات الحيوية وتفاعلاتها المحتملة ، ويمكننا أيضًا الحصول على صورة مرئية لتغيراتها في حالة الأمراض المختلفة. وعلاوة على ذلك، قد التوزيع العصبية الاستئصالية للتعبير انزيم الأيضي أو مستقبلات تكشف عن دور بروتين إشارة داخل الأنسجة. وقد أدخل العمل التقني الحالي نهج الفلوروسنس المناعي لدراسة نظامين محافظين للغاية، وهما الأوريكسين والأندوكانتابيويدات، في استخدام نموذج حمار وحشي بالغ.باستخدام هذا البروتوكول الموصوف هنا لأول مرة في الدماغ من الحمار الوحشي الكبار، لم يتم تحديد التوزيع التشريحي وcoexpression من مستقبلات orexin-2 ومستقبلات إندوكانابينويد-CB1. نوصي البروتوكولات المذكورة هنا لإجراء تجارب الكيمياء المناعية والكشف عن التوزيع المكاني وتنظيم المستقبلات في الببتيدات في حمار وحشي بالغ لفهم أفضل لوظائفها.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Identification of Fatty Acids in Bacillus cereus

Identification of Fatty Acids in Bacillus cereus

تحديد الأحماض الدهنية في<em&gt; العصوية الشمعية</em

The Bacillus species contain branched chain and unsaturated fatty acids (FAs) with diverse positions of the methyl branch (iso or anteiso) and of the ...

Identification of Plant Ice-binding Proteins Through Assessment of Ice-recrystallization Inhibition and Isolation Using Ice-affinity Purification

تحديد البروتينات النباتية الجليد ملزمة من خلال تقييم تثبيط الآيس التبلور وعزل عن طريق الآيس تقارب تنقية

Ice-binding proteins (IBPs) belong to a family of stress-induced proteins that are synthesized by certain organisms exposed to subzero temperatures. In ...

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

إعداد نموذج لتحديد الهوية الجماعية على أساس قياس الطيف الكتلي للجيش الملكي النيبالي-ربط المناطق

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

The Identification of Sea Lamprey Pheromones Using Bioassay-Guided Fractionation

تحديد الفيرومونات لامبرى البحر باستخدام تجزئة تسترشد الحشري

Bioassay-guided fractionation is an iterative approach that uses the results of physiological and behavioral bioassays to guide the isolation and ...

Capture and Identification of RNA-binding Proteins by Using Click Chemistry-assisted RNA-interactome Capture (CARIC) Strategy

Capture and Identification of RNA-binding Proteins by Using Click Chemistry-assisted RNA-interactome Capture CARIC Strategy

التقاط وتحديد البروتينات الحمض النووي الريبي ملزم باستخدام نقرة الكيمياء-وساعدت الجيش الملكي النيبالي-إينتيراكتومي التقاط استراتيجية (كاريك)

A comprehensive identification of RNA-binding proteins (RBPs) is key to understanding the posttranscriptional regulatory network in cells. A widely used ...

Identification of Novel CK2 Kinase Substrates Using a Versatile Biochemical Approach

تحديد ركائز كيناز CK2 الرواية باستخدام نهج بيوكيميائية تنوعاً

The study of kinase-substrate relationships is essential to gain a complete understanding of the functions of these enzymes and their downstream targets ...

Nitropeptide Profiling and Identification Illustrated by Angiotensin II

توصيف وتعريف الببتيد الموضحة من قبل أنجيوتنسين الثاني

Protein nitration is one of the most important post-translational modifications (PTM) on tyrosine residues and it can be induced by chemical actions of ...

SUMO-Binding Entities (SUBEs) as Tools for the Enrichment, Isolation, Identification, and Characterization of the SUMO Proteome in Liver Cancer

SUMO-Binding Entities SUBEs as Tools for the Enrichment, Isolation, Identification, and Characterization of the SUMO Proteome in Liver Cancer

كيانات السومو الملزمة (SUBEs) كاداات لإثراء وعزل وتحديد وتوصيف بروتين السومو في سرطان الكبد

Post-translational modification is a key mechanism regulating protein homeostasis and function in eukaryotic cells. Among all ubiquitin-like proteins in ...

Profiling Ubiquitin and Ubiquitin-like Dependent Post-translational Modifications and Identification of Significant Alterations

تنميط اوبيكويتين و اوبيكويتين-مثل التعديلات اللاحقة الانتقالية وتحديد التعديلات الهامه

Ubiquitin (ub) and ubiquitin-like (ubl) dependent post-translational modifications of proteins play fundamental biological regulatory roles within the ...

Visualization of Estrogen Receptors in Colons of Mice with TNBS-Induced Crohn's Disease using Immunofluorescence

تصور مستقبلات هرمون الاستروجين في كولونات الفئران مع مرض كرون TNBS الناجم ة باستخدام الفلورسينالمناعي

Crohn&#39;s disease is the most diagnosed type of inflammatory bowel disease. Chronic inflammation developing in the intestine leads to peristalsis ...