Name: identification of orexin and endocannabinoid receptors in adult zebrafish using immunoperoxidase and immunofluorescence methods
Uploaded: 2019-06-25T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Identification of Orexin and Endocannabinoid Receptors in Adult Zebrafish Using Immunoperoxidase and Immunofluorescence Methods at JoVE.com

Cette étude a été soutenue par Fondi Ricerca di Ateneo (FRA)2015-2016, Université de Sannio.

1. Protocole d'immunoperoxidase
REMARQUE: Le poisson zèbre a été obtenu par le professeur Omid Safari (Département des pêches, Faculté des ressources naturelles et de l'environnement, Université Ferdowsi de Mashhad, Mashhad, Iran)10.
<ol><li>Dissection tissulaire
	<ol>
<li>Sacrifier le poisson zèbre par submersion dans l'eau glacée (5 parties de glace/1 partie d'eau, 4 oC); les laisser jusqu'à la cessation de tout mouvement pour assurer la m...

Préparation de l'échantillon
La préparation d'échantillons est la première étape critique du CSI. Un protocole fiable permet le maintien de la morphologie cellulaire, de l'architecture tissulaire et de l'antigénicité. Cette étape nécessite la collecte correcte de tissu, la fixation, et la section22,23. Le but de la fixation est de préserver les tissus et de réduire l'action des enzymes tissulaires ou...

L'immunohistochimie (IHC) est une technique classique bien établie utilisée pour identifier les composants cellulaires ou tissulaires (antigènes) par interaction antigène-anticorps1,2. Il peut être utilisé pour identifier la localisation et la distribution des biomolécules cibles dans un tissu. Le CSI utilise des réactions immunologiques et chimiques pour détecter les antigènes dans les sections tissulaires3. Les principaux marqueurs utilisés pour la visualisation des interactions antigène-anticorps comprennent les colorants fluorescents (immunofluorescence) et les réactions de couleur enzyme-substrat (immunoperoxidase), tous deux conjugués aux anticorps4. L'utilisation de l'observation microscopique est possible pour déterminer la localisation des tissus étiquetés, ce qui correspond approximativement à la localisation de l'antigène cible dans le tissu.
Deux méthodes existent pour les réactions fluorescentes ou chromogéniques pour détecter les protéines : la méthode de détection directe, dans laquelle l'anticorps primaire spécifique est directement étiqueté; et la méthode de détection indirecte, dans laquelle l'anticorps primaire est non conjugué tandis que l'anticorps secondaire porte l'étiquette5,6,7. La méthode indirecte présente certains avantages, qui sont principalement son amplification du signal. En outre, contrairement à d'autres techniques moléculaires et cellulaires, avec l'immunofluorescence, il est possible de visualiser la distribution, la localisation et la coexpression de deux protéines ou plus exprimées différemment dans les cellules et les tissus7. Le choix de la méthode de détection utilisée dépend des détails expérimentaux.
À ce jour, iHC est largement utilisé dans la recherche fondamentale comme un outil puissant et essentiel pour comprendre la distribution et la localisation des biomarqueurs et le profilage général des différentes protéines dans les tissus biologiques de l'homme aux invertébrés8, 9 (en) , 10 Ans et plus , 11. La technique aide à afficher une carte de l'expression des protéines dans un grand nombre d'organes animaux normaux et altérés et de différents types de tissus, montrant la possibilité de descendre ou de modifier l'expression induite par des changements physiologiques et pathologiques. IHC est une technique très sensible qui nécessite une précision et le bon choix de méthodes pour obtenir des résultats optimaux12. Tout d'abord, de nombreux facteurs différents tels que la fixation, la réactivité croisée, la récupération d'antigènes et la sensibilité des anticorps peuvent conduire à de faux signaux positifs et faux négatifs13. La sélection des anticorps est l'une des étapes les plus importantes du CSI et dépend de la spécificité de l'antigène et de son affinité avec les protéines et les espèces à l'étude7.
Récemment, nous avons optimisé la technique du CSI pour détecter les membres de l'orexine/hypocrétine et des systèmes endocannabinoïdes dans le tissu adulte de poisson zèbre. Nous nous sommes concentrés principalement sur la fixation, l'intégration tissulaire à l'aide de deux approches différentes, la section et le montage (qui peuvent affecter la résolution et le détail lors de l'analyse microscopique), et le blocage (pour prévenir les faux positifs et réduire le fond)14. D'autres caractéristiques importantes sont la spécificité et la sélectivité des anticorps et la reproductibilité des protocoles individuels du Ci-Ph. La clé pour fournir la spécificité d'anticorps est l'utilisation des contrôles négatifs (y compris aucun anticorps primaire ou tissu qui est connu pour ne pas exprimer les protéines cibles) aussi bien que des contrôles positifs (y compris le tissu qui est connu pour exprimer les protéines cibles)15 . La sélection des anticorps pour iHC est faite en fonction de leur spécificité de l'espèce (la probabilité avec laquelle ils réagissent avec l'antigène d'intérêt) et des systèmes de détection de liaison antigène-anticorps qui sont utilisés4,5,6 ,7. Dans le cas de l'immunoperoxidase, la couleur de la réaction est déterminée par la sélection du chromogène précipitant, habituellement diaminobenzidine (brun)16. D'autre part, immunofluorescence utilise des anticorps conjugués avec un fluorophor pour visualiser l'expression des protéines dans les sections de tissus congelés et permet une analyse facile de protéines multiples en ce qui concerne le système de détection chromogénique 5 Annonces , 7.
Dans la technique d'immunoperoxidase, l'anticorps secondaire est conjugué à la biotine, une molécule de liaison capable de recruter une molécule journaliste chromogénique [complexe d'avidin-biotine (ABC)], conduisant à l'amplification du signal de coloration. Avec la méthode de journaliste d'ABC, l'enzyme peroxidase réagit avec 3,3'-diaminobenzidine (DAB), produisant une coloration intensément brune où l'enzyme se lie à l'anticorps secondaire, qui peut alors être analysée avec un microscope léger ordinaire. La coloration d'ABC, due à la forte affinité de l'avidine pour la biotine, produit une réaction rapide et optimale, avec peu d'anticorps secondaires attachés au site de la réactivité primaire d'anticorps. Cette méthode de détection chromogénique permet l'analyse densitométrique du signal, fournissant des données semi-quantitatives basées sur la corrélation des niveaux de signal brun avec les niveaux d'expression protéique18.
Avec les techniques d'immunofluorescence, la détection simultanée de protéines multiples est possible en raison de la capacité de différents fluorochromes à émettre de la lumière à des longueurs d'onde uniques, mais il est important de choisir les fluorochromes avec soin pour minimiser les chevauchements spectrals 5. En outre, l'utilisation d'anticorps primaires chez différentes espèces hôtes minimise les difficultés liées à la réactivité croisée. Dans ce cas, chaque anticorps secondaire spécifique à une espèce ne reconnaît qu'un seul type d'anticorps primaires. Les reporters fluorescents sont de petites molécules organiques, y compris des dérivés commerciaux, comme les colorants Alexa Fluor.
De nombreux modèles animaux sont utilisés pour comprendre des conditions physiologiques et pathologiques particulières. À ce jour, il est établi que de nombreuses voies métaboliques sont conservées au cours de l'évolution. Par conséquent, les études du CIS dans des organismes modèles tels que le poisson zèbre peuvent fournir un aperçu de la genèse et du maintien des conditions pathologiques et non pathologiques17. C'est un but de ce rapport pour illustrer des protocoles d'IHC qui peuvent être exécutés sur le tissu adulte de poisson zèbre et employés pour obtenir des images détaillées de la distribution et de la localisation d'OXA, d'OX-2R, et de CB1R aux niveaux périphériques et centraux. On signale également des protocoles pour l'application de deux principales méthodes indirectes du CIS dans les tissus périphériques et centraux du poisson zèbre adulte. La méthode indirecte, qui permet l'amplification du signal dans les cas où un anticorps secondaire est conjugué à un colorant fluorescent (méthode d'immunofluorescence) ou à un reporter enzymatique (méthode d'immunoperoxidase). Les méthodes de détection chromogéniques et fluorescentes possèdent des avantages et des inconvénients. Rapporté dans ce protocole est l'utilisation de IHC, principalement l'immunofluorescence, chez le poisson zèbre adulte, un modèle animal largement utilisé pour étudier les systèmes qui sont évolutifs conservés à travers différentes conditions physiologiques et pathologiques.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anti CB1</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab23703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti OX-2R</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-8074</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-OXA</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc8070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aquatex</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1,085,620,050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylated rabbit anti-goat</td>
			<td>Vector Lab</td>
			<td>BA-5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>citric acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>251275</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Nikon Eclipse Ti2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat</td>
			<td>Leica Biosystem</td>
			<td>CM3050S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>32670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital Camera</td>
			<td>Leica Biosystem</td>
			<td>DFC320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital Camera for confocal microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>DS-Qi2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti goat Alexa fluor 488-conjugated secondary antibodies</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A11055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti goat Alexa fluor 594-conjugated secondary antibodies</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A11058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti rabbit Alexa fluor 488-conjugated secondary antibodies</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A21206</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti rabbit Alexa fluor 594-conjugated secondary antibodies</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A21207</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol absolute</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20,821,330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Frozen section compound</td>
			<td>Leica Biosystem</td>
			<td>FSC 22 Frozen Section Media</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H2O2</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>31642</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20,252,290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImmPACT DAB</td>
			<td>Vector lab</td>
			<td>SK4105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Leica Biosystem</td>
			<td>DMI6000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td>Leica Biosystem</td>
			<td>RM2125RT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S9763</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4H2O</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S9638</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S8045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Donkey Serum</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D9663</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Rabbit Serum</td>
			<td>Vector lab</td>
			<td>S-5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>paraffin wax</td>
			<td>Carlo Erba</td>
			<td>46793801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraphormaldeyde</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium citrate dihydrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>W302600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Fluka Analytical</td>
			<td>93420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VectaStain Elite ABC Kit</td>
			<td>Vector lab</td>
			<td>PK6100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene Pure</td>
			<td>Carlo Erba</td>
			<td>392603</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of orexin and endocannabinoid receptors in adult zebrafish using immunoperoxidase and immunofluorescence methods

L'immunohistochimie (IHC) est une technique très sensible et spécifique impliquée dans la détection d'antigènes cibles dans les sections tissulaires avec des anticorps étiquetés. Il s'agit d'un processus en plusieurs étapes dans lequel l'optimisation de chaque étape est cruciale pour obtenir le signal spécifique optimal. Grâce au CSI, la distribution et la localisation de biomarqueurs spécifiques peuvent être détectées, révélant des informations sur la conservation évolutive. En outre, le CSI permet de comprendre les changements d'expression et de distribution des biomarqueurs dans des conditions pathologiques, comme l'obésité. IHC, principalement la technique d'immunofluorescence, peut être utilisé chez les poissons zèbres adultes pour détecter l'organisation et la distribution des molécules phylogénétiquement conservées, mais un protocole Standard IHC n'est pas estasblished. L'orexine et l'endocannabinoïde sont deux systèmes hautement conservés impliqués dans le contrôle de l'apport alimentaire et de la pathologie de l'obésité. Les protocoles utilisés ici sont utilisés pour obtenir des informations sur le peptide orexin (OXA), le récepteur de l'orexine (OX-2R) et la localisation et la distribution des récepteurs cannabinoïdes (CB1R) dans l'intestin et le cerveau des modèles de poissons zèbres adultes obèses normaux et induits par l'alimentation (DIO). Sont également décrits des méthodes pour l'immunoperoxidase et la double immunofluorescence, aussi bien que la préparation des réactifs, de fixation, de paraffin-embedding, et de cryoprotection du tissu de poisson zèbre et la préparation pour une étape et arrière-plan endogènes de blocage d'activité contre-staining. L'ensemble complet des paramètres est obtenu à partir d'expériences précédentes du CSI, grâce auxquelles nous avons montré comment l'immunofluorescence peut aider à comprendre les OX, l'OX-2R et la distribution, la localisation et la conservation de l'expression chez les poissons zèbres adultes. Tissus. Les images résultantes avec une intensité de signal très spécifique ont conduit à la confirmation que le poisson zèbre sont des modèles animaux appropriés pour les études immunohistochimiques de la distribution, de la localisation et de la conservation évolutive de biomarqueurs spécifiques dans conditions physiologiques et pathologiques. Les protocoles présentés ici sont recommandés pour les expériences du CSI chez les poissons zèbres adultes.

Les données représentatives de la coloration immunoperoxidase sont présentées à la figure 1 et à la figure 2. L'analyse immunohistochimique de la distribution d'OX-A et d'OX-2R dans l'intestin du poisson zèbre adulte a montré différents sites de localisation d'OX-A et d'OX-2R et leurs augmentations d'expression dans les cellules intestinales du poisson zèbre dio. Une coloration brune intense pour l'OX-A a été observée dans les cellules de l'intestin...

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Identification of Orexin and Endocannabinoid Receptors in Adult Zebrafish Using Immunoperoxidase and Immunofluorescence Methods

Identification des récepteurs d'orexine et d'endocannabinoïdes chez le poisson zèbre adulte à l'aide de méthodes d'immunoperoxidase et d'immunofluorescence

Présentés ici sont des protocoles pour la caractérisation immunohistochimique et la localisation du peptide d'orexine, des récepteurs d'orexin, et des récepteurs endocannabinoïdes dans l'intestin et les cerveaux des modèles normaux et induits par l'obésité de régime (DIO) de poissons zèbres adultes utilisant immunoperixidase et les méthodes d'immunofluorescence double.

Immunohistochemistry (IHC) is a highly sensitive and specific technique involved in the detection of target antigens in tissue sections with labeled ...

Actuellement, l’immunohistochimie est utilisée avec une fréquence croissante pour identifier la présence de marqueurs moléculaires spécifiques et leurs changements en cas de pathologies, donnant racine à la possibilité d’effectuer une analyse quantitative. L’immunohistochimie, principalement la technique d’immunofluorescence, est utilisée dans le modèle animal larvaire et adulte du poisson zèbre, mais on sait peu de choses sur un bon protocole d’immunohistochimie standard pour le poisson zèbre. Ici, nous décrivons et montrons un protocole qui peut être utilisé pour étudier la conservation évolutive des protéines importantes chez le poisson zèbre adulte.Un bon protocole d’immunohistochimie chez le poisson zèbre adulte peut aider à sous-tendre l’utilité de ce modèle animal pour étudier l’expression morphologique et la distribution de biomolécules hautement conservées. Cette méthode peut également aider à analyser les altérations possibles de ces biomolécules dues à des conditions pathologiques corrélées à la physiopathologie humaine. Le Dr Lea Tunisi, doctorant de mon laboratoire, démontrera la procédure.Pour commencer cette procédure, transférez les blocs de tissus congelés préparés à un cryostat à moins 20 degrés Celsius. Couper le bloc en sections coronals ou sagittales de 10 micromètres. Ensuite, recueillir les tissus en sections de série alternatives sur des glissières en verre adhésif adapté à l’immunohistochimie, et les stocker à moins 20 degrés Celsius jusqu’à ce qu’ils soient prêts à aller de l’avant.Tout d’abord, utilisez un stylo résistant aux solvants pour délimiter la zone tissulaire sur la lame. Rincer les sections trois fois pendant cinq minutes chacune à l’aide d’un tampon de phosphate de 0,1 molaire. Ensuite, dissoudre 0,3 millilitres de Triton X-100 en 100 millilitres de tampon de phosphate 0,1 molaire pour préparer Triton X-100 0,3%Dissoudre 0,1% sérum normal d’âne dans le tampon de phosphate contenant 0,3%Triton X-100 pour préparer la solution de blocage.Incuber les sections avec la solution du sérum normal d’âne dissous dans le tampon de permeabilization PB-Triton X-100 0.3%pendant 30 minutes à la température ambiante pour perméabiliser la membrane cellulaire et bloquer les emplacements non spécifiques de liaison. Tout d’abord, rincer les sections trois fois pendant cinq minutes chacune avec un tampon de phosphate de 0,1 molaire. Ajouter le mélange d’anticorps primaires dilués dans le PB-T, et incuber les sections pendant la nuit dans une boîte humide à température ambiante.Le lendemain, rincer les sections trois fois pendant cinq minutes chacune avec un tampon de phosphate de 0,1 molaire. Incuber les sections à température ambiante pendant deux heures dans un mélange approprié d’anticorps secondaires dilués dans le PB-T. Pour commencer, rincer les sections trois fois pendant cinq minutes chacune avec un tampon de phosphate de 0,1 molaire.Dissoudre 1,5 microlitres de DAPI en trois millilitres de tampon de phosphate pour préparer le dapi de teinture nucléaire. Contrestain les sections dans le colorant. Ensuite, utilisez le milieu de montage pour couvrez les glissières pour stabiliser les tissus et les taches pour une utilisation à long terme.Les échantillons fluorescents peuvent être stockés dans l’obscurité à quatre degrés Celsius. Répétez le protocole d’immunofluorescence, et omettre l’anticorps primaire ou secondaire, ou remplacez l’antiséum primaire ou secondaire par un tampon de phosphate pour préparer le contrôle négatif. Ensuite, répétez le protocole d’immunofluorescence et pré-absorbez chaque anticorps primaire avec un excès de peptide relatif.Répétez le protocole d’immunofluorescence sur des tranches de cerveau de souris pour préparer le contrôle positif. À l’aide d’un microscope confocal équipé d’une scène motorisée X-Y-Z, d’un appareil photo numérique et d’un logiciel d’acquisition et d’analyse, observez et analysez les sections immunotachées. Acquérir des images numériques avec les objectifs 5x, 20x et 40x.Prenez des images de chaque section à faible grossissement dans chacun des canaux disponibles pour composer un montage à faible grossissement. Normalisez les images de fluorescence au maximum de contraste et de superposition. Dans toute la zone d’intérêt, recueillir série Z-piles d’images à travers six plans focaux avec des étapes focales de un à 1,8 micromètres.Effectuez cette collection pour chaque canal séparément. Après cela, utilisez un logiciel de déconvolution d’imagerie pour déconvoler des images par application de 10 itérations, et l’effondrement des images en série Z-plane en une seule image de projection maximale. Utilisez un logiciel d’édition d’image approprié pour ajuster les micrographes pour la lumière et le contraste.L’analyse immunohistochimique de la distribution ox-A et OX-2R dans l’intestin du poisson zèbre adulte montre différents sites de localisation de OX-A et OX-2R et leurs augmentations d’expression dans les cellules intestinales du poisson zèbre DIO. Une tache brune intense pour OX-A est observée dans les cellules de l’intestin médial et antérieur. L’immunoexpression d’OX-A donne des signaux clairs dans les différents compartiments intestinaux, diminuant de l’antérieur vers l’intestin médial.Des résultats similaires sont observés pour l’immunoexpression OX-2R dans l’intestin du DIO et contrôlent le poisson zèbre de régime. Un signal OX-A accru chez le poisson zèbre adulte DIO s’accompagne de la surexpression d’OX-2R dans d’autres compartiments intestinaux. L’analyse précise des images immunofluorescentes montre l’augmentation de la colocalisation OX-2R/CB1R dans l’intestin du poisson zèbre adulte DIO par rapport au poisson zèbre de régime de contrôle.Une situation semblable est observée dans différentes régions de cerveau, telles que le telencéphale dorsal, l’hypothalamus, le tectum optique, le lateralis de torus, et le noyau diffus du lobe inférieur. En doublant l’immunostaining avec la colocalisation d’orexin-A et de CB1R, on observe qu’il y avait une augmentation de la colocalisation dans les neurones orexinergiques de l’hypothalamus, accompagnée d’une augmentation du signal fluorescent orexin-A. Ces résultats montrent comment la double immunofluorescence peut aider à identifier l’expression physiologiquement conservée des protéines, la colocalisation des protéines cibles et leurs changements de distribution et/ou d’expression dans différentes conditions pathologiques.En utilisant l’immunofluorescence, nous pouvons mieux comprendre la codistribution et la coexpression des biomolécules, leurs interactions possibles, et nous pouvons également avoir une image visible de leurs changements en cas de pathologies différentes. En outre, la distribution neuroanatomique de l’expression ou des récepteurs métaboliques d’enzyme peut encore révéler le rôle de la signalisation de protéine dans les tissus. Les travaux techniques actuels ont introduit l’approche d’immunofluorescence pour étudier deux systèmes fortement conservés, l’orexine et l’endocannabinoïdes, en utilisant un modèle adulte de poisson zèbre.En utilisant ce protocole décrit ici pour la première fois dans le cerveau du poisson zèbre adulte, la distribution anatomique et la coexpression des récepteurs orexine-2 et des récepteurs endocannabinoïdes-CB1 n’a pas été déterminée. Nous recommandons les protocoles décrits ici pour des expériences d’immunohistochimie et pour détecter la distribution spatiale et l’organisation des récepteurs dans les peptides chez le poisson zèbre adulte pour mieux comprendre leurs fonctions.

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