Name: identification of orexin and endocannabinoid receptors in adult zebrafish using immunoperoxidase and immunofluorescence methods
Uploaded: 2019-06-25T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Identification of Orexin and Endocannabinoid Receptors in Adult Zebrafish Using Immunoperoxidase and Immunofluorescence Methods at JoVE.com

Diese Studie wurde von Fondi Ricerca di Ateneo (FRA)2015-2016, University of Sannio, unterstützt.

1. Immunperoxidase-Protokoll
HINWEIS: Die Zebrafische wurden von Prof. Omid Safari (Department of Fisheries, Faculty of Natural Resources and Environment, Ferdowsi University of Mashhad, Mashhad, Iran)10gewonnen.
<ol><li>Gewebesektion
	<ol>
<li>Opfern Sie den Zebrafisch durch Eintauchen in Eiswasser (5 Teile Eis/1 Teil Wasser, 4 °C); lassen Sie sie bis zur Beendigung aller Bewegung, um den Tod durch Hypoxie zu gewährleisten.</li>
		<li>Entfernen Sie...

Probenvorbereitung
Die Probenvorbereitung ist der erste kritische Schritt im IHC. Ein zuverlässiges Protokoll ermöglicht die Aufrechterhaltung der Zellmorphologie, Gewebearchitektur und Antigenität. Dieser Schritt erfordert die korrekte Gewebesammlung, Fixierung und Abschnitt22, 23. Der Zweck der Fixierung ist es, Gewebe zu erhalten und die Wirkung von Gewebeenzymen oder Mikroorganismen zu reduzieren. Insbeso...

Immunohistochemistry (IHC) ist eine etablierte klassische Technik zur Identifizierung von Zell- oder Gewebekomponenten (Antigene) durch Antigen-Antikörper-Interaktion1,2. Es kann verwendet werden, um die Lokalisierung und Verteilung von Zielbiomolekülen innerhalb eines Gewebes zu identifizieren. IHC verwendet immunologische und chemische Reaktionen, um Antigene in Gewebeabschnitten3zu erkennen. Die wichtigsten Marker, die für die Visualisierung von Antigen-Antikörper-Wechselwirkungen verwendet werden, sind Fluoreszenzfarbstoffe (Immunfluoreszenz) und Enzym-Substrat-Farbreaktionen (Immunoperoxidase), die beide mit Antikörpern konjugiert sind4. Mittels mikroskopischer Beobachtung ist es möglich, die Lokalisation von markiertem Gewebe zu bestimmen, was in etwa der Lokalisation des Zielantigens im Gewebe entspricht.
Es gibt zwei Methoden für fluoreszierende oder chromogene Reaktionen zum Nachweis von Proteinen: die direkte Detektionsmethode, bei der der spezifische Primärantikörper direkt gekennzeichnet ist; und die indirekte Detektionsmethode, bei der der primäre Antikörper unkonjugiert wird, während der sekundäre Antikörper das Etikett5,6,7trägt. Die indirekte Methode hat einige Vorteile, die vor allem ihre Signalverstärkung ist. Darüber hinaus ist es im Gegensatz zu anderen molekularen und zellulären Techniken mit Immunfluoreszenz möglich, die Verteilung, Lokalisierung und Koexpression von zwei oder mehr Proteinen, die in Zellen und Geweben differenziell exprimiert werden, zu visualisieren7. Die Wahl der verwendeten Erkennungsmethode hängt von experimentellen Details ab.
Bis heute ist IHC in der Grundlagenforschung als ein leistungsfähiges und wesentliches Werkzeug zum Verständnis der Verteilung und Lokalisierung von Biomarkern und der allgemeinen Profilierung verschiedener Proteine im biologischen Gewebe vom Menschen bis zu den wirbellosen Tieren 8, 9 , 10 , 11. Die Technik hilft, eine Karte der Proteinexpression in einer großen Anzahl von normalen und veränderten tierischen Organen und verschiedenen Gewebetypen anzuzeigen, was eine mögliche Down- oder Up-Regulierung der Expression zeigt, die durch physiologische und pathologische Veränderungen induziert wird. IHC ist eine hochsensible Technik, die Genauigkeit und die richtige Wahl der Methoden erfordert, um optimale Ergebnisse zu erzielen12. Zuallererst können viele verschiedene Faktoren wie Fixierung, Kreuzreaktivität, Antigenabruf und Empfindlichkeit von Antikörpern zu falsch positiven und falsch negativen Signalen führen13. Die Auswahl der Antikörper ist einer der wichtigsten Schritte in IHC und hängt von der Antigenspezifität und ihrer Affinität zu dem untersuchten Protein und den untersuchten Artenab 7.
Kürzlich haben wir die IHC-Technik optimiert, um Mitglieder von Orexin/Hypocretin- und Endocannabinoidsystemen in erwachsenem Zebrafischgewebe zu erkennen. Wir haben uns hauptsächlich auf Fixierung, Gewebeeinbettung mit zwei verschiedenen Ansätzen konzentriert, Schnitt und Montage (die Auflösung und Detail während der mikroskopischen Analyse beeinflussen können), und Blockierung (um falsch positive Positivmeldungen zu verhindern und Hintergrund zu reduzieren)14. Weitere wichtige Merkmale sind die Antikörperspezifität und Selektivität und Reproduzierbarkeit einzelner IHC-Protokolle. Der Schlüssel zur Bereitstellung von Antikörperspezifität ist die Verwendung von Negativkontrollen (einschließlich aller primären Antikörper oder Gewebe, von denen bekannt ist, dass sie die Zielproteine nicht ausdrücken) sowie positiver Kontrollen (einschließlich Gewebe, das bekanntermaßen die Zielproteine ausdrückt)15 . Die Auswahl von Antikörpern für IHC erfolgt auf der Grundlage ihrer Artenspezifität (die Wahrscheinlichkeit, mit der sie mit dem Antigen von Interesse reagieren) und den Antigen-Antikörper-Bindungsdetektionssystemen, die verwendet werden4,5,6 ,7. Bei Der Immunperoxidase wird die Farbe der Reaktion durch die Auswahl des niederschlagsbestimmenden Chromogens, in der Regel Diaminobenzidin (braun)16bestimmt. Auf der anderen Seite nutzt immunofluoreszenz Antikörper, die mit einem Fluorophor konjugiert sind, um die Proteinexpression in gefrorenen Gewebeabschnitten zu visualisieren und ermöglicht eine einfache Analyse mehrerer Proteine in Bezug auf das chromogene Detektionssystem. 5 , 7.
In der Immunoperoxidase-Technik wird der sekundäre Antikörper mit Biotin konjugiert, einem Linkermolekül, das in der Lage ist, ein chromogenes Reportermolekül [Avidin-Biotin-Komplex (ABC)] zu rekrutieren, was zur Verstärkung des Färbesignals führt. Mit der ABC-Reportermethode reagiert das Enzym Peroxidase mit 3,3'-Diaminobenzidin (DAB) und erzeugt eine intensiv braun gefärbte Färbung, bei der das Enzym an den Sekundärantikörper bindet, der dann mit einem gewöhnlichen Lichtmikroskop analysiert werden kann. ABC-Färbung, aufgrund der hohen Affinität von Avidin für Biotin, produziert eine schnelle und optimale Reaktion, mit wenigen sekundären Antikörpern an der Stelle der primären Antikörperreaktivität befestigt. Diese chromogene Detektionsmethode ermöglicht die densitometrische Analyse des Signals und liefert semiquantitative Daten, die auf der Korrelation brauner Signalniveaus mit den Proteinexpressionsstufen18basieren.
Mit Immunfluoreszenz-Techniken ist der gleichzeitige Nachweis mehrerer Proteine aufgrund der Fähigkeit verschiedener Fluorchrome möglich, Licht bei einzigartigen Wellenlängen auszusenden, ist jedoch wichtig, Fluorchrome sorgfältig zu wählen, um spektrale Überlappungen zu minimieren. 5. Darüber hinaus minimiert die Verwendung primärer Antikörper bei verschiedenen Wirtsarten Schwierigkeiten bei der Kreuzreaktivität. In diesem Fall erkennt jeder artspezifische sekundäre Antikörper nur einen Primärantikörpertyp. Fluoreszierende Reporter sind kleine organische Moleküle, einschließlich kommerzieller Derivate, wie Alexa FluorFarbstoffe.
Viele Tiermodelle werden verwendet, um bestimmte physiologische und pathologische Bedingungen zu verstehen. Bis heute ist fest, dass viele Stoffwechselwege im Laufe der Evolution konserviert werden. Daher können IHC-Studien an Modellorganismen wie Zebrafischen Einblicke in die Entstehung und Aufrechterhaltung pathologischer und nichtpathologischer Erkrankungen geben17. Ziel dieses Berichts ist es, IHC-Protokolle zu veranschaulichen, die auf erwachsenem Zebrafischgewebe durchgeführt werden können und verwendet werden, um detaillierte Bilder der Verteilung und Lokalisierung von OXA, OX-2R und CB1R auf peripherer und zentraler Ebene zu erhalten. Ebenfalls berichtet sind Protokolle für die Anwendung von zwei wichtigen iHC indirekten Methoden in peripheren und zentralen Geweben von erwachsenen Zebrafischen. Beschrieben wird die indirekte Methode, die eine Signalverstärkung in Fällen ermöglicht, in denen ein sekundärer Antikörper mit einem Fluoreszenzfarbstoff (Immunfluoreszenzmethode) oder Enzymreporter (Immunoperoxidase-Methode) konjugiert wird. Sowohl chromogene als auch fluoreszierende Detektionsmethoden haben Vor- und Nachteile. In diesem Protokoll wird berichtet, dass IHC, hauptsächlich Immunfluoreszenz, bei erwachsenen Zebrafischen verwendet wird, ein Tiermodell, das weit verbreitet ist, um Systeme zu untersuchen, die evolutionär unter verschiedenen physiologischen und pathologischen Bedingungen konserviert werden.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anti CB1</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab23703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti OX-2R</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-8074</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-OXA</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc8070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aquatex</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1,085,620,050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylated rabbit anti-goat</td>
			<td>Vector Lab</td>
			<td>BA-5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>citric acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>251275</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Nikon Eclipse Ti2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat</td>
			<td>Leica Biosystem</td>
			<td>CM3050S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>32670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital Camera</td>
			<td>Leica Biosystem</td>
			<td>DFC320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital Camera for confocal microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>DS-Qi2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti goat Alexa fluor 488-conjugated secondary antibodies</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A11055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti goat Alexa fluor 594-conjugated secondary antibodies</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A11058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti rabbit Alexa fluor 488-conjugated secondary antibodies</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A21206</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti rabbit Alexa fluor 594-conjugated secondary antibodies</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A21207</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol absolute</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20,821,330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Frozen section compound</td>
			<td>Leica Biosystem</td>
			<td>FSC 22 Frozen Section Media</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H2O2</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>31642</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20,252,290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImmPACT DAB</td>
			<td>Vector lab</td>
			<td>SK4105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Leica Biosystem</td>
			<td>DMI6000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td>Leica Biosystem</td>
			<td>RM2125RT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S9763</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4H2O</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S9638</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S8045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Donkey Serum</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D9663</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Rabbit Serum</td>
			<td>Vector lab</td>
			<td>S-5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>paraffin wax</td>
			<td>Carlo Erba</td>
			<td>46793801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraphormaldeyde</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium citrate dihydrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>W302600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Fluka Analytical</td>
			<td>93420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VectaStain Elite ABC Kit</td>
			<td>Vector lab</td>
			<td>PK6100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene Pure</td>
			<td>Carlo Erba</td>
			<td>392603</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of orexin and endocannabinoid receptors in adult zebrafish using immunoperoxidase and immunofluorescence methods

Immunhistochemie (IHC) ist eine hochsensible und spezifische Technik, die beim Nachweis von Zielantigenen in Gewebeabschnitten mit markierten Antikörpern beteiligt ist. Es ist ein mehrstufiger Prozess, bei dem die Optimierung jedes Schritts entscheidend ist, um das optimale spezifische Signal zu erhalten. Durch IHC kann die Verbreitung und Lokalisierung spezifischer Biomarker nachgewiesen werden, die Informationen zur evolutionären Konservierung aufzeigen. Darüber hinaus ermöglicht IHC das Verständnis von Expression und Verteilung simonischen Veränderungen von Biomarkern unter pathologischen Bedingungen, wie Fettleibigkeit. IHC, hauptsächlich die Immunfluoreszenztechnik, kann bei erwachsenen Zebrafischen verwendet werden, um die Organisation und Verteilung von phylogenetisch konservierten Molekülen zu erkennen, aber ein Standard-IHC-Protokoll ist nicht veröffentlicht. Orexin und Endocannabinoid sind zwei hochkonservierte Systeme, die an der Kontrolle der Nahrungsaufnahme und Adipositaspathologie beteiligt sind. Berichtet werden hier Protokolle verwendet, um Informationen über Orexin Peptid (OXA), Orexin-Rezeptor (OX-2R) und Cannabinoid-Rezeptor (CB1R) Lokalisierung und Verteilung in den Darm und Gehirn von normalen und Diät-induzierten adipösen (DIO) erwachsenen Zebrafisch-Modelle zu erhalten. Ebenfalls beschrieben sind Methoden zur Immunperoxidase und doppelten Immunfluoreszenz sowie die Herstellung von Reagenzien, Fixierung, Paraffin-Einbettung und Kryoschutz von Zebrafischgewebe und Vorbereitung auf einen endogenen Aktivitätsblockierungsschritt und Hintergrund Gegenfärbung. Der vollständige Satz von Parametern wird aus früheren IHC-Experimenten gewonnen, durch die wir gezeigt haben, wie Immunfluoreszenz beim Verständnis von OXs, OX-2R und CB1R-Verteilung, Lokalisierung und Erhaltung der Expression in erwachsenen Zebrafischen helfen kann. Gewebe. Die resultierenden Bilder mit hochspezifischer Signalintensität führten zur Bestätigung, dass Zebrafische geeignete Tiermodelle für immunhistochemische Studien der Verteilung, Lokalisierung und evolutionären Konservierung spezifischer Biomarker in physiologischen und pathologischen Bedingungen. Die hier vorgestellten Protokolle werden für IHC-Experimente an erwachsenen Zebrafischen empfohlen.

Repräsentative Daten für die Immunoperoxidase-Färbung sind in Abbildung 1 und Abbildung 2dargestellt. Die immunhistochemische Analyse der OX-A- und OX-2R-Verteilung im Darm erwachsener Zebrafische zeigte verschiedene Lokalisationsstellen von OX-A und OX-2R und deren Expressioninitiierung in den Darmzellen von DIO-Zebrafischen. Eine intensive braune Färbung für OX-A wurde in den Zellen des medialen und vorderen Darms beobachtet (Abbildun...

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Identification of Orexin and Endocannabinoid Receptors in Adult Zebrafish Using Immunoperoxidase and Immunofluorescence Methods

Identifizierung von Orexin- und Endocannabinoidrezeptoren bei erwachsenen Zebrafischen mit Immunoperoxidase und Immunfluoreszenzmethoden

Präsentiert sind hier Protokolle für die immunhistochemische Charakterisierung und Lokalisierung von Orexin-Peptid, Orexin-Rezeptoren, und Endocannabinoid-Rezeptoren im Darm und Gehirn von normalen und Diät-induzierten Adipositas (DIO) erwachsene Zebrafisch-Modelle mit Immunperixidase und Doppelimmunfluoreszenzmethoden.

Immunohistochemistry (IHC) is a highly sensitive and specific technique involved in the detection of target antigens in tissue sections with labeled ...

Derzeit wird die Immunhistochemie immer häufiger eingesetzt, um das Vorhandensein spezifischer molekularer Marker und deren Veränderungen im Falle von Pathologien zu identifizieren, was der Möglichkeit, quantitative Analysen durchzuführen, die Wurzel gibt. Die Immunhistochemie, hauptsächlich die Immunfluoreszenztechnik, wird im Larven- und Erwachsenen-Zebrafisch-Tiermodell verwendet, aber über ein gutes Standard-Immunhistochemieprotokoll für Zebrafische ist wenig bekannt. Hier beschreiben und veranschaulichen wir ein Protokoll, das verwendet werden kann, um die evolutionäre Konservierung wichtiger Proteine bei erwachsenen Zebrafischen zu untersuchen.Ein gutes Protokoll für die Immunhistochemie bei erwachsenen Zebrafischen kann dazu beitragen, die Nützlichkeit dieses Tiermodells zu unterlegen, um die morphologische Expression und Verteilung hochkonservierter Biomoleküle zu untersuchen. Diese Methode kann auch helfen, mögliche Veränderungen dieser Biomoleküle aufgrund pathologischer Bedingungen zu analysieren, die mit der menschlichen Physiopathologie korreliert sind. Demonstriert wird das Verfahren von Dr.Lea Tunisi, einer Doktorandin aus meinem Labor.Um dieses Verfahren zu beginnen, übertragen Sie die vorbereiteten gefrorenen Gewebeblöcke auf einen Kryostat bei minus 20 Grad Celsius. Schneiden Sie den Block in koronare oder sagittale Abschnitte von 10 Mikrometern. Dann sammeln Sie die Gewebe in alternativen seriellen Abschnitten auf Klebeglasrutschen geeignet für die Immunhistochemie, und lagern Sie sie bei minus 20 Grad Celsius, bis sie bereit sind, fortzufahren.Verwenden Sie zunächst einen lösungsmittelbeständigen Stift, um den Gewebebereich auf dem Dia abzugrenzen. Spülen Sie die Abschnitte dreimal für jeweils fünf Minuten mit 0,1-Molar-Phosphatpuffer. Als nächstes lösen Sie 0,3 Milliliter Triton X-100 in 100 Milliliter 0,1-Molarphosphatpuffer auf, um Triton X-100 0,3%Auflösen von 0,1% normalem Eselsserum in einem Phosphatpuffer mit 0,3% Triton X-100 vorzubereiten, um die Blocklösung vorzubereiten.Inkubieren Sie die Abschnitte mit der Lösung des normalen Eselsserums, das im Permeabilisationspuffer PB-Triton X-100 0,3% für 30 Minuten bei Raumtemperatur gelöst wird, um die Zellmembran zu permeabilisieren und die unspezifischen Bindungsstellen zu blockieren. Erstens spülen Sie die Abschnitte dreimal für jeweils fünf Minuten mit 0,1-Molar-Phosphatpuffer. Fügen Sie die Mischung der primären Antikörper in PB-T verdünnt, und inkubieren Sie die Abschnitte über Nacht in einer feuchten Box bei Raumtemperatur.Am Tag danach spülen Sie die Abschnitte dreimal für jeweils fünf Minuten mit 0,1-Molarphosphatpuffer aus. Inkubieren Sie Abschnitte bei Raumtemperatur für zwei Stunden in einer geeigneten Mischung von sekundären Antikörpern in PB-T verdünnt. Zu Beginn spülen Sie die Abschnitte dreimal für jeweils fünf Minuten mit 0,1-Molar-Phosphatpuffer aus.Lösen Sie 1,5 Mikroliter DAPI in drei Milliliter Phosphatpuffer, um den Kernfarbstoff DAPI vorzubereiten. Gegenstain die Abschnitte im Farbstoff. Verwenden Sie dann Montagemedium, um die Rutschen zu bedecken, um das Gewebe und den Fleck für den langfristigen Gebrauch zu stabilisieren.Fluoreszierende Proben können im Dunkeln bei vier Grad Celsius gelagert werden. Wiederholen Sie das Immunfluoreszenzprotokoll, und lassen Sie entweder den primären oder sekundären Antikörper aus, oder ersetzen Sie das primäre oder sekundäre Antiserum durch einen Phosphatpuffer, um die negative Kontrolle vorzubereiten. Als Nächstes wiederholen Sie das Immunfluoreszenzprotokoll und absorbieren Sie jeden primären Antikörper mit einem Überschuss des relativen Peptids.Wiederholen Sie das Immunfluoreszenzprotokoll auf Scheiben des Maushirns, um die positiv efegene Kontrolle vorzubereiten. Mit einem konfokalen Mikroskop, das mit einer motorisierten X-Y-Z-Bühne, einer Digitalkamera sowie einer Erfassungs- und Analysesoftware ausgestattet ist, beobachten und analysieren Sie die immunbefleckten Abschnitte. Erfassen Sie digitale Bilder mit den 5x- und 20x- und 40x-Objektiven.Nehmen Sie Bilder von jedem Abschnitt mit geringer Vergrößerung in jedem der verfügbaren Kanäle auf, um eine Montage mit geringer Vergrößerung zu komponieren. Normalisieren Sie die Fluoreszenzbilder auf maximalen Kontrast und Überlagerung. Sammeln Sie im gesamten Interessengebiet serielle Z-Stacks von Bildern durch sechs Brennebenen mit Brennschritten von einem bis 1,8 Mikrometern.Führen Sie diese Auflistung für jeden Kanal separat aus. Verwenden Sie anschließend die Bildverarbeitungssoftware, um Bilder durch Anwendung von 10 Iterationen zu dekonvolvenieren und die seriellen Z-Ebenenbilder in ein einziges maximales Projektionsbild zu reduzieren. Verwenden Sie eine geeignete Bildbearbeitungssoftware, um die Mikrographen auf Licht und Kontrast einzustellen.Die immunhistochemische Analyse der OX-A- und OX-2R-Verteilung im Darm erwachsener Zebrafische zeigt verschiedene Lokalisationsstellen von OX-A und OX-2R und deren Expressioninitiierung in den Darmzellen von DIO-Zebrafischen. Eine intensive braune Färbung für OX-A wird in den Zellen des medialen und vorderen Darms beobachtet. Die Immunexpression von OX-A gibt klare Signale in den verschiedenen Darmfächern, die vom vorderen in Richtung des medialen Darms abnehmen.Ähnliche Ergebnisse werden für ox-2R Immunexpression im Darm von DIO und Kontrolle Diät Zebrafische beobachtet. Ein erhöhtes OX-A-Signal bei DI erwachsenen Zebrafischen wird von der Überexpression von OX-2R in anderen Darmfächern begleitet. Die genaue Analyse von immunfluoreszierenden Bildern zeigt die Zunahme der OX-2R/CB1R-Kolokalisierung im Darm von DIO-Erwachsenenzebrafischen im Vergleich zur Kontrolldiät zebrafish.Eine ähnliche Situation ist in verschiedenen Hirnregionen beobachtet, wie dem dorsalen Telencephalon, Hypothalamus, optischem Tectum, Torus lateralis und diffusem Kern des unteren Lappens. Durch doppelte Immunfärbung mit Orexin-A und CB1R Kolokalisierung, Es wird beobachtet, dass es eine Zunahme der Kolokalisierung in den orexinergen Neuronen des Hypothalamus, begleitet von einer Erhöhung der Orexin-A fluoreszierenden Signal. Diese Ergebnisse zeigen, wie eine doppelte Immunfluoreszenz dazu beitragen kann, die physiologisch konservierte Proteinexpression, die Kolokalisierung von Zielproteinen und deren Verteilungs- und/oder Expressionsänderungen in verschiedenen pathologischen Bedingungen zu identifizieren.Mit Hilfe der Immunfluoreszenz können wir die Kodistribution und Koexpression von Biomolekülen, ihre möglichen Wechselwirkungen besser verstehen, und wir können auch ein sichtbares Bild ihrer Veränderungen bei verschiedenen Pathologien haben. Darüber hinaus kann die neuroanatomische Verteilung der metabolischen Enzymexpression oder Rezeptoren die Rolle der Proteinsignalisierung im Gewebe weiter offenbaren. Die vorliegende technische Arbeit führte den Immunfluoreszenzansatz ein, um zwei hochkonservierte System, Orexin und Endocannabinoide, bei der Verwendung eines erwachsenen Zebrafischmodells zu untersuchen.Mit diesem hier beschriebenen Protokoll wurde zum ersten Mal im Gehirn erwachsener Zebrafische die anatomische Verteilung und Koexpression von Orexin-2-Rezeptoren und den Endocannabinoid-CB1-Rezeptoren nicht bestimmt. Wir empfehlen die hier beschriebenen Protokolle für immunhistochemische Experimente und zum Nachweis der räumlichen Verteilung und Organisation von Rezeptoren in Peptiden bei erwachsenen Zebrafischen, um deren Funktionen besser zu verstehen.

Research

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Biochemistry

Identification of Fatty Acids in Bacillus cereus

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Identifizierung von Fettsäuren in<em&gt; Bacillus cereus</em

The Bacillus species contain branched chain and unsaturated fatty acids (FAs) with diverse positions of the methyl branch (iso or anteiso) and of the ...

Forschung

Biochemie

Identification of Plant Ice-binding Proteins Through Assessment of Ice-recrystallization Inhibition and Isolation Using Ice-affinity Purification

Identifizierung von Pflanzenproteinen durch die Bewertung der Eis-Rekristallisation Hemmung und Isolation Mit Ice-Affinitätsreinigung Ice-Bindung

Ice-binding proteins (IBPs) belong to a family of stress-induced proteins that are synthesized by certain organisms exposed to subzero temperatures. In ...

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Probenvorbereitung für Masse Spektrometrie-basierte Identifikation der RNA-bindende Regionen

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The Identification of Sea Lamprey Pheromones Using Bioassay-Guided Fractionation

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Bioassay-guided fractionation is an iterative approach that uses the results of physiological and behavioral bioassays to guide the isolation and ...

Capture and Identification of RNA-binding Proteins by Using Click Chemistry-assisted RNA-interactome Capture (CARIC) Strategy

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Erfassung und Identifizierung von RNA-bindende Proteine mit Click-Chemie-gestützte RNA-Interaktom erfassen (CARIC) Strategie

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Nitropeptide Profiling and Identification Illustrated by Angiotensin II

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Visualisierung von Östrogenrezeptoren bei Mäusen mit TNBS-induzierter Morbus Crohn mit Immunfluoreszenz

Crohn&#39;s disease is the most diagnosed type of inflammatory bowel disease. Chronic inflammation developing in the intestine leads to peristalsis ...