Name: identification of orexin and endocannabinoid receptors in adult zebrafish using immunoperoxidase and immunofluorescence methods
Uploaded: 2019-06-25T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Identification of Orexin and Endocannabinoid Receptors in Adult Zebrafish Using Immunoperoxidase and Immunofluorescence Methods at JoVE.com

Deze studie werd ondersteund door Fondi ricerca di Ateneo (FRA) 2015-2016, Universiteit van Sannio.

1. immunoperoxidasekleuring Protocol
Nota: zebravis werd verkregen door Prof. Omid Safari (Ministerie van visserij, Faculteit van natuurlijke rijkdommen en milieu, Ferdowsi Universiteit van Mashhad, Mashhad, Iran)10.
<ol><li>Weefsel dissectie
	<ol>
<li>Offer de zebravis door onderdompeling in ijswater (5 delen ijs/1 deel water, 4 °C); laat ze tot beëindiging van alle verkeer om de dood te waarborgen door hypoxie.</li>
		<li>Verwijder snel de darm en...

Monstervoorbereiding
De voorbereiding van de steekproef is de eerste kritieke stap in IHC. Een betrouwbare protocol zorgt voor het onderhoud van de cel morfologie, weefsel architectuur, en antigenicity. Deze stap vereist juiste weefsel inzameling, bevestiging, en sectioning22,23. Het doel van fixatie is het behoud van weefsel en het verminderen van de werking van weefsel enzymen of micro-organismen. In het bijzo...

Immunohistochemistry (IHC) is een goed gevestigde klassieke techniek die wordt gebruikt om cellulaire of weefsel componenten (antigenen) te identificeren door antigeen-antilichaam interactie1,2. Het kan worden gebruikt om de lokalisatie en distributie van target biomoleculen te identificeren in een tissue. IHC gebruikt immunologische en chemische reacties om antigenen op te sporen in weefselsecties3. De belangrijkste tellers die voor de visualisatie van antigeen-antilichaam interactie worden gebruikt omvatten fluorescente kleurstoffen (immunofluorescentie) en enzym-substraat kleuren Reacties (immunoperoxidasekleuring), allebei geconjugeerd aan antilichamen4. Het gebruiken van microscopische observatie is mogelijk om de localisatie van geëtiketteerd weefsel te bepalen, dat ongeveer aan localisatie van het doel antigeen in het weefsel beantwoordt.
Twee methodes bestaan voor fluorescente of chromogene reacties om proteïne te ontdekken: de directe opsporingsmethode, waarin het specifieke primaire antilichaam direct wordt geëtiketteerde; en de indirecte opsporingsmethode, waarin het primaire antilichaam ongeconjugeerd is terwijl het secundaire antilichaam het etiket5,6,7draagt. De indirecte methode heeft sommige voordelen, die hoofdzakelijk zijn signaal versterking is. Bovendien, in tegenstelling tot andere moleculaire en cellulaire technieken, met immunofluorescentie, is het mogelijk om de distributie, de localisatie, en de coexpressie van twee of meer proteïnen te visualiseren die differentieel binnen cellen en weefsels worden uitgedrukt7. De keuze van de gebruikte detectiemethode is afhankelijk van experimentele Details.
Tot op heden, wordt IHC wijd gebruikt in fundamenteel onderzoek als krachtig en essentieel hulpmiddel om de distributie en de localisatie van biomarkers en het algemene profileren van verschillende proteïnen in biologisch weefsel van mens aan ongewervelden te begrijpen8, 9 , 10 , 11. de techniek helpt een kaart van eiwituitdrukking in een groot aantal normale en veranderde dierlijke organen en verschillende weefseltypes tonen, die mogelijke beneden-of omhoog-regulering van uitdrukking tonen die door fysiologische en pathologische veranderingen wordt veroorzaakt. IHC is een zeer gevoelige techniek die nauwkeurigheid en de juiste keuze van methoden vereist om optimale resultaten te verkrijgen12. Eerst en vooral, kunnen vele verschillende factoren zoals bevestiging, dwars-reactiviteit, antigeen herwinning, en gevoeligheid van antilichamen tot valse positieve en valse negatieve signalen13leiden. De selectie van de antilichamen is één van de belangrijkste stappen in IHC en hangt van de antigeenspecificiteit en zijn affiniteit af aan de proteïne en de soorten onder onderzoek7.
Onlangs, hebben wij de IHC techniek geoptimaliseerd om leden van orexin/hypocretine en endocannabinoïde systemen in volwassen zebravis weefsel te ontdekken. We hebben vooral gericht op fixatie, weefsel inbedding met behulp van twee verschillende benaderingen, secties en montage (die van invloed kunnen zijn resolutie en detail tijdens microscopische analyse), en het blokkeren (om valse positieven te voorkomen en te verminderen achtergrond)14. Andere belangrijke kenmerken zijn de antilichamenspecificiteit en selectiviteit en reproduceerbaarheid van individuele IHC protocollen. De sleutel tot het verstrekken van antilichaam specificiteit is het gebruik van negatieve controles (met inbegrip van geen primaire antilichamen of weefsel waarvan bekend is dat niet de doelstelling eiwitten uitdrukken), alsmede positieve controles (met inbegrip van weefsel dat bekend is om de doel-eiwitten uit te drukken)15 . De selectie van antilichamen voor IHC wordt gemaakt op basis van hun soort-specificiteit (de waarschijnlijkheid waarmee zij met het antigeen van belang reageren) en de antigeen-antilichaam bindende opsporingssystemen die4,5,6 worden gebruikt ,7. In het geval van immunoperoxidasekleuring, wordt de kleur van de reactie bepaald door selectie van neerslaan chromogeen, gewoonlijk diaminobenzidine (bruin)16. Enerzijds, gebruikt immunofluorescence antilichamen die met een fluorophor worden vervoegd om eiwituitdrukking in bevroren weefselsecties te visualiseren en maakt voor gemakkelijke analyse van veelvoudige proteïnen met betrekking tot het chromogene opsporingssysteem mogelijk 5 , 7.
In de immunoperoxidasekleuring techniek, het secundaire antilichaam is geconjugeerd aan biotine, een linker molecuul in staat van aanwerving van een chromogene reporter molecule [avidin-Biotine complex (ABC)], wat leidt tot versterking van de kleuring signaal. Met de ABC reporter methode, reageert het enzym peroxidase met 3, 3 '-diaminobenzidine (schar), producerend een intens bruin-gekleurde kleuring waar het enzym aan het secundaire antilichaam bindt, dat dan met een gewone lichte Microscoop kan worden geanalyseerd. ABC die, wegens de hoge affiniteit van avidin voor Biotine bevlekt, veroorzaakt een snelle en optimale reactie, met weinig secundaire antilichamen verbonden aan de plaats van de primaire antilichaam reactiviteit. Deze chromogene detectiemethode zorgt voor de densitometric analyse van het signaal, het verstrekken van semi-kwantitatieve gegevens op basis van de correlatie van bruine signaalniveaus met eiwitexpressie niveaus18.
Met immunofluorescentie technieken, gelijktijdige opsporing van veelvoudige proteïnen is mogelijk toe te schrijven aan de capaciteit van verschillende fluorochromes om licht bij unieke golflengten uit te stoten, maar is belangrijk om fluorochromes zorgvuldig te kiezen om spectrale overlapping te minimaliseren 5. Bovendien minimaliseert het gebruik van primaire antilichamen in verschillende gastheer soorten problemen met betrekking tot cross-reactiviteit. In dit geval, erkent elk soort-specifiek secundair antilichaam slechts één type van primair antilichaam. Fluorescerende verslaggevers zijn kleine organische moleculen, waaronder commerciële derivaten, zoals Alexa Fluor kleurstoffen.
Vele dierlijke modellen worden gebruikt om bepaalde fysiologische en pathologische voorwaarden te begrijpen. Tot op heden is vastgesteld dat veel metabole routes worden bewaard in de loop van de evolutie. Daarom kan IHC studies in modelorganismen zoals zebravis inzicht verschaffen in het ontstaan en het onderhoud van pathologische en niet-pathologische omstandigheden17. Het is een doel van dit rapport om IHC-protocollen te illustreren die kunnen worden uitgevoerd op volwassen zebravis weefsel en worden gebruikt om gedetailleerde beelden te verkrijgen van de distributie en lokalisatie van OXA, OX-2R en CB1R op perifere en centrale niveaus. Ook gemeld zijn protocollen voor de toepassing van twee grote IHC indirecte methoden in perifere en centrale weefsels van volwassen zebravis. Beschreven is de indirecte methode, die voor signaal versterking in gevallen toestaat waar een secundair antilichaam aan een fluorescente kleurstof (immunofluorescentie methode) of enzym Reporter (immunoperoxidasekleuring methode) wordt vervoegd. Zowel chromogene als fluorescente opsporingsmethodes bezitten voordelen en nadelen. Gerapporteerd in dit protocol is het gebruik van IHC, hoofdzakelijk immunofluorescentie, in volwassen zebravis, een dierlijk model dat wijd wordt gebruikt om systemen te bestuderen die evolutief behouden over verschillende fysiologische en pathologische voorwaarden zijn.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anti CB1</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab23703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti OX-2R</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-8074</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-OXA</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc8070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aquatex</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1,085,620,050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylated rabbit anti-goat</td>
			<td>Vector Lab</td>
			<td>BA-5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>citric acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>251275</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Nikon Eclipse Ti2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat</td>
			<td>Leica Biosystem</td>
			<td>CM3050S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>32670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital Camera</td>
			<td>Leica Biosystem</td>
			<td>DFC320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital Camera for confocal microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>DS-Qi2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti goat Alexa fluor 488-conjugated secondary antibodies</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A11055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti goat Alexa fluor 594-conjugated secondary antibodies</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A11058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti rabbit Alexa fluor 488-conjugated secondary antibodies</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A21206</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti rabbit Alexa fluor 594-conjugated secondary antibodies</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A21207</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol absolute</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20,821,330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Frozen section compound</td>
			<td>Leica Biosystem</td>
			<td>FSC 22 Frozen Section Media</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H2O2</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>31642</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20,252,290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImmPACT DAB</td>
			<td>Vector lab</td>
			<td>SK4105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Leica Biosystem</td>
			<td>DMI6000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td>Leica Biosystem</td>
			<td>RM2125RT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S9763</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4H2O</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S9638</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S8045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Donkey Serum</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D9663</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Rabbit Serum</td>
			<td>Vector lab</td>
			<td>S-5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>paraffin wax</td>
			<td>Carlo Erba</td>
			<td>46793801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraphormaldeyde</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium citrate dihydrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>W302600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Fluka Analytical</td>
			<td>93420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VectaStain Elite ABC Kit</td>
			<td>Vector lab</td>
			<td>PK6100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene Pure</td>
			<td>Carlo Erba</td>
			<td>392603</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of orexin and endocannabinoid receptors in adult zebrafish using immunoperoxidase and immunofluorescence methods

Immunohistochemistry (IHC) is een zeer gevoelige en specifieke techniek betrokken bij de opsporing van doel-antigenen in weefselsecties met gelabelde antilichamen. Het is een multistep proces waarbij de optimalisering van elke stap cruciaal is om het optimale specifieke signaal te verkrijgen. Via IHC kunnen de distributie en lokalisatie van specifieke biomarkers worden gedetecteerd, waarbij informatie over evolutionaire instandhouding wordt onthuld. Bovendien staat IHC in voor het begrijpen van expressie-en distributie veranderingen van biomerkers in pathologische omstandigheden, zoals obesitas. IHC, hoofdzakelijk de immunofluorescentie techniek, kan gebruikt worden bij volwassen zebravis om de organisatie en distributie van door de moleculen bewaarde stoffen te detecteren, maar een standaard IHC-protocol is niet estasblished. Orexin en endocannabinoïde zijn twee sterk behouden systemen die betrokken zijn bij de controle van voedselinname en obesitas pathologie. Gemeld hier zijn protocollen die worden gebruikt om informatie te verkrijgen over orexin peptide (OXA), orexin receptor (OX-2R), en cannabinoïde receptor (CB1R) lokalisatie en distributie in de darm en de hersenen van de normale en dieet-geïnduceerde zwaarlijvige (DIO) volwassen zebravis modellen. Ook beschreven zijn methoden voor immunoperoxidasekleuring en dubbele immunofluorescentie, alsmede de voorbereiding van reagentia, fixatie, paraffine-inbedding, en cryoprotection van zebravis weefsel en de voorbereiding voor een endogene activiteit-blokkerende stap en achtergrond counterstaining. De volledige set van parameters is verkregen uit eerdere IHC experimenten, waardoor we hebben laten zien hoe immunofluorescentie kan helpen met het begrijpen van OXs, OX-2R, en CB1R distributie, lokalisatie, en het behoud van expressie in volwassen zebravis Weefsels. De resulterende beelden met zeer specifieke signaalintensiteit leidden tot de bevestiging dat zebravis geschikte dierlijke modellen voor immunohistochemische studies van distributie, localisatie, en evolutief behoud van specifieke biomarkers in fysiologische en pathologische omstandigheden. De hier gepresenteerde protocollen worden aanbevolen voor IHC experimenten bij volwassen zebravis.

Representatieve gegevens voor de immunoperoxidasekleuring kleuring worden weergegeven in Figuur 1 en Figuur 2. Immunohistochemische analyse van OX-A en OX-2R distributie in de darm van volwassen zebravis toonde verschillende lokalisatie sites van OX-A en OX-2R en hun toename in expressie in de intestinale cellen van DIO zebravis. Een intense bruine kleuring voor OX-A werd waargenomen in de cellen van de mediale en voorste darm (Figuur 1a</st...

Watch this Scientific Journal Video about Identification of Orexin and Endocannabinoid Receptors in Adult Zebrafish Using Immunoperoxidase and Immunofluorescence Methods at JoVE.com

Identification of Orexin and Endocannabinoid Receptors in Adult Zebrafish Using Immunoperoxidase and Immunofluorescence Methods

Identificatie van Orexin en endocannabinoïde receptoren bij volwassen zebravis met behulp van immunoperoxidasekleuring en immunofluorescentie methoden

Hier gepresenteerd zijn protocollen voor immunohistochemische karakterisering en lokalisatie van orexin peptide, orexin receptoren, en endocannabinoïde receptoren in de darm en hersenen van normale en dieet-geïnduceerde obesitas (DIO) Adult zebravis modellen met behulp van immunoperixidase en dubbele immunofluorescentie methodes.

Immunohistochemistry (IHC) is a highly sensitive and specific technique involved in the detection of target antigens in tissue sections with labeled ...

Momenteel wordt immunohistochemie steeds vaker gebruikt om de aanwezigheid van specifieke moleculaire markers en hun veranderingen in het geval van pathologieën te identificeren, waardoor de mogelijkheid om kwantitatieve analyse uit te voeren, wortel geeft. Immunohistochemie, voornamelijk de immunofluorescentietechniek, wordt gebruikt in de larve en het volwassen zebravisdiermodel, maar er is weinig bekend over een goed standaard immunohistochemieprotocol voor zebravissen. Hier beschrijven en illustreren we een protocol dat kan worden gebruikt om de evolutionaire instandhouding van belangrijke eiwitten in volwassen zebravissen te bestuderen.Een goed protocol voor immunohistochemie bij volwassen zebravissen kan helpen om ten grondslag te liggen aan het nut van dit diermodel om de morfologische expressie en distributie van hooggeconserveerde biomoleculen te bestuderen. Deze methode kan ook helpen bij het analyseren van mogelijke veranderingen van deze biomoleculen als gevolg van pathologische omstandigheden gecorreleerd aan de menselijke fysiopathologie. Het aantonen van de procedure zal Dr.Lea Tunisi zijn, een promovendus uit mijn laboratorium.Om deze procedure te beginnen, breng je de voorbereide bevroren weefselblokken over naar een cryostat bij min 20 graden Celsius. Snijd het blok in coronale of sagittale secties van 10 micrometer. Verzamel vervolgens de weefsels in alternatieve seriële secties op lijmglasplaten die geschikt zijn voor immunohistochemie en bewaar ze op min 20 graden Celsius tot ze klaar zijn om verder te gaan.Gebruik eerst een oplosmiddelbestendige pen om het weefselgebied op de glijbaan af tebakenen. Spoel de secties drie keer gedurende vijf minuten elk met behulp van 0,1-molaire fosfaatbuffer. Los vervolgens 0,3 milliliter Triton X-100 op in 100 milliliter fosfaatbuffer van 0,1 molaire fosfaat om Triton X-100 0,3% voor te bereiden, Los 0,1% normaal ezelserum op in fosfaatbuffer met 0,3%Triton X-100 om de blokkeringsoplossing voor te bereiden.Incubeer de secties met de oplossing van normaal ezelserum opgelost in permeabilisatiebuffer PB-Triton X-100 0,3%gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur om het celmembraan te doorgronden en de niet-specifieke bindingsplaatsen te blokkeren. Eerst spoel de secties drie keer gedurende vijf minuten elk met 0,1-molaire fosfaatbuffer. Voeg het mengsel van primaire antilichamen verdund in PB-T, en incubeer de secties 's nachts in een vochtige doos bij kamertemperatuur.De dag erna spoel je de secties drie keer gedurende vijf minuten met elk 0,1-molaire fosfaatbuffer. Incubeersecties bij kamertemperatuur gedurende twee uur in een geschikte mix van secundaire antilichamen verdund in PB-T. Om te beginnen, spoel de secties drie keer gedurende vijf minuten elk met 0,1-molaire fosfaatbuffer.Los 1,5 microliter DAPI op in drie milliliter fosfaatbuffer om de kernstof DAPI voor te bereiden. Tegenstain de secties in de kleurstof. Gebruik vervolgens de montage medium to coverslip de dia's om het weefsel en de vlek te stabiliseren voor langdurig gebruik.Fluorescerende monsters kunnen worden opgeslagen in het donker op vier graden Celsius. Herhaal het immunofluorescentieprotocol en laat het primaire of secundaire antilichaam weg, of vervang het primaire of secundaire antiserum door fosfaatbuffer om de negatieve controle voor te bereiden. Herhaal vervolgens het immunofluorescentieprotocol en absorbeer elk primair antilichaam vooraf met een overmaat van het relatieve peptide.Herhaal het immunofluorescentieprotocol op plakjes muishersenen om de positieve controle voor te bereiden. Met behulp van een confocale microscoop uitgerust met een X-Y-Z gemotoriseerde fase, een digitale camera, en acquisitie en analyse software, observeren en analyseren van de immunostained secties. Verwerf digitale afbeeldingen met de 5x, 20x en 40x doelstellingen.Maak foto's van elke sectie bij een lage vergroting in elk van de beschikbare kanalen om een montage met een lage vergroting samen te stellen. Normaliseer de fluorescentiebeelden tot maximaal contrast en overlay. Verzamelen in het hele gebied van belang, verzamel seriële Z-stapels beelden door zes brandpuntsvlakken met brandpuntsstappen van één tot 1,8 micrometer.Voer deze verzameling voor elk kanaal afzonderlijk uit. Gebruik hierna imaging deconvolution software om afbeeldingen te deconvolveeren door toepassing van 10 iteraties en vouw de seriële Z-vlakafbeeldingen samen tot één maximaal projectiebeeld. Gebruik een geschikte beeldbewerkingssoftware om de micrografen aan te passen voor licht en contrast.Immunohistochemische analyse van OX-A en OX-2R verdeling in de darm van volwassen zebravissen toont verschillende lokalisatielocaties van OX-A en OX-2R en hun toename in expressie in de darmcellen van DIO zebravissen. Een intense bruine kleuring voor OX-A wordt waargenomen in de cellen van de mediale en voorste darm. De immunoexpressie van OX-A geeft duidelijke signalen in de verschillende darmcompartimenten, afnemend van het voorste naar de mediale darm.Vergelijkbare resultaten worden waargenomen voor OX-2R immunoexpressie in de darm van DIO en controle dieet zebravissen. Een verhoogd OX-A signaal bij DIO volwassen zebravissen gaat gepaard met de overexpressie van OX-2R in andere darmcompartimenten. Nauwkeurige analyse van immunofluorescente beelden toont de toename van OX-2R/CB1R colocalisatie in de darm van DIO volwassen zebravissen in vergelijking met het controledieet zebravissen.Een soortgelijke situatie wordt waargenomen in verschillende hersengebieden, zoals de dorsale telencephalon, hypothalamus, optische tectum, torus lateralis, en diffuse kern van de inferieure kwab. Door dubbele immunostaining met orexin-A en CB1R colocalisatie, wordt opgemerkt dat er een toename van colocalisatie in de orexinergic neuronen van de hypothalamus, vergezeld van een toename van orexin-A fluorescerend signaal. Deze resultaten laten zien hoe dubbele immunofluorescentie kan helpen bij het identificeren van fysiologisch geconserveerde eiwitexpressie, colocalisatie van doeleiwitten en hun distributie- en/of expressieveranderingen in verschillende pathologische omstandigheden.Met behulp van immunofluorescentie kunnen we de codistributie en coexpressie van biomoleculen, hun mogelijke interacties, beter begrijpen en kunnen we ook een zichtbaar beeld hebben van hun veranderingen in het geval van verschillende pathologieën. Bovendien kan de neuroanatomische verdeling van metabole enzymexpressie of receptoren de rol van eiwitsignalering in weefsels verder onthullen. Het huidige technische werk introduceerde de immunofluorescentie benadering om twee zeer geconserveerde systeem, orexin en endocannabinoïden, te bestuderen in het gebruik van een volwassen zebravis model.Met behulp van dit protocol hier beschreven voor het eerst in de hersenen van volwassen zebravissen, de anatomische distributie en coexpressie van orexin-2 receptoren en de endocannabinoïde-CB1 receptoren is niet bepaald. We raden de hier beschreven protocollen aan voor immunohistochemie-experimenten en om ruimtelijke distributie en organisatie van receptoren in peptiden bij volwassen zebravissen te detecteren om hun functies beter te begrijpen.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Identification of Fatty Acids in Bacillus cereus

Identification of Fatty Acids in Bacillus cereus

Identificatie van vetzuren in<em&gt; Bacillus cereus</em

The Bacillus species contain branched chain and unsaturated fatty acids (FAs) with diverse positions of the methyl branch (iso or anteiso) and of the ...

Identification of Plant Ice-binding Proteins Through Assessment of Ice-recrystallization Inhibition and Isolation Using Ice-affinity Purification

Identificatie van Plant Ice-bindende eiwitten Through Beoordeling van Ice-herkristallisatie inhibitie en isolatie met behulp van Ice-affiniteitszuivering

Ice-binding proteins (IBPs) belong to a family of stress-induced proteins that are synthesized by certain organisms exposed to subzero temperatures. In ...

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

Bereiding van de monsters voor de massa spectrometrie gebaseerde identificatie van RNA-bindende regio 's

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

The Identification of Sea Lamprey Pheromones Using Bioassay-Guided Fractionation

De identificatie van de Zeeprik feromonen met behulp van de Bioassay-geleide fractionering

Bioassay-guided fractionation is an iterative approach that uses the results of physiological and behavioral bioassays to guide the isolation and ...

Capture and Identification of RNA-binding Proteins by Using Click Chemistry-assisted RNA-interactome Capture (CARIC) Strategy

Capture and Identification of RNA-binding Proteins by Using Click Chemistry-assisted RNA-interactome Capture CARIC Strategy

Vastleggen en identificatie van RNA-bindende proteÃ¯nen met behulp van klik chemie-bijgewoonde RNA-interactome vangen (CARIC) strategie

A comprehensive identification of RNA-binding proteins (RBPs) is key to understanding the posttranscriptional regulatory network in cells. A widely used ...

Identification of Novel CK2 Kinase Substrates Using a Versatile Biochemical Approach

Identificatie van nieuwe CK2 Kinase substraten met behulp van een veelzijdige benadering van de biochemische

The study of kinase-substrate relationships is essential to gain a complete understanding of the functions of these enzymes and their downstream targets ...

Nitropeptide Profiling and Identification Illustrated by Angiotensin II

Nitropeptide profilering en identificatie geïllustreerd door angiotensine II

Protein nitration is one of the most important post-translational modifications (PTM) on tyrosine residues and it can be induced by chemical actions of ...

SUMO-Binding Entities (SUBEs) as Tools for the Enrichment, Isolation, Identification, and Characterization of the SUMO Proteome in Liver Cancer

SUMO-Binding Entities SUBEs as Tools for the Enrichment, Isolation, Identification, and Characterization of the SUMO Proteome in Liver Cancer

SUMO-bindende entiteiten (SUBEs) als hulpmiddelen voor de verrijking, isolatie, identificatie en karakterisering van de SUMO proteome in leverkanker

Post-translational modification is a key mechanism regulating protein homeostasis and function in eukaryotic cells. Among all ubiquitin-like proteins in ...

Profiling Ubiquitin and Ubiquitin-like Dependent Post-translational Modifications and Identification of Significant Alterations

Profilering van Ubiquitin en Ubiquitin-achtige afhankelijke post-translationele modificaties en identificatie van belangrijke veranderingen

Ubiquitin (ub) and ubiquitin-like (ubl) dependent post-translational modifications of proteins play fundamental biological regulatory roles within the ...

Visualization of Estrogen Receptors in Colons of Mice with TNBS-Induced Crohn's Disease using Immunofluorescence

Visualisatie van oestrogeenreceptoren in colons van muizen met tnbs-geïnduceerde ziekte van Crohn met behulp van immunofluorescentie

Crohn&#39;s disease is the most diagnosed type of inflammatory bowel disease. Chronic inflammation developing in the intestine leads to peristalsis ...