Name: identification of orexin and endocannabinoid receptors in adult zebrafish using immunoperoxidase and immunofluorescence methods
Uploaded: 2019-06-25T12:30:00
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इस अध्ययन Fondi Ricerca di Ateneo (FRA)2015-2016, Sannio विश्वविद्यालय द्वारा समर्थित किया गया था.

1. इम्युनोपेरॉक्सिडस प्रोटोकॉल
नोट: जेब्राफ़िश प्रो Omid सफारी (मछली पालन विभाग, प्राकृतिक संसाधन और पर्यावरण के संकाय, Mashhad, Mashhad, ईरान के Ferdowsi विश्वविद्यालय)10द्वारा प्राप्त किए गए थे.
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नमूना तैयारी
आईएचसी में नमूना तैयार करना पहला महत्वपूर्ण कदम है। एक विश्वसनीय प्रोटोकॉल सेल आकारिकी, ऊतक वास्तुकला, और antigenicity के रखरखाव के लिए अनुमति देता है. इस चरण के लिए सही ऊतक संग्र?...

इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री (आईएचसी) एक अच्छी तरह से स्थापित क्लासिक तकनीक है जिसका उपयोग एंटीजन-एंटीबॉडी इंटरैक्शन1,2द्वारा सेलुलर या ऊतक घटकों (एंटीजन) की पहचान करने के लिए किया जाता है। इसका उपयोग ऊतक के भीतर लक्षित जैव अणुओं के स्थानीयकरण और वितरण की पहचान करने के लिए किया जा सकता है। आईएचसी ऊतक अनुभाग3में एंटीजन का पता लगाने के लिए इम्यूनोलॉजिकल और रासायनिक प्रतिक्रियाओं का उपयोग करता है . एंटीजन-एंटीबॉडी इंटरैक्शन के दृश्य के लिए उपयोग किए जाने वाले मुख्य मार्कर में फ्लोरोसेंट रंग (इम्युनोफ्लोरेसेंस) और एंजाइम-सब्सट्रेट रंग प्रतिक्रियाएं (इम्युनोपेरॉक्सिडेस) शामिल हैं, दोनों एंटीबॉडी के लिए संयुग्मी4. सूक्ष्म अवलोकन का उपयोग लेबल ऊतक के स्थानीयकरण निर्धारित करने के लिए संभव है, जो लगभग ऊतक में लक्ष्य प्रतिजन के स्थानीयकरण से मेल खाती है.
प्रोटीन का पता लगाने के लिए फ्लोरोसेंट या क्रोमोजेनिक प्रतिक्रियाओं के लिए दो विधियां मौजूद हैं: प्रत्यक्ष पता लगाने की विधि, जिसमें विशिष्ट प्राथमिक एंटीबॉडी को सीधे लेबल किया जाता है; और अप्रत्यक्ष पहचान विधि , जिसमें प्राथमिक एंटीबॉडी अयुग्मित है जबकि द्वितीयक एंटीबॉडी में लेबल5,6,7होता है . अप्रत्यक्ष विधि कुछ लाभ है, जो मुख्य रूप से अपने संकेत प्रवर्धन है. इसके अलावा, अन्य आणविक और सेलुलर तकनीकों के विपरीत, इम्यूनोफ्लोरेसेंस के साथ, कोशिकाओं और ऊतकों के भीतरव्यक्त किए गए दो या दो से अधिक प्रोटीनों के वितरण, स्थानीयकरण, और सह-अभिव्यक्ति की कल्पना करना संभव है। उपयोग की गई डिटेक्शन विधि का चुनाव प्रयोगात्मक विवरण पर निर्भर करता है।
तारीख करने के लिए, IHC व्यापक रूप से biomarkers के वितरण और स्थानीयकरण और मानव से अकशेरुकी8करने के लिए जैविक ऊतक में विभिन्न प्रोटीन की सामान्य रूपरेखा को समझने के लिए एक शक्तिशाली और आवश्यक उपकरण के रूप में बुनियादी अनुसंधान में प्रयोग किया जाता है, 9 , 10 , 11.इस तकनीक से बड़ी संख्या में सामान्य और परिवर्तित पशु अंगों और विभिन्न ऊतकों में प्रोटीन अभिव्यक्ति का मानचित्र प्रदर्शित करने में मदद मिलती है, जो शारीरिक और रोग संबंधी परिवर्तनों से प्रेरित अभिव्यक्ति का संभावित डाउन या अप-विनियमन दर्शाता है। IHC एक अत्यधिक संवेदनशील तकनीक है कि सटीकता और इष्टतम परिणाम प्राप्त करने के लिए तरीकों का सही विकल्प की आवश्यकताहै 12. सबसे पहले, इस तरह के निर्धारण के रूप में कई अलग अलग कारकों, पार प्रतिक्रिया, प्रतिजन पुनर्प्राप्ति, और एंटीबॉडी की संवेदनशीलता झूठी सकारात्मक और झूठी नकारात्मक संकेतों के लिए नेतृत्व कर सकते हैं13. एंटीबॉडी का चयन आईएचसी में सबसे महत्वपूर्ण चरणों में से एक है और यह जांच के तहत प्रोटीन और प्रजातियों के प्रति प्रति प्रतिजन विशिष्टता और इसकी समानता पर निर्भर करताहै.
हाल ही में, हमने वयस्क जेब्राफ़िश ऊतक में orexin/hypocretin और endocannabinoid सिस्टम के सदस्यों का पता लगाने के लिए आईएचसी तकनीक को अनुकूलित किया है। हम निर्धारण पर मुख्य रूप से ध्यान केंद्रित किया है, ऊतक दो अलग अलग दृष्टिकोण का उपयोग कर embedding, अनुभागऔर बढ़ते (जो सूक्ष्म विश्लेषण के दौरान संकल्प और विस्तार को प्रभावित कर सकते हैं), और अवरुद्ध (गलत सकारात्मक को रोकने और पृष्ठभूमि को कम करने के लिए)14. अन्य महत्वपूर्ण विशेषताओं एंटीबॉडी विशिष्टता और चयनात्मकता और व्यक्तिगत IHC प्रोटोकॉल की पुन: उत्पादनक्षमता हैं. एंटीबॉडी विशिष्टता प्रदान करने के लिए महत्वपूर्ण नकारात्मक नियंत्रण का उपयोग है (कोई प्राथमिक एंटीबॉडी या ऊतक है कि लक्ष्य प्रोटीन व्यक्त नहीं करने के लिए जाना जाता है सहित) के रूप में के रूप में अच्छी तरह से सकारात्मक नियंत्रण (ऊतक है कि लक्ष्य प्रोटीन व्यक्त करने के लिए जाना जाता है सहित)15 . IHC के लिए एंटीबॉडी का चयन उनकी प्रजातियों-विशिष्टता के आधार पर किया जाता है (संभावना है जिसके साथ वे ब्याज के प्रतिजन के साथ प्रतिक्रिया) और एंटीजन-एंटीबॉडी बाध्यकारी पहचान प्रणाली है कि4,5,6 प्रयोग किया जाता है ,7. इम्यूनोपर्ऑक्सिडेस के मामले में, प्रतिक्रिया का रंग वेग से पैदा क्रोमोजेन के चयन द्वारा निर्धारित किया जाता है, आमतौर पर डाइऐमिनोबेन्जिडीन (भूरे रंग)16। दूसरी ओर, मैंmmunofluorence जमे हुए ऊतक वर्गों में प्रोटीन अभिव्यक्ति कल्पना करने के लिए एक फ्लोरोफोर के साथ संयुग्मी एंटीबॉडी का इस्तेमाल करता है और क्रोमोजेनिक पता लगाने प्रणाली के संबंध में कई प्रोटीन के आसान विश्लेषण के लिए अनुमति देता है 5 , 7.
इम्यूनोपर्क्सिडास तकनीक में, माध्यमिक एंटीबॉडी बायोटिन के लिए संयुग्मी है, एक linker अणु एक क्रोमोजेनिक रिपोर्टर अणु की भर्ती करने में सक्षम [avidin-बायोटिन जटिल (एबीसी)], धुंधला संकेत के प्रवर्धन के लिए अग्रणी. एबीसी रिपोर्टर विधि के साथ, एंजाइम peroxidase 3,3'-diaminobenzidine (DAB) के साथ प्रतिक्रिया करता है, एक तीव्रता से भूरे रंग का दाग जहां एंजाइम माध्यमिक एंटीबॉडी को बांधता है, जो तब एक साधारण प्रकाश माइक्रोस्कोप के साथ विश्लेषण किया जा सकता उत्पादन. एबीसी धुंधला, biotin के लिए avidin की उच्च आत्मीयता के कारण, एक तेजी से और इष्टतम प्रतिक्रिया पैदा करता है, कुछ माध्यमिक प्राथमिक एंटीबॉडी प्रतिक्रिया की साइट से जुड़ी एंटीबॉडी के साथ. इस क्रोमोजेनिक का पता लगाने विधि संकेत के densitometric विश्लेषण के लिए अनुमति देता है, प्रोटीन अभिव्यक्ति के स्तर के साथ भूरे रंग के संकेत के स्तर के सहसंबंध के आधार पर अर्द्ध मात्रात्मक डेटा प्रदान18.
इम्यूनोफ्लोरेसींस तकनीकों के साथ, विभिन्न फ्लोरोक्रोम्स की अद्वितीय तरंगदैर्ध्य पर प्रकाश का उत्सर्जन करने की क्षमता के कारण एक साथ कई प्रोटीन का पता लगाना संभव है, लेकिन वर्णक्रमीय ओवरलैप को कम करने के लिए ध्यान से फ्लोरोक्रोम्स का चयन करना महत्वपूर्ण है 5. इसके अलावा, विभिन्न मेजबान प्रजातियों में प्राथमिक एंटीबॉडी का उपयोग क्रॉस-प्रतिक्रिया से संबंधित कठिनाइयों को कम करता है। इस मामले में, प्रत्येक प्रजाति-विशिष्ट माध्यमिक एंटीबॉडी केवल एक प्रकार के प्राथमिक एंटीबॉडी को पहचानता है। फ्लोरोसेंट पत्रकारों ऐसे एलेक्सा फ्लोर रंगों के रूप में वाणिज्यिक डेरिवेटिव, सहित छोटे कार्बनिक अणु हैं।
कई पशु मॉडल विशेष शारीरिक और रोग की स्थिति को समझने के लिए उपयोग किया जाता है। आज तक, यह स्थापित किया गया है कि कई चयापचय रास्ते विकास के दौरान संरक्षित कर रहे हैं. इसलिए, आईएचसी अध्ययन जैसे जेब्राफ़िश जैसे मॉडल जीवों में रोग विज्ञान औरगैर-रोगकी स्थितियों की उत्पत्ति और रखरखाव के बारे में अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते हैं। यह IHC प्रोटोकॉल है कि वयस्क ज़ेब्राफ़िश ऊतक पर किया जा सकता है और वितरण और OXA, OX-2R, और परिधीय और केंद्रीय स्तर पर CB1R के स्थानीयकरण की विस्तृत छवियों को प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल वर्णन करने के लिए इस रिपोर्ट का एक उद्देश्य है. इसके अलावा रिपोर्ट वयस्क ज़ेब्राफ़िश के परिधीय और केंद्रीय ऊतकों में दो प्रमुख IHC अप्रत्यक्ष तरीकों के आवेदन के लिए प्रोटोकॉल हैं. वर्णित अप्रत्यक्ष विधि है, जो उन मामलों में संकेत प्रवर्धन की अनुमति देता है जहां एक द्वितीयक एंटीबॉडी एक फ्लोरोसेंट डाई (प्रतिरक्षा रोग विधि) या एंजाइम रिपोर्टर (इम्युनोपर्ऑक्सिडेस विधि) के लिए संयुग्मी है। दोनों क्रोमोजेनिक और फ्लोरोसेंट का पता लगाने के तरीकों के फायदे और नुकसान के अधिकारी. इस प्रोटोकॉल में रिपोर्ट IHC का उपयोग है, मुख्य रूप से इम्यूनोफ्लोरेसेंस, वयस्क ज़ेब्राफ़िश में, एक पशु मॉडल व्यापक रूप से सिस्टम है कि विकासवादी विभिन्न शारीरिक और रोग स्थितियों में संरक्षित कर रहे हैं अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anti CB1</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab23703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti OX-2R</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-8074</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-OXA</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc8070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aquatex</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1,085,620,050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylated rabbit anti-goat</td>
			<td>Vector Lab</td>
			<td>BA-5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>citric acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>251275</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Nikon Eclipse Ti2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat</td>
			<td>Leica Biosystem</td>
			<td>CM3050S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>32670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital Camera</td>
			<td>Leica Biosystem</td>
			<td>DFC320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital Camera for confocal microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>DS-Qi2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti goat Alexa fluor 488-conjugated secondary antibodies</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A11055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti goat Alexa fluor 594-conjugated secondary antibodies</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A11058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti rabbit Alexa fluor 488-conjugated secondary antibodies</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A21206</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti rabbit Alexa fluor 594-conjugated secondary antibodies</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A21207</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol absolute</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20,821,330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Frozen section compound</td>
			<td>Leica Biosystem</td>
			<td>FSC 22 Frozen Section Media</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H2O2</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>31642</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20,252,290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImmPACT DAB</td>
			<td>Vector lab</td>
			<td>SK4105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Leica Biosystem</td>
			<td>DMI6000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td>Leica Biosystem</td>
			<td>RM2125RT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S9763</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4H2O</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S9638</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S8045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Donkey Serum</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D9663</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Rabbit Serum</td>
			<td>Vector lab</td>
			<td>S-5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>paraffin wax</td>
			<td>Carlo Erba</td>
			<td>46793801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraphormaldeyde</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium citrate dihydrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>W302600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Fluka Analytical</td>
			<td>93420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VectaStain Elite ABC Kit</td>
			<td>Vector lab</td>
			<td>PK6100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene Pure</td>
			<td>Carlo Erba</td>
			<td>392603</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of orexin and endocannabinoid receptors in adult zebrafish using immunoperoxidase and immunofluorescence methods

इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री (आईएचसी) एक अत्यधिक संवेदनशील और विशिष्ट तकनीक है जो लेबल वाले एंटीबॉडी के साथ ऊतक वर्गों में लक्ष्य प्रतिजनों का पता लगाने में शामिल है। यह एक बहुचरणी प्रक्रिया है जिसमें इष्टतम विशिष्ट संकेत प्राप्त करने के लिए प्रत्येक चरण का अनुकूलन महत्वपूर्ण होता है। आईएचसी के माध्यम से, विशिष्ट बायोमार्कर के वितरण और स्थानीयकरण का पता लगाया जा सकता है, विकासवादी संरक्षण के बारे में जानकारी का खुलासा किया जा सकता है। इसके अलावा, IHC अभिव्यक्ति और रोग की स्थिति में biomarkers के वितरण परिवर्तन की समझ के लिए अनुमति देता है, जैसे मोटापा. IHC, मुख्य रूप से इम्यूनोफ्लोरेसेंस तकनीक, संगठन और phylogenetically संरक्षित अणुओं के वितरण का पता लगाने के लिए वयस्क ज़ेब्राफ़िश में इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन एक मानक IHC प्रोटोकॉल estasblished नहीं है. Orexin और endocannabinoid दो अत्यधिक संरक्षित प्रणाली भोजन का सेवन और मोटापे की विकृति के नियंत्रण में शामिल हैं. यहाँ रिपोर्ट प्रोटोकॉल orexin पेप्टाइड के बारे में जानकारी प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं (OXA), orexin रिसेप्टर (OX-2R), और कैनाबिनोइड रिसेप्टर (CB1R) स्थानीयकरण और सामान्य और आहार प्रेरित मोटापे से ग्रस्त के मस्तिष्क में स्थानीय और वितरण (DIO) वयस्क ज़ेब्राफ़िश मॉडल. इसके अलावा इम्यूनोपर्क्सिडिडेज और डबल इम्यूनोफ्लोरेसेंस के लिए तरीके बताए गए हैं, साथ ही अभिकर्मकों की तैयारी, स्थिरीकरण, पैराफिट-एम्बेडिंग, और जेब्राफ़िश ऊतक के क्रायोप्रोटेंस और एक अंतर्जात गतिविधि-ब्लॉकिंग चरण और पृष्ठभूमि के लिए तैयारी प्रतिस्ने का। मापदंडों का पूरा सेट पिछले IHC प्रयोगों से प्राप्त किया जाता है, जिसके माध्यम से हमने दिखाया है कि कैसे इम्यूनोफ्लोरेसेंस OXs, OX-2R, और CB1R वितरण, स्थानीयकरण, और वयस्क ज़ेब्राफ़िश में अभिव्यक्ति के संरक्षण की समझ के साथ मदद कर सकता है ऊतकों. अत्यधिक विशिष्ट संकेत तीव्रता के साथ जिसके परिणामस्वरूप छवियों पुष्टि करने के लिए नेतृत्व किया है कि ज़ेब्राफ़िश वितरण के इम्यूनोहिस्टोकेमिकल अध्ययन के लिए उपयुक्त पशु मॉडल हैं, स्थानीयकरण, और में विशिष्ट biomarkers के विकास संरक्षण शारीरिक और रोग की स्थिति. यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल वयस्क ज़ेब्राफ़िश में IHC प्रयोगों के लिए सिफारिश कर रहे हैं.

इम्युनोपेरॉक्सिडेस अभिरंजन के प्रतिनिधि आंकड़े चित्र 1 और चित्र 2में दर्शाए गए हैं। वयस्क जेब्राफ़िश के पेट में ओएक्स-ए और ओएक्स-2 आर वितरण के इम्यूनोहिस्टोकेमिकल विश्लेषण ने ओ?...

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Identification of Orexin and Endocannabinoid Receptors in Adult Zebrafish Using Immunoperoxidase and Immunofluorescence Methods

वयस्क ज़ेब्राफ़िश में Orexin और Endocannabinoid रिसेप्टर्स की पहचान इम्यूनोपर्क्सीडेज और इम्यूनोफ्लोरेसींस तरीकों का उपयोग

यहाँ प्रस्तुत इम्यूनोहिस्टोकेमिकल विशेषता और orexin पेप्टाइड के स्थानीयकरण के लिए प्रोटोकॉल हैं, orexin रिसेप्टर्स, और आंत और सामान्य और आहार प्रेरित मोटापे के दिमाग में endocannabinoid रिसेप्टर्स (DIO) वयस्क ज़ेब्राफ़िश मॉडल का उपयोग कर इम्यूनोपेरिक्सीडास और डबल इम्यूनोफ्लोरेसीन तरीके।

Immunohistochemistry (IHC) is a highly sensitive and specific technique involved in the detection of target antigens in tissue sections with labeled ...

वर्तमान में, इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री का उपयोग विशिष्ट आणविक मार्कर की उपस्थिति और विकृतियों के मामले में उनके परिवर्तनों की पहचान करने के लिए बढ़ती आवृत्ति के साथ किया जाता है, जिससे मात्रात्मक विश्लेषण करने की संभावना को जड़ देते हैं। इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री, मुख्य रूप से इम्यूनोफ्लोरेसेंस तकनीक का उपयोग लार्वा और वयस्क जेब्राफिश पशु मॉडल में किया जाता है, लेकिन जेब्राफिश के लिए एक अच्छे मानक इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री प्रोटोकॉल के बारे में बहुत कम जाना जाता है। यहां, हम एक प्रोटोकॉल का वर्णन और वर्णन करते हैं जिसका उपयोग वयस्क जेब्राफिश में महत्वपूर्ण प्रोटीन के विकासवादी संरक्षण का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है।वयस्क जेब्राफिश में इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री के लिए एक अच्छा प्रोटोकॉल अत्यधिक संरक्षित जैव अणुओं की रूपात्मक अभिव्यक्ति और वितरण का अध्ययन करने के लिए इस पशु मॉडल की उपयोगिता को कम करने में मदद कर सकता है। यह विधि मानव फिजियोपैथोलॉजी से सहसंबद्ध रोगीय स्थितियों के कारण इन जैव अणुओं के संभावित परिवर्तनों का विश्लेषण करने में भी मदद कर सकती है। प्रक्रिया का प्रदर्शन डॉ Lea Tunisi, मेरी प्रयोगशाला से एक पीएचडी के छात्र होगा ।इस प्रक्रिया को शुरू करने के लिए, तैयार जमे हुए ऊतक ब्लॉकों को शून्य से 20 डिग्री सेल्सियस पर क्रायोस्टेट में स्थानांतरित करें। 10 माइक्रोमीटर के कोरोनल या सगिटल खंडों में ब्लॉक काटें। फिर, इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री के लिए उपयुक्त चिपकने वाले ग्लास स्लाइड पर वैकल्पिक धारावाहिक खंडों में ऊतकों को इकट्ठा करें, और आगे बढ़ने के लिए तैयार होने तक उन्हें शून्य से 20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।सबसे पहले, स्लाइड पर ऊतक क्षेत्र का सीमांकन करने के लिए एक सॉल्वेंट प्रतिरोधी कलम का उपयोग करें। 0.1-मोलर फॉस्फेट बफर का उपयोग करके प्रत्येक पांच मिनट के लिए तीन बार अनुभागों को कुल्ला करें। इसके बाद, ट्राइटन एक्स-100 के 0.3 मिलीलीटर को 0.1-मोलर फॉस्फेट बफर तैयार करने के लिए ट्राइटन एक्स-100 0.3% को भंग करने के लिए फॉस्फेट बफर में 0.1% सामान्य गधा सीरम को भंग करें जिसमें 0.3% ट्राइटन एक्स-100 शामिल है।सामान्य गधे सीरम के समाधान के साथ वर्गों को इनक्यूबेट करें जो परमीबिलाइजेशन बफर पीबी-ट्राइटन एक्स-100 0.3% में 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर कोशिका झिल्ली को पार करने और गैर-विशिष्ट बाध्यकारी साइटों को अवरुद्ध करने के लिए भंग करते हैं। सबसे पहले, 0.1-मोलर फॉस्फेट बफर के साथ प्रत्येक पांच मिनट के लिए तीन बार वर्गों कुल्ला। पीबी-टी में पतला प्राथमिक एंटीबॉडी का मिश्रण जोड़ें, और कमरे के तापमान पर एक आर्द्र बॉक्स में रात भर वर्गों को इनक्यूबेट करें।दिन के बाद, 0.1-मोलर फॉस्फेट बफर के साथ प्रत्येक पांच मिनट के लिए तीन बार वर्गों कुल्ला। पीबी-टी में पतला माध्यमिक एंटीबॉडी के उचित मिश्रण में दो घंटे के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट सेक्शन। शुरू करने के लिए, 0.1-मोलर फॉस्फेट बफर के साथ प्रत्येक पांच मिनट के लिए तीन बार वर्गों कुल्ला।न्यूक्लियर डाई डीएपीआई तैयार करने के लिए तीन मिलीलीटर फॉस्फेट बफर में दापी के 1.5 माइक्रोलीटर को भंग करें। डाई में अनुभागों को काउंटरटैन करें। फिर, लंबे समय तक उपयोग के लिए ऊतक और दाग को स्थिर करने के लिए स्लाइड को कवरलिप करने के लिए बढ़ते माध्यम का उपयोग करें।फ्लोरोसेंट नमूनों को चार डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में संग्रहित किया जा सकता है। इम्यूनोफ्लोरेसेंस प्रोटोकॉल दोहराएं, और या तो प्राथमिक या माध्यमिक एंटीबॉडी को छोड़ दें, या नकारात्मक नियंत्रण तैयार करने के लिए फॉस्फेट बफर के साथ प्राथमिक या माध्यमिक एंटीसेरम को प्रतिस्थापित करें। इसके बाद, इम्यूनोफ्लोरेसेंस प्रोटोकॉल दोहराएं, और सापेक्ष पेप्टाइड की अधिकता के साथ प्रत्येक प्राथमिक एंटीबॉडी को पूर्व-अवशोषित करें।सकारात्मक नियंत्रण तैयार करने के लिए माउस मस्तिष्क के स्लाइस पर इम्यूनोफ्लोरेसेंस प्रोटोकॉल दोहराएं। एक्स-वाई-जेड मोटराइज्ड स्टेज, एक डिजिटल कैमरा और अधिग्रहण और विश्लेषण सॉफ्टवेयर से लैस कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग करके, इम्यूनो दाग वर्गों का निरीक्षण और विश्लेषण करें। 5x, 20x, और 40x उद्देश्यों के साथ डिजिटल छवियों का अधिग्रहण करें।कम आवर्धन असेंबल की रचना करने के लिए उपलब्ध चैनलों में से प्रत्येक में कम आवर्धन पर प्रत्येक अनुभाग की छवियां लें। फ्लोरेसेंस छवियों को अधिकतम विपरीत और ओवरले तक सामान्य करें। ब्याज के क्षेत्र में, एक से १.८ माइक्रोमीटर के फोकल चरणों के साथ छह फोकल विमानों के माध्यम से छवियों के सीरियल जेड-स्टैक इकट्ठा करें ।प्रत्येक चैनल के लिए इस संग्रह को अलग से करें। इसके बाद, इमेजिंग डिकोवोल्यूशन सॉफ्टवेयर का उपयोग 10 पुनरावृत्तियों के अनुप्रयोग द्वारा छवियों को डिकोवोल्व करने के लिए करें, और धारावाहिक जेड-प्लेन छवियों को एक अधिकतम प्रक्षेपण छवि में ध्वस्त करें। प्रकाश और इसके विपरीत के लिए माइक्रोग्राफ को समायोजित करने के लिए एक उपयुक्त छवि संपादन सॉफ्टवेयर का उपयोग करें।वयस्क जेब्राफिश के पेट में OX-A और OX-2R वितरण के इम्यूनोहिस्टोकेमिकल विश्लेषण से पता चलता है कि ऑक्स-ए और ऑक्स-2आर की विभिन्न स्थानीयकरण साइटें और डीआईओ जेब्राफिश की आंतों की कोशिकाओं में अभिव्यक्ति में उनकी वृद्धि। ऑक्स-ए के लिए एक तीव्र भूरे रंग का धुंधला मध्य और पूर्वकाल आंत की कोशिकाओं में मनाया जाता है। ऑक्स-ए का इम्यूनोएक्सपियन विभिन्न आंत के डिब्बों में स्पष्ट संकेत देता है, जो पूर्वकाल से मध्यीय आंत की ओर कम होता है।इसी तरह के परिणाम डीआईओ की आंत में OX-2R इम्यूनोएक्सप्रेशन और नियंत्रण आहार जेब्राफिश के लिए मनाया जाता है। डीआईओ वयस्क जेब्राफिश में एक बढ़ा हुआ OX-एक संकेत अन्य आंतों के डिब्बों में OX-2R के अतिव्यवसंन के साथ होता है। इम्यूनोफ्लोरोसेंट छवियों का सटीक विश्लेषण नियंत्रण आहार जेब्राफिश की तुलना में डीआईओ वयस्क जेब्राफिश के पेट में OX-2R/CB1R colocalization की वृद्धि से पता चलता है ।इसी तरह की स्थिति विभिन्न मस्तिष्क क्षेत्रों में देखी जाती है, जैसे पृष्ठीय टेलेंसेफलन, हाइपोथैलेमस, ऑप्टिक टेक्टम, टोरस लेटलैलिस, और अवर पालि के फैलाना नाभिक। ओरेक्सिन-ए और सीबी1आर कोलोकैलाइजेशन के साथ डबल इम्यूनोस्टेटिंग करके, यह देखा गया है कि हाइपोथैलेमस के ओरेक्सिनर्जिक न्यूरॉन्स में कोलोकैलाइजेशन की वृद्धि हुई थी, जिसमें ओरेक्सिन-ए फ्लोरोसेंट सिग्नल की वृद्धि हुई थी। इन परिणामों से पता चलता है कि कैसे डबल इम्यूनोफ्लोरेसेंस शारीरिक रूप से संरक्षित प्रोटीन अभिव्यक्ति, लक्षित प्रोटीन के कोलोकैलाइजेशन, और उनके वितरण और/या अभिव्यक्ति विभिन्न रोग स्थितियों में परिवर्तन की पहचान करने में मदद कर सकते हैं ।इम्यूनोफ्लोरेसेंस का उपयोग करके, हम जैव अणुओं के सह-वितरण और सह-सेवन, उनकी संभावित बातचीत को बेहतर ढंग से समझ सकते हैं, और हम विभिन्न विकृतियों के मामले में उनके परिवर्तनों की एक दृश्यमान छवि भी कर सकते हैं। इसके अलावा, मेटाबोलिक एंजाइम अभिव्यक्ति या रिसेप्टर्स के न्यूरोएनाटॉमिकल वितरण से ऊतकों के भीतर प्रोटीन सिग्नलिंग की भूमिका का पता चल सकता है। वर्तमान तकनीकी कार्य ने वयस्क जेब्राफिश मॉडल का उपयोग करने में दो अत्यधिक संरक्षित प्रणाली, ओरेक्सिन और एंडोकैनाबिनॉइड का अध्ययन करने के लिए इम्यूनोफ्लोरेसेंस दृष्टिकोण पेश किया।वयस्क जेब्राफिश के मस्तिष्क में पहली बार वर्णित इस प्रोटोकॉल का उपयोग करना, ओरेक्सिन-2 रिसेप्टर्स और एंडोकैनाबिनॉइड-सीबी1 रिसेप्टर्स के शारीरिक वितरण और सह-प्रसार का निर्धारण नहीं किया गया है। हम इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री प्रयोगों के लिए यहां वर्णित प्रोटोकॉल की सलाह देते हैं और उनके कार्यों को बेहतर ढंग से समझने के लिए वयस्क जेब्राफिश में पेप्टाइड्स में स्थानिक वितरण और रिसेप्टर्स के संगठन का पता लगाने के लिए।

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Identification of Plant Ice-binding Proteins Through Assessment of Ice-recrystallization Inhibition and Isolation Using Ice-affinity Purification

संयंत्र आइस recrystallization निषेध और अलगाव के मूल्यांकन के माध्यम से बर्फ बाध्यकारी प्रोटीन आइस आत्मीयता शोधन का उपयोग करते हुए की पहचान

Ice-binding proteins (IBPs) belong to a family of stress-induced proteins that are synthesized by certain organisms exposed to subzero temperatures. In ...

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

आरएनए-बाइंडिंग क्षेत्रों की सामूहिक स्पेक्ट्रोमेट्री-आधारित पहचान के लिए नमूना तैयारी

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

The Identification of Sea Lamprey Pheromones Using Bioassay-Guided Fractionation

समुद्र Lamprey Pheromones की पहचान परख का उपयोग-निर्देशित भिंन

Bioassay-guided fractionation is an iterative approach that uses the results of physiological and behavioral bioassays to guide the isolation and ...

Capture and Identification of RNA-binding Proteins by Using Click Chemistry-assisted RNA-interactome Capture (CARIC) Strategy

Capture and Identification of RNA-binding Proteins by Using Click Chemistry-assisted RNA-interactome Capture CARIC Strategy

पर कब्जा और क्लिक करें रसायन-सहायता प्राप्त आरएनए-interactome कैप्चर (CARIC) रणनीति का उपयोग करके आरएनए बाइंडिंग प्रोटीन की पहचान

A comprehensive identification of RNA-binding proteins (RBPs) is key to understanding the posttranscriptional regulatory network in cells. A widely used ...

Identification of Novel CK2 Kinase Substrates Using a Versatile Biochemical Approach

उपंयास की पहचान CK2 kinase एक बहुमुखी जैव रासायनिक दृष्टिकोण का उपयोग substrates

The study of kinase-substrate relationships is essential to gain a complete understanding of the functions of these enzymes and their downstream targets ...

Nitropeptide Profiling and Identification Illustrated by Angiotensin II

Nitropeptide प्रोफ़ेशनल और पहचान एंजियोटेन्सिन द्वितीय द्वारा सचित्र

Protein nitration is one of the most important post-translational modifications (PTM) on tyrosine residues and it can be induced by chemical actions of ...

SUMO-Binding Entities (SUBEs) as Tools for the Enrichment, Isolation, Identification, and Characterization of the SUMO Proteome in Liver Cancer

SUMO-Binding Entities SUBEs as Tools for the Enrichment, Isolation, Identification, and Characterization of the SUMO Proteome in Liver Cancer

लीवर कैंसर में सूमो प्रोटेओम के संवर्धन, अलगाव, पहचान, और विशेषता के लिए उपकरण के रूप में SUMO-Binding संस्थाओं (SUBEs)

Post-translational modification is a key mechanism regulating protein homeostasis and function in eukaryotic cells. Among all ubiquitin-like proteins in ...

Profiling Ubiquitin and Ubiquitin-like Dependent Post-translational Modifications and Identification of Significant Alterations

सर्वव्यापकता और सर्वव्यापी की तरह निर्भर पोस्ट-ट्रांसलेशनल संशोधनों और महत्वपूर्ण परिवर्तनों की पहचान की रूपरेखा

Ubiquitin (ub) and ubiquitin-like (ubl) dependent post-translational modifications of proteins play fundamental biological regulatory roles within the ...

Visualization of Estrogen Receptors in Colons of Mice with TNBS-Induced Crohn's Disease using Immunofluorescence

इम्यूनोफ्लोरेसेंस का उपयोग करके टीएनबी-प्रेरित क्रोन रोग के साथ चूहों के कोलोन में एस्ट्रोजन रिसेप्टर्स का दृश्य

Crohn&#39;s disease is the most diagnosed type of inflammatory bowel disease. Chronic inflammation developing in the intestine leads to peristalsis ...