Name: real-time live-cell flow cytometry to investigate calcium influx, pore formation, and phagocytosis by p2x7 receptors in adult neural progenitor cells
Uploaded: 2019-04-03T14:00:00
Duration: 11 min 47 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Real-time Live-cell Flow Cytometry to Investigate Calcium Influx, Pore Formation, and Phagocytosis by P2X7 Receptors in Adult Neural Progenitor Cells at JoVE.

저자는 마리아 Kasherman과 티베트 황이이 연구에 그들의 공헌에 감사 하 고 싶습니다. 이 작품에서 국민 건강 및 의료 연구 위원회 (NHMRC) 호주 (571100 및 1048082) 및 터 자선 재단 (M.W., T.C.L., 및 메이저 리그, 그리고 T.C.L.를 레 베 카 L. 쿠퍼 의학 연구 재단에서 교부 금에 의해 지원 되었다 시드니, 호주)입니다. B.G. 오스트레일리아 연구 위원회 (아크) 미래 친교 (FT120100581), NHMRC 프로젝트 보조금 (1048082, 1061419, 및 1120095) 및 빅토리아 정부의 운영 인프라 지원 그랜트 Florey 연구소에 의해 지원 되었다. 메이저 리그는 찰스 D. 산장, 메릴랜드 박사 수상 (2010) 국제 망막 연구 재단 (미국)에서 의해 지원 되었다.

동물 과학적 목적에 대 한 관심과 동물의 사용에 대 한 호주 코드 연습에 따라 처리 하 고 그리피스 대학 동물 윤리 위원회에 의해 사용을 위해 승인 되었다.
1. Neurosphere 문화 성인 SVZ와 해 마의 신경 조상 세포의
참고: 여기 해 부 프로토콜 기반 작업 워커와 Kempermann, 그리고 성인 쥐에서 신경 조상 세포의 해 부에 대 한 자세한 프로토콜은 다른 곳에서 사용할 수14. 문화 조건 간디와 동료15에서 수정 되었습니다. 8-12 주 세 성인 여성 C57BL/6 마우스 사용 되었다.
<ol><li>생물 안전 캐비닛, 준비와 신경 줄기 세포 확산 보충, 2mm 글루타민, 20 ng/mL 표 피 성장 인자 (EGF), 10 ng/mL 기본적인 섬유 아 세포 성장 인자 (bFGF), 2 µ g/mL 보충 문화 매체 (신경 기저 매체) 헤 파 린입니다.</li>
	<li>CO2 흡입에 의해 두 마우스를 안락사. 또는 기관의 지침에 따라 마우스를 anesthetize 하 고 즉시 자 궁 경부 전위에 의해 안락사. 70% 에탄올과 그들의 머리를 스프레이 하 고 그들을 목을 벨. 1 x 페니실린/스 솔루션 (P/S)와 포함 하는 행 크의 균형된 소금물 (HBSS) 무 균 튜브에 각 머리를 전송.</li>
	<li>해 부 현미경 아래 층 류 두건에 해를 수행 합니다.</li>
	<li>집게 및 해 부가 위를 사용 하 여 조직과 뼈 노출은 뇌를 제거 하 고 HBSS P/미와를 포함 하는 메 마른 요리에 그것을 전송합니다</li>
	<li>뇌 복 부 측을 놓고 메스 블레이드를 사용 하 여 광학 chiasm에 걸쳐 완전 한 코로나 절 개를 하 게 합니다. 집게와 꾸준한 두뇌를 보유 하 고 사용 하나 스위프트, 깨끗 한, 하강 운동. 세포 죽음을 최소화 하 고 조직 구조를 유지 하기 위해 톱 질 하지 마십시오. 참고: 안전 하 게 지지, 두뇌 앞으로 기울 수 컷, 동안에 SVZ에서 얻은 조상 세포의 수를 손상 시 키 지.</li>
	<li>두뇌의 rostral 절반에서 SVZ를 격리 합니다.
	<ol>
<li>두 심을, 그들 위에 흰색 다리를 형성 하는 신체 callosum, 심장으로 구분을 찾습니다.</li>
		<li>집게를 사용 하 여 두 심 분리 심장 제거 하 고 앞쪽 측면 심의 측면 벽을 격리. 이렇게 멀리 위, 아래, 측면, 그리고 앞에 잘 해 부가 위 절단 합니다. 그냥 작은 컵 같은 모양이 유지 됩니다.</li>
		<li>HBSS는 중간에 몇 방울으로 깨끗 한 Petri 접시 뚜껑을 준비 하 고 액체에는 SVZ를 전송. 건조 하거나 마른 표면을 조직을 허용 하지 않습니다. 고 된 해 부 동안 옆에 서 있다.</li>
	</ol></li>
	<li>두뇌의 꼬리 반에서 된 격리 합니다.
	<ol>
<li>중간 절단 신체 callosum에 반구 사이 컷을 확인 합니다. 측면 심 가이드로 사용 하 고 노출 해 마 피를 부드럽게 전개. 일단 피 질 압 연 하고있다, 해 마는 조밀 하 고, 백색, 곡선 구조로 볼 수 있습니다.</li>
		<li>잘 해 부가 위 또는 집게를 사용 하 여 인접 조직에서 해 마를 분리.</li>
		<li>집게와 초과 백색 질, 혈관, 및 해 마를 덮고 어떤 막 조직을 제거 합니다.</li>
		<li>깨끗 한 Petri 접시 뚜껑 HBSS의 몇 방울과 함께 준비를 준비 하 고 액체에는 해 마를 전송. 다른 반구에 대 한 반복 합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>해 마와 두 개의 마우스에서 SVZ 절연 되었고 그들의 각각 샬레 뚜껑을 전송, 일단 기계적 조직 메스 블레이드를 사용 하 여 주사위. 약 1 분 동안 한 Petri 접시 뚜껑에 조직을 잘라, 회전 마다 10 s 조직 부드러운 때까지 및 정밀한 조각만 남아 있다. 깨끗 한 메스 블레이드를 걸릴 고 다른 접시, 1 분 동안 조직 다이 싱에 대 한 반복 합니다.</li>
	<li>1 mL 피 펫을 사용 하 여 0.25% trypsin ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA)의 1 mL를 포함 하는 튜브를 분리 하 각 페 트리 접시의 뚜껑에서 모든 조직 전송. SVZ와 해 마에 대 한 1 개의 관에 대 한 하나의 튜브를 사용 합니다.
	<ol>
<li>이렇게 첫 번째 pipetting 기포를 최소화 하 고 튜브를 전송으로 건조 피 펫 팁의 접촉으로 오는 조직 방지 하기 위해 접시에 조직에 트립 신-EDTA의 절반 합니다. 접시와 수집 가능한 많은 조직 관에 그것을 추가 하는 트립 신-EDTA의 나머지와 함께 메스 칼 린스.</li>
	</ol></li>
	<li>30 분, 제대로 조직 분리를 튜브 마다 10 분 교 반에 대 한 37 ° C 물 욕조에 트립 신으로 조직 품 어.</li>
	<li>단일 세포 현 탁 액을 화재 광택 유리 파스퇴르 피 펫을 사용 하 여 조직 triturate 알아서 하지 overtriturate이 과도 한 세포 세포의 용 해를 일으킬 것입니다. 이것은 최적의 조직 분리에 대 한 중요 한 단계 이다.</li>
	<li>분쇄 과정에서 튜브 내용을 관찰 하 고 조직 덩어리의 대부분 제거 된 초기 징후에 중지. 트립 신 솔루션 해야 될 약간 흐린 셀 단일 셀 서 스 펜 션에 갔을 때 비록 일부 대단히 짧은 시간에 남아 있을 수 있습니다. 참고: 표시로 전달 10 x-15 x 위아래로 정지 적절 한입니다.</li>
	<li>문화 매체 추가 중화 하는 트립 신, 고 추가 3 분 세척에 대 한 300 x g 에서 회전까지 5 mL HBSS와 패스 2 x 70 µ m 셀 거르는 어떤 조직을 제거를 통해 매체 묶습니다.</li>
	<li>T75 셀 문화 플라스 크에 매체의 15 mL의 모든 셀을 전송 합니다. 참고: 제로 (P0) 통로에서 형성 한다 구체 SVZ 문화 그리고 hippocampal 문화에서 15-20 일 후 7-10 일 후. 세척 또는 문화에 있는 신경 조상 세포의 수를 최대화 하려면이 시간 동안 세포를 먹이 기에서 후 렴. 더 많은 창시자는 필요, 또는 경우 P0 보육 시간 감소, 그것은 희생 하는 쥐의 수를 늘릴 수 있습니다.</li>
	<li>37 ° C와 5% CO2 , 초기 P0 문화 단계에서 문화를 유지, 생물 안전 캐비닛 및 표준 조직 문화 사례를 사용 하 여 필요에 따라 모든 7-10 일 통행. 참고: P0 hippocampal 문화 T25 플라스 크;에 통로에 충분 한 분야를 생성 한다 SVZ 문화 많은 더 많은 분야 생성 되 고는 T75에 passaged 수 있습니다. P0 hippocampal 분야는 준수 하는 경우 200 µ L 피 펫을 사용 하 여 영역을 부드럽게 리프트.</li>
	<li>그들은 150 ~ 200 µ m 직경에 도달 했을 때 구체 통로. 분야와 매체 15 mL 튜브에 수집 하 고 약 5 분 또는 중력에 의해 정착, 2 분 동안 저속 (100 x g)에 스핀을 구체 허용.</li>
	<li>매체를 제거 하 고 분리 시 약 분야의 크기에 따라 7-10 분에 대 한 셀을 분리. 참고: 분리 시 약 사용 그래서 문화권의 결과에 상당한 영향을 있을 것 이다 구체적인 테이블의 자료 를 참조 하십시오.</li>
	<li>세척 셀 솔루션을 위해 3 분 300 x g 에서 원심 분리기 HBSS의 5 mL을 추가 하 여 셀 제거는 상쾌한, 문화 매체에 셀 resuspend 및 T25 세포 배양 플라스 크 또는 이와 동등한 매체의 5 mL에 약 150000 셀에서 씨앗. 37 ° C, 5% CO2에서 문화를 유지 합니다.</li>
	<li>모든 다운스트림 프로토콜9를 진행 하기 전에 줄기 세포 마커 Sox2, ASCL1 등의 식 식별 하 여 신경 조상 세포 상태를 확인 합니다. 참고: 이 연구원의 선호 되는 방법 (예를 들어,: immunochemistry 현미경 검사 법, cytometry 또는 서쪽 오 점 또는 정량적 중 합 효소 연쇄 반응 (정량)를 사용 하 여)에 의해 행 해질 수 있다.</li>
</ol>2. Cytometry 분석에 대 한 단일 세포 현 탁 액의 준비
<ol><li>
필요한 미디어를 준비 합니다. 다음 포함 됩니다.
	<ol>
<li>145 mM NaCl, 5mm 코, 10 mM HEPES, 5mm D-포도 당, 0.1% 소 혈 청 알 부 민 (BSA), 그리고 0.1 m m CaCl2 나+ 매체 를 준비 합니다. 이 매체는 칼슘 무료 양식, 0.1 m m CaCl2 생략에 사용 됩니다.</li>
		<li>K+ 매체 145 m m KCl, 5mm 코, 10 mM HEPES, 5mm D-포도 당, 그리고 0.1 %BSA 준비 합니다. 참고: 이러한 미디어 최적화 광범위 하 게 했다 고 이전 간행물4,5에 자세히 나와 있습니다.</li>
		<li>100 m m 재고의 약 20 mL에 대 한 충분 한 ATP 분말 무게 재고 ATP 를 준비 합니다. KCl 버퍼 (145 m KCl m, 5 m m 코, 그리고 10 mM HEPES, pH 7.5)의 17 mL에 분말 고 천천히, 교 반, 동안 pH 6.8-7.0가지고 솔루션을 18% (w/v) 하거나 수산화 (TMA)의 2 개 mL를 추가 합니다.</li>
		<li>20 mL를 최종 볼륨을 조정 합니다. PH 7.0 과거 오버 슈트 하지 마십시오. 재고-80 ° C에서 저장 참고 최소 6 개월에 대 한 ATP aliquots는 안정. 참고: 무수 ATP의 무료 분자량은 551.14 g/mol, 그리고 배치에서 배치에 따라 달라질 수 있습니다 고 계산에 대 한 고려 사항으로가지고 야 한다 물과 disodium 분자의 분자량은 포함 되지 않습니다. TMA은 독성, 그리고 주의 해야 합니다 처리 하는 경우. 안전 데이터 시트와 연기 캐비닛에 주식 준비를 읽어 보시기 바랍니다.</li>
		<li>주식 BzATP 초순 H2O 10 m m의 마지막 재고 농도 대 한 BzATP을 용 해 하 여 준비 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>1.16-1.17 단계에 설명 된 대로 단일 세포 현 탁 액을 만듭니다. Hemocytometer 또는 자동 셀 카운터를 사용 하 여 셀을 계산 합니다. (아래와 같이) 실시 되는 실험에 대 한 필요한 매체 (예를들면, Na+ 매체, 문화 매체)에 셀 resuspend 하 고 반면에 얼음에 셀을 놓습니다.</li>
	<li>각 실험에 대 한 충분 한 샘플 전압 및 보상 설정의 교정 뿐만 아니라 앞으로 및 측면 분산형, 컨트롤을 포함 하는 확인 합니다. Note, 표시, T75 플라스 크에서 일반적으로 성장 하는 분야 플라스 크 당 약 8 x 106 세포 생성.</li>
	<li>
교류 cytometer 설정을 컨트롤 샘플을 사용 하 여 설정 합니다.
	<ol>
<li>앞으로 및 측면 분산형을 사용 하 여 선택적으로 살아있는 세포를 게이트. 참고: 앞으로 분산형 측면 분산형 내부 복잡성 또는 세분성의 측정값을 제공 한다 빛의 회절에 따라 셀 크기에 관한 정보를 제공 합니다. 스몰 포워드와 사이드 분산형 흐름 이벤트 죽은 세포로 간주 될 수 있습니다.</li>
		<li>전압을 조정 하 고 제조업체의 지침에 따라 교류 cytometer의 이득. 최대 형광 강도에서 데이터의 캡처 수 있도록 시험 샘플을 실행 합니다. 보상은 단일 채널 인수에 대 한 필요 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 라이브 셀 흐름 Cytometry 칼슘 유입 측정
<ol><li>단일 셀 서 스 펜 션의 준비에 따라 칼슘 무료 나+ 매체의 1 mL에 셀 resuspend 및 제조업체의 프로토콜에 따라 칼슘 지시자 염료의 2 ng/mL와 함께 그들을 로드 ( 테이블의 자료를 참조)와 10 µ L 5 %pluronic 산. 37 ° c.에 30 분에 대 한 셀을 품 어</li>
	<li>세포 칼슘 무료 나+ 매체의 3-5 mL을 추가 하 고 부드럽게 centrifuging 여 세척 (200 x g 4 분). 상쾌한을 제거 하 고 두 번 세척 칼슘 무료 나+ 매체에 셀 resuspend.</li>
	<li>Resuspend 칼슘 무료 나+ 매체의 1 mL에 셀, 얼음에 고 드 30 분 esterify 하도록 허용.</li>
	<li>1 x K+ 매체의 3-5 mL을 추가 하 고 (200 x g 4 분); centrifuging 여 더 씻으십시오 그런 다음 resuspend k+ 매체 및 aliquot 셀 그들 (FACS) 정렬 보조 셀 튜브 FACS 튜브 당 500 µ L 당 1 x 106 세포의 농도에 형광으로. 참고: FACS 튜브 샘플 당 수 치료의 수에 따라 달라 집니다 고는 포함을 반복 합니다.</li>
	<li>셀 분석할 준비가 될 때까지 얼음에 FACS 튜브를 놓습니다. 오랜된 기간 동안 얼음에 셀 떠나 지 마 하지만 분석 결과 최대한 빨리 시작.</li>
	<li>일부 샘플에 대 한 preincubate P2X7 수용 체 특정 억제제 AZ10606120 셀 (1 µ M 10-15 분) 또는 A438079 (30 분 10 µ M) 분석 이전 37 ° C에서.</li>
	<li>첫 번째 샘플을 실행 하기 전에 몇 분 (FACS 튜브에 1 mM의 최종 농도)에 CaCl2 를 추가 하 고 복구 하는 37 ° C 물 목욕에서 튜브를 놓습니다.</li>
	<li>깨끗 한 삭제, FACS 튜브 및 위치에 작은 자력 제어 샘플 온도 순환 37 ° C 물 목욕 시간 모듈에 튜브 연결. 소용돌이 효과 도입 하지 않고 샘플의 움직임을 보장 하기 위해 낮은 교 반 속도 선택 합니다. 물 재킷 튜브 어댑터 샘플 플랫폼에 놓고 FACS 기계의 레버 팔을 닫습니다.</li>
	<li>샘플 수집을 시작 하 고 초당 약 1000 이벤트에서 3 분에 대 한 샘플을 실행 합니다.</li>
	<li>40 s 마크, 신속 하 게 튜브를 제거 하 고 추가 P2X7 주 작동 근, ATP 1 mM 또는 300 µ M BzATP, 인수를 계속 해 서 튜브를 교체 하 고.</li>
	<li>첫 번째 샘플을 녹음 하는 동안 CaCl2 두 번째 샘플을 준비 하 고 분석 하기 전에 워밍업을 셀에 대 한 충분 한 시간을 허용 하도록 37 ° C에. 첫 번째 샘플 완료 되 면, 물 샘플을 실행 하 여 섭취를 청소 하 고 두 번째 샘플의 수집 단계 3.8 및 3.9에에서 설명 된 대로 시작할 수 있습니다. 항상 샘플 사이 섭취 청소.</li>
</ol>4. 측정 라이브 셀 Cytometry에 의해 기 공 형성
<ol><li>1.16-1.17 단계에 설명 된 대로 단일 세포 현 탁 액을 만듭니다. 오래 된 매체의 몇 밀리 리터를 저장 하 고 resuspend FACS 튜브 당 100 µ L 당 1 x 106 세포의 농도에서 세포를 그것을 사용 하 여 준비까지 얼음에 그것을 배치.</li>
	<li>분석 결과 실행 하기 전에 1 mL의 최종 볼륨에 대 한 K+ 매체의 900 µ L을 추가 하 고 복구를 10 분 동안 37 ° C 물 욕조에 튜브를 배치 합니다.</li>
	<li>해당 되는 경우 치료, P2X7 전용 억제제 AZ10606120를 포함 하 여 셀 preincubate (10-15 분 1 µ M) 또는 A438079 (30 분 10 µ M).</li>
	<li>분석 결과 실행 하기 전에 즉시 추가 25 µ M ethidium 평범한 사람 FACS 튜브; 그런 다음, 자력, 추가 단계 3.7에 따라 FACS 기계에 그것을 배치 하 고 인수를 시작. 참고: Ethidium 평범한 사람은 독성, 그리고 주의 해야 한다 그것을 처리 하는 경우. FACS 튜브 사용된 적절 하 게 폐기 합니다.</li>
	<li>세포 막에 있는 숨 구멍의 대형을 유도 하는 수집의 시작 후 1mm ATP 또는 100 µ M BzATP 40 s를 추가 합니다.</li>
	<li>6 분 동안 초당 약 1000 이벤트에서 샘플을 실행 합니다.</li>
	<li>첫 번째 샘플을 실행 하는 동안 두 번째 샘플은 얼음에서 고 37 ° C 물 목욕 분석 전 복구 하 셀에 대 한 충분 한 시간을. 첫 번째 예제는 인수 완료 되 면, 물 샘플;를 실행 하 여 섭취를 청소 그런 다음, 두 번째 샘플 단계 3.8 및 3.9에에서 설명 된 대로 녹음을 하려면 컴퓨터에 배치할 수 있습니다.</li>
</ol>5. 측정 라이브 셀 Cytometry에 의해 식 균 작용
<ol><li>1.16-1.17 단계에 설명 된 대로 단일 세포 현 탁 액을 만듭니다. 조건된 중에 FACS에 FACS 튜브 당 100 µ L 당 1 x 10 이상6 셀의 농도에 관 약 수 셀 resuspend 1 x 106 셀/mL 나+ 매체의 최종 농도에 세포를 희석 (예를 들어, 추가 나+ 매체의 900 µ L) 분석 수행 될 때까지 얼음에 셀을 놓습니다.</li>
	<li>Phagocytic 대상으로 YG 라텍스 구슬 (스피어)의 1 개의 µ m를 사용 하 여 실시간 먹어서 분석 실험에 대 한. 참고: 다른 색상도 대체 될 수 있습니다, 하지만 다르게 크기의 구슬을 먹어서4의 부적당 한 표적이 될 것을 발견 했다.</li>
	<li>첫 번째 예제를 실행 하기 전에 셀 37 ° C 물 목욕을 전송 하 고 복구를 셀 수 있도록 약 7-10 분 동안 그들을 품 어.</li>
	<li>
1mm ATP 15 분을 포함 하 여 그들의 각각 튜브에 preincubation를 요구 하는 어떤 처리 든 지 추가, 300 µ M 산화 ATP (oxATP) 40 분, 20 분 및 20 분 동안 4 %paraformaldehyde (PFA) 20 µ M cytochalasin D.
	<ol>
<li>아무 preincubation는 5% 인간 혈 청에 대 한 필요 합니다. 치료 약 동시에 추가 하는 경우 샘플 실행할 수 있습니다 반대 순서로 다른 사람 품 어를 계속 하는 동안. 예를 들어 실행 컨트롤 및 혈 청 먼저, 다음 ATP 치료 샘플, cytochalasin D와 PFA, 그리고 oxATP 마지막 다음.</li>
	</ol>
</li>
	<li>샘플에는 자력으로 cytometer 3.8 및 3.9 단계에 설명 된 대로 놓고, 다음, 샘플 수집을 시작 합니다.</li>
	<li>제거 샘플 튜브는 기계에서 15-20의 수집, 시작 후 고 undiluted YG 구슬의 5 µ L를 추가 합니다. 샘플 FACS 튜브를 반환 하 고 인수를 계속 합니다. 약 1000 이벤트/s에서 7-8 분에 대 한 샘플을 실행 합니다.</li>
	<li>첫 번째 샘플을 실행 하는 동안 두 번째 샘플은 얼음에서 고 분석 전 복구 하 셀에 대 한 충분 한 시간을 허용 하는 37 ° C 물 목욕에. 첫 번째 샘플 완료 되 면 섭취 물 샘플을 실행 하 여 깨끗 하 고, 다음, 두 번째 샘플에 수집을 시작 하는 단계 3.8 및 3.9에에서 설명 된 대로.</li>
</ol>6. 데이터 분석
<ol><li>스프레드시트 데이터를 내보냅니다. 데이터 분석 실험 질문에 따라 달라 집니다. 참고: 주의 시작에 지정 된 시간에 대 한 분석 결과 실행 하는 것이 중요 하다 그래서 다른 실행 다른 초기 농도을 할 수 있습니다 (약 40 s) 형광 (형광 변화를 계산 하 여 데이터를 정규화 하 고 어떤 촉진제를 추가 하기 전에 주어진 시간 포인트 [F] 형광 시간 포인트 0에서 [F0], 또는 F/F0 나눈에).</li>
	<li>계량 속도 또는 P2X7 함수에의 활동, 곡선 또는 곡선 각 10 s 시간 기간16에서 사다리꼴의 합계 아래 영역을 계산 합니다.</li>
	<li>치료의 효과 확인 하려면 기록의 마지막 10-20 s 형광 강도 평균 고 치료 됩니다. T의미 확인-테스트 또는 분산 분석.</li>
</ol>

<ol>
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S., Sperlagh, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lack+of+ATP-evoked+GABA+and+glutamate+release+in+the+hippocampus+of+P2X7+receptor-/-+mice.">Lack of ATP-evoked GABA and glutamate release in the hippocampus of P2X7 receptor-/- mice.</a> Neuroreport. 15 (15), 2387-2391 (2004).</li><li>Wiley, J. S., Gu, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+role+for+the+P2X7+receptor:+a+scavenger+receptor+for+bacteria+and+apoptotic+cells+in+the+absence+of+serum+and+extracellular+ATP.">A new role for the P2X7 receptor: a scavenger receptor for bacteria and apoptotic cells in the absence of serum and extracellular ATP.</a> Purinergic Signalling. 8 (3), 579-586 (2012).</li><li>Lovelace, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P2X7+receptors+mediate+innate+phagocytosis+by+human+neural+precursor+cells+and+neuroblasts.">P2X7 receptors mediate innate phagocytosis by human neural precursor cells and neuroblasts.</a> Stem Cells. 33 (2), 526-541 (2015).</li><li>Walker, T. L., Kempermann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One+mouse,+two+cultures:+isolation+and+culture+of+adult+neural+stem+cells+from+the+two+neurogenic+zones+of+individual+mice.">One mouse, two cultures: isolation and culture of adult neural stem cells from the two neurogenic zones of individual mice.</a> Journal of Visualized Experiments. (84), e51225 (2014).</li><li>Babu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+isolation+and+enriched+monolayer+cultivation+of+neural+precursor+cells+from+mouse+dentate+gyrus.">A protocol for isolation and enriched monolayer cultivation of neural precursor cells from mouse dentate gyrus.</a> Frontiers in Neuroscience. 5, 89 (2011).</li><li>Gu, B. J., Wiley, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Broad+applications+of+mulit-colour+time-resolved+flow+cytometry.">Broad applications of mulit-colour time-resolved flow cytometry.</a> Flow Cytometry - Recent Perspectives. , (2012).</li><li>Cheewatrakoolpong, B., Gilchrest, H., Anthes, J. C., Greenfeder, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+splice+variants+of+the+human+P2X7+ATP+channel.">Identification and characterization of splice variants of the human P2X7 ATP channel.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 332 (1), 17-27 (2005).</li><li>Gu, B. J., Saunders, B. M., Jursik, C., Wiley, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+P2X7-nonmuscle+myosin+membrane+complex+regulates+phagocytosis+of+nonopsonized+particles+and+bacteria+by+a+pathway+attenuated+by+extracellular+ATP.">The P2X7-nonmuscle myosin membrane complex regulates phagocytosis of nonopsonized particles and bacteria by a pathway attenuated by extracellular ATP.</a> Blood. 115 (8), 1621-1631 (2010).</li><li>Gu, B. J., Rathsam, C., Stokes, L., McGeachie, A. B., Wiley, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+ATP+dissociates+nonmuscle+myosin+from+P2X(7)+complex:+this+dissociation+regulates+P2X(7)+pore+formation.">Extracellular ATP dissociates nonmuscle myosin from P2X(7) complex: this dissociation regulates P2X(7) pore formation.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 297 (2), C430-C439 (2009).</li><li>Gu, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P2X7+receptor-mediated+scavenger+activity+of+mononuclear+phagocytes+toward+non-opsonized+particles+and+apoptotic+cells+is+inhibited+by+serum+glycoproteins+but+remains+active+in+cerebrospinal+fluid.">P2X7 receptor-mediated scavenger activity of mononuclear phagocytes toward non-opsonized particles and apoptotic cells is inhibited by serum glycoproteins but remains active in cerebrospinal fluid.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (21), 17318-17330 (2012).</li><li>Bhattacharya, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+Advances+in+CNS+P2X7+Physiology+and+Pharmacology:+Focus+on+Neuropsychiatric+Disorders.">Recent Advances in CNS P2X7 Physiology and Pharmacology: Focus on Neuropsychiatric Disorders.</a> Frontiers in Pharmacology. 9 (30), (2018).</li><li>Burnstock, G., Knight, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+potential+of+P2X7+receptors+as+a+therapeutic+target,+including+inflammation+and+tumour+progression.">The potential of P2X7 receptors as a therapeutic target, including inflammation and tumour progression.</a> Purinergic Signalling. 14 (1), 1-18 (2018).</li><li>Alves, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pore+forming+channels+as+a+drug+delivery+system+for+photodynamic+therapy+in+cancer+associated+with+nanoscintillators.">Pore forming channels as a drug delivery system for photodynamic therapy in cancer associated with nanoscintillators.</a> Oncotarget. 9 (38), 25342-25354 (2018).</li><li>Pacheco, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P2X7+receptor+as+a+novel+drug+delivery+system+to+increase+the+entrance+of+hydrophilic+drugs+into+cells+during+photodynamic+therapy.">P2X7 receptor as a novel drug delivery system to increase the entrance of hydrophilic drugs into cells during photodynamic therapy.</a> Journal of Bioenergetics and Biomembranes. 48 (4), 397-411 (2016).</li></ol>

저자는 공개 없다.

이 종이 성인 neurogenic 틈새에서 파생 된 신경 조상 세포 배양에 P2X7 수용 체 기능 분석에 대 한 상세한 프로토콜을 제공 합니다. 성인 신경 조상에 대 한 잠재적인 응용 프로그램 세포 치료 목적, 연구에서 범위와 그래서 문화 방법 강력 하 고 재현 되어야 합니다. 이 프로토콜 끝점 문화의 품질에 영향을 줄 수 있는 주요 측면의 여러 가지가 있습니다. 두개골에서 제거 되 면 뇌 수 없다는 건조 하 고 해 부를 최대한 빨리 수행 해야 합니다. 해 마와 특히 더 신경 혈관 또는 막 조직을 제거 하 게 뛰어난 조상 세포 수익률 발생 합니다. 분리 및 분쇄 과정 수 무 겁 게 문화;에 분야의 수에 영향을 조직을 트립 신-EDTA와 인큐베이션 기간 동안 교 반 하는 것은 더 균질 해결책 귀 착될 것 이다. 화재 광택 유리를 사용 하 여 플라스틱 피 펫 팁이 세포 죽음을 절감 하 고 결과 문화 향상 좋습니다 P1000 이상 피 펫 목장. Overtriturating 하지 마십시오. 이러한 조치에도 불구 하 고 절차 P0 문화에 파편을 많이 만들 수 있습니다 그리고 조상 세포를 잃고, 세척 또는 문화 먹이 피하기 위해 피해 야 한다 구체 형성 때까지.
다양 한 차이 hippocampal SVZ 문화 P0에 명백한 될 것입니다. Hippocampal 문화가 수익률 적은 분야, 그리고 이러한 일반적으로 준수. 피 펫 팁을 사용 하 여 초기 통행을 위한 분야 떨어져 부드럽게 리프트. 부착 분야 하지 다음 구절에서 관찰 되었다. 조직 배양 플라스 크의 다른 브랜드는 분야를 일으킬 수 있습니다 준수 하는 접시의 하단에 식민지로 성장 특히 hippocampal 분야. 이 변경 하는이 프로토콜에 대 한 모든 다운스트림 결과를 찾을 수 없습니다 하지만, 모니터링 해야 하 고 가능한 일관성을 유지 해야 합니다.
P2X7 수용 체 기능, 칼슘 유입을 기록 클램핑 패치 등을 측정 하는 데 사용 하는 이전 방법 어렵고 힘 드는 되며 단일 셀에 정보를 제공할 수도 있습니다. 이 프로토콜 분석 한 컴퓨터를 사용 하 여 P2X7 수용 체의 모든 세 가지 주요 기능을 신속 하 고 재현할 수 메서드를 제공 합니다. 시간 해결 라이브 셀 cytometry 전체 인구 분석에 대 한 허용 하 고 연구원의 칼슘 유입, 기 공 형성, phagocytic 기능 활동에 관한 정보를 제공 한다. 이것 이외에, cytometry 마커 식 패턴 및 셀 크기 또는 단백질 표정 수준에 따라 인구 분석을 평가 하기 위한 방법으로 쉽게 사용할 수 있습니다.
이러한 실험을 실시 때 최대한 칼슘 유입, 브로민 통풍 관, 또는 먹어서 속도 차이 반복 사이 관찰 될 수 있습니다. 이 영역 크기를 최소화 하기 위해 문화 조건과 정권 먹이 일관적 이어야 셀의 건강 결과에 상당한 영향을 미칠 것으로 한다. 얼음에 시간 또한 영향을 미칠 수 데이터, 그래서 얼음에 시간 최소화 되도록 모든 것은 미리 준비 보장. 로딩 시간 칼슘 표시기 염료 일관성이 있는지 확인 합니다. 최대한 칼슘 녹음에 큰 불일치가 발생할 수 있습니다 또 다른 요인은 ATP 배치 사이 변화 이다. ATP 주식의 준비는 중요 한, 그리고 같은 실험에 대 한 다른 일괄 처리의 사용을 피해 야 한다. ATP는 일관성을 보장 하기 위해 오래 되 고 새로운 일괄 처리를 비교 하는 것이 좋습니다 또한. P2X7 길 항 근의 효과 세포 선 및 일괄 종속, 있을 수 있습니다 부 화 시간과 농도의 최적화가 필요할 수 있습니다.
그 칼슘 유입/경과 가장 근본적이 고 복잡 한 세포 기능 중 하나 이며 많은 수용 체에 의해 중재 될 수 있습니다 지적 가치가 있다. ATP 유도 칼슘 유입, P2X7 채널/기 공 함수에 대 한 고전적인 측정 P2X7 수용 체의 진정한 기능을 정확 하 게 반영 하지 않을 수 있습니다 ATP로 또한 활성화 있습니다 P2Y 수용 체 세포내 칼슘을 출시. 이 경우에, 바 륨의 유입은 단방향16칼슘 대신 사용 하 여 더 나은 양이온을 있을 수 있습니다. 칼슘 유입에 P2Y 수용 체에서 기여를 차별화 하는 조건 1 mM EDTA 또는 에틸렌 글리콜-bis(β-aminoethyl ether)-N, N, n, n ′-tetraacetic 산 (EGTA) ′ CaCl2 대신 K+ 매체에 추가 됩니다이 사용 될 수 있습니다. 분석 결과입니다.
이 프로토콜도 쉽게 다른 셀 형식에 맞게 적응 수 있습니다 고 대체 이온 채널 수용 체 식 균 작용에 참여 하는 수용 체의 기능을 조사 하는 데 유용할 수 있습니다. 이 방법은 또한 시간 모듈 없이 흐름 cytometry 기계에 적응 수 있습니다. 예를 들어, 식 균 작용 분석 어디 YG 구슬 분석 전에 7-8 분에 추가 기존의 cytometry 수행 수 있습니다. 37 ° C에서 세포를 유지 하 고 지속적으로 그들을 소용돌이. 이 실시간 정보를 제공 하지 않습니다 하지만 평균 최종 형광에 차이가 여전히 P2X7 수용 체의 기능에 관한 연구를 알릴 것 이다.
P2X7 수용 체에 대 한 관심 약 대상21,22 또는24 , 급속 하 게 성장 하 고 마약 배달 경로23,로 그래서이 수수께끼의 수용 체를 공부 하는 방법을 지속적으로 해야 적응 및 향상 된 시를 이러한 연구를 촉진 한다. 이 프로토콜 성숙한 신경 조상 세포에서 P2X7 함수를 탐구 하는 데 사용할 수 있습니다 방법론을 설명 하 고 그것은 기대는 뇌졸중의 치료에 있는 전진으로 이어질 수 있습니다 neurogenic 틈새에 P2X7 수용 체의 큰 이해를 달성 하 고 기타 허 혈 성 부상입니다.

Purinergic 신호의 연구는 광범위 하 고 다각적인, 세포 생리학, 생화학, 약리학 관련. Purinergic 신호는 암 세포 세포 커뮤니케이션을 줄기 세포 생물학; 세포 주기 규칙에서 세포질과 분자 과정의 무한 한 수에 관여 따라서, 거기 자주 purinergic 치료 혜택에 대 한 신호를 변조 가능성이 존재 합니다. Purinergic 수용 체의 P2X7 수용 체는 수많은 염증 성 조건1에 대 한 치료 대상으로 최근 몇 년 동안 그것의 잠재력 때문에 상당한 주목을 받았다 있다. 수용 체를 공부 하는 방법 진화 하 고이 연구2,3,,45를 촉진 하기 위하여 수 년에 걸쳐 적응 되었습니다. 여기, hippocampal가 이랑 帯 (SVZ)에서 파생 된 성숙한 신경 조상 세포 수용 체 P2X7의 여러 기능을 조사 하는 라이브 셀 흐름 cytometry 방법을 설명 합니다.
P2X7 수용 체 처음 P2Z 수용 체, 또는 큰 막 횡단 공 침투성 900 다6까지 분자의 형성에 아데노신 3 인산 염 (ATP) 결과의 높은 농도 가진 그것의 활성화로 '세포 죽음' 수용 체로 설명 했다. 이것은 cytoskeletal 재배치, 막 횡단 기 공 형성 하 고, 잠재적으로, apoptosis 또는 괴 사7. 전통적으로, P2X7의이 기능 형광 DNA3,8삽입 된 때 요-프로-1 또는 ethidium 평범한 사람, 같은 큰 분자량 염료의 통풍 관에 의해 정량 이다. 플레이트 리더 방법을 빠른 고 upscaling 허용, 일반적으로 활동의 관찰에 대 한 허용 하지 않습니다. 여기 설명 하는 방법을 브로민 이해에 기반 하의 기 공 형성의 속도 관하여 정보를 더 깊이 제공 시간이 지남에 관찰 형광 증가 하며 P2X7 수용 체 이후 여러 노출 시간 및 주 작동 근 농도9,10에 따라 뚜렷한 응답으로 nonimmune 기능을 촉진 하기 위해 표시 되었습니다. ATP의 낮은 농도 의해 간단한 활성화 양이온 유입에 신경 전달 물질 및 신호 변환11의 목적에 대 한 결과. Cytometry 칼슘 유입 측정을 사용 하 여 복잡 하 고 기술적으로 도전적인 방법과 관련 된 문제를 극복-특히, 걸쳐 잠재력에 있는 변화에 관해서는 귀중 한 정보를 제공 하는 내부 전류를 측정 하기 위해 클램핑 패치 세포 막 하지만 인구 분석2에 대 한 허용 하지 않습니다. P2X7 수용 체의 3 기능 ATP, 면역계와 신 경계9,,1213식 균 작용을 촉진 하기 위하여 P2X7 수용 체를 설명 했다 되었습니다의 부재에서 발생 합니다. 정량화 및 인구 분석 아직도 도전을 제시할 수 있습니다 비록 현미경 검사 법 기술에 있는 전진 이해 하는 동안 cytoskeletal 재배열의 시각화를 허용 했습니다.
여기 상세한 라이브 셀 흐름 cytometry 방법을 실시간으로 P2X7 수용 체의 모든 세 가지 주요 기능 조사 수 있습니다. 에 교류 cytometer 시간 모듈 장치 포함 온도 제어 및 현 탁 액 셀의 지속적인 감동 수 있습니다. 두 번째, 세포질 응답의 근처 중단된 측정을 수 있도록 내 주 작동 근 그리고 길 항 근 자극을 전달할 수 있습니다. 이 reproducibly 여러 분석 결과 시스템의 사용을 피하고 있는 동안 함수를 계량 하는 신속 하 고 간단한 방법을 제공 합니다. 그것은 중요 한 것이 프로토콜 모든 셀 형식에 맞게 쉽게 적용할 수 있습니다 특정 촉진제 또는 억제제, 그들의 속성에 따라 포함 주어진 다른 수용 체 하위 검사 하는 데 사용할 수 있습니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:596px;" width="597">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">A438079</td>
			<td style="width:95px;">Tocris</td>
			<td style="width:119px;">2972/10</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">ATP</td>
			<td style="width:95px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2383</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">AZ10606120</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>3323/10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">bzATP</td>
			<td style="width:95px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>B6396</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">cytochalasin D</td>
			<td style="width:95px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>C8273</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">FACSCalibur</td>
			<td style="width:95px;">Becton Dickinson&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Fluo-8AM</td>
			<td style="width:95px;">AAT-Bioquest</td>
			<td>21080</td>
			<td style="width:167px;">Fluo-4AM and Fura-Red AM have also been used successfully&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Fluoresbrite YG Microspheres&#160;</td>
			<td style="width:95px;">Polysciences Inc</td>
			<td>17154-10</td>
			<td>1.00 &#181;m, yellow-green</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Glutamine</td>
			<td style="width:95px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">25030081</td>
			<td>200 mM</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">HBSS</td>
			<td style="width:95px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td>14170112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">heparin</td>
			<td style="width:95px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">NeuroCult Basal Medium</td>
			<td style="width:95px;">Stemcell Technologies</td>
			<td>5700</td>
			<td>Mouse and rat</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">NeuroCult Proliferation Supplement</td>
			<td style="width:95px;">Stemcell Technologies</td>
			<td>5701</td>
			<td>Mouse and rat</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">oxidized ATP</td>
			<td style="width:95px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6779</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Pluronic&#160;F-127</td>
			<td style="width:95px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>P2443</td>
			<td>pluronic acid</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Recombinant Murine EGF</td>
			<td style="width:95px;">Peprotech</td>
			<td>315-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Recombinant Murine FGF-basic</td>
			<td style="width:95px;">Peprotech</td>
			<td>450-33</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">tetramethylammonium hydroxide</td>
			<td style="width:95px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>T7505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Time Zero Module</td>
			<td style="width:95px;">Cytek Biosciences</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Tissue culture flasks</td>
			<td style="width:95px;">BD Falcon (Corning)</td>
			<td style="width:119px;">353108 (T25), 353136 (T75)</td>
			<td>Blue vented screw cap</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">TrypLE Express</td>
			<td style="width:95px;">Gibco</td>
			<td>12604013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Trypsin-EDTA (0.25%)</td>
			<td style="width:95px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">25200056</td>
			<td>with phenol red</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">UltraPure Ethidium Bromide</td>
			<td style="width:95px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">15585011</td>
			<td style="width:167px;">10 mg/mL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

real-time live-cell flow cytometry to investigate calcium influx, pore formation, and phagocytosis by p2x7 receptors in adult neural progenitor cells

라이브 셀 cytometry 점점는 세포 생물학 중 생활에서 생물 학적 과정을 계량 세포 배양. 이 프로토콜에 의하여 라이브 셀 cytometry 확장 시 실시간으로 P2X7 수용 체 활성화의 여러 기능을 분석 하는 방법을 설명 합니다. 교류 cytometer에 설치 시간 모듈을 사용 하 여, 라이브 셀 기능 평가 고 칼슘 유입, 막 횡단 기 공 형성 및 식 균 작용의 활동을 탐구 하는 주어진된 시간 동안 꾸몄다. 이 간단한 방법은 유리 P2X7 수용 체의 모든 3 개의 정식 기능 한 기계를 사용 하 여 평가 될 수 있다 하 고 시간이 지남에 플롯 수집된 데이터 정보를 제공 합니다 단일 셀 녹음 보다는 전체 라이브 세포 인구에 자주 기술적으로 도전적인 패치 클램프 방법을 사용 하 여 얻을. 칼슘 유입 실험 칼슘 지시자 염료를 사용 하 여, P2X7 기 공 형성 분석 ethidium 평범한 사람은 막 횡단 통과를 허용에 의존 높은 주 작동 근 농도 따라 형성 된 기 공. 노란색-녹색 (YG) 라텍스 구슬 먹어서 측정에 활용 됩니다. 특정 주 작동 근 그리고 길 항 근은 P2X7 수용 체 활동의 효과 조사 하기 위해 적용 됩니다. 개별적으로 이러한 방법은 칼슘 채널 및 purinergic 및 폐품 수용 체의 수에 정량적 데이터를 제공 하도록 수정할 수 있습니다. 함께 찍은, 그들은 어떻게 실시간 라이브 셀 cytometry 사용은 P2X7 수용 체 기능을 조사 하는 빠른, 비용, 재현성, 고 정량 방법을 강조 표시 합니다.

신경 조상 세포 배양
이 메서드를 사용 하 여 파생 된 신경 조상 구 문화 단계 밝은 부드러운 둥근 가장자리 (그림 1AB)을가지고 있어야 합니다. 건강 한 문화에서 작은 microspikes (그림 1C) 가장자리에 관찰할 수 있습니다. 늦은 통행, 또는 부적당 하 게 먹이 면 분야 빈 컵 모양 (그림 1D) 또는 큰 직사각형 모양 (그림 1E, 화살표로 표시)를 형성할 수 있다. 이러한 문화는 사용할 수 없습니다 cytometry 또는 다른 다운스트림 응용 프로그램, 이러한 기능으로는 것이 차별화의 지표. 신경 뿌리 상태를 확인 하려면 셀 폴 리-L-ornithine와 immunocytochemistry에 대 한 laminin 코팅 유리 coverslips에 도금 했다 (그림 1 층 고, 더 높은 confluency, 그림 1G에서). 세포는 GFAP nestin, Sox2, vimentin, ASCL1, BLBP, Prox1, 및 DCX 타입 2 조상 세포 (해 마) 또는 C 조상 세포 (SVZ)9셀을 식별 하기 위해 얼룩 했다. 셀은 확장된 프로세스는 잘 정의 된 핵 있어야 합니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59313/59313fig1.jpg"> 그림 1: 대표적인 hippocampal 신경 조상 세포 배양. (A) Hippocampal 신경 조상 세포 성인 쥐에서 격리 되며 약 100 ~ 150 µ m 직경에서까지 neurospheres로 교양. (B) Neurospheres 부드러운 주변, (C) 고 작은 microspikes 수 있습니다 그들의 표면에 관찰. 분야는 문화에 너무 오래, 그들은 (D) 컵 또는 (E) 직사각형 모양을 형성할 수 있다. 이러한 문화는 실험을 위해 사용할 수 없습니다. 세포의 신경 뿌리 상태를 확인 하려면 폴 리-L-ornithine (PLO)와 immunochemistry에 대 한 laminin 코팅 유리 coverslips에 단일 세포 현 탁 액으로 종자. 세포는 낮은 confluency 및 immunochemistry에 대 한 준비 (G)에서 작은 소마 및 분기 프로세스, (F) 있어야 한다. 바 규모 = 100 µ m. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59313/59313fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
라이브 셀 cytometry에 의해 칼슘 유입
이 프로토콜은 실시간으로 칼슘 채널 P2X7 수용 체 기능 분석에 대 한 수 있습니다. 수용 체 기능의 활동 뿐만 아니라 다른 주 작동 근 그리고 길 항 근의 효과 평가 수 있습니다. 이상의 플롯 될 때에 있는 hippocampal 칼슘 유입 시간과 SVZ 신경 조상 세포 일반적으로 유사 했다 (그림 2A 및 그림 2B, 각각). 촉진제 (ATP 또는 BzATP)는 빨간색 화살표로 표시 된 대로 40 s 마크에 추가 되었습니다. 짧은 순간에 대 한 튜브는 주 작동 근, 결과 0의 데이터 요소에 추가 하려면 기록 지점에서 제거 됩니다. 이 주 작동 근 추가할 때 시간의 식별에 허용할 것 이다. BzATP 이온 채널을 열고 있는 Fluo-8에 바인딩하고 fluoresces 칼슘 유입 수 있도록 빠르게 P2X7 수용 체를 활성화 합니다. ATP 응용 프로그램은 일반적으로 더 점진적 칼슘 유입에서 발생합니다. 그것은 P2X7 BzATP에 비해 선호도 낮은 있으며 또한 G 단백질 결합 된 수용 체 활성화, 느린 신호 통로 바인딩과 그물에서 칼슘을 해제 귀 착될 것 이다. P2X7 길 항 근 A438079와 AZ10606120의 포함 (데이터 표시 되지 않음) 주 작동 근 응용 프로그램에 대 한 응답에서 칼슘 유입 감소.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59313/59313fig2.jpg"> 그림 2: 해 마 및 SVZ에서 신경 조상 세포에서 라이브 셀 칼슘 유입. P2X7 수용 체 칼슘 채널 기능 (A)에서 설명 되었다 hippocampal 변화 Fluo-8 형광에 의해 (B) SVZ에서 파생 된 조상 세포. 일반 P2X 주 작동 근 ATP와 P2X7 이온 채널 개방, 허용 칼슘 유입의 P2X7 주 작동 근 BzATP 결과의 응용 프로그램. A438079 또는 AZ10606120 P2X7 전용 억제제와 유입 차단 (데이터 표시 되지 않음). F = 형광; F0 = 0 시간 시점 형광. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59313/59313fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
라이브 셀 cytometry에 의해 기 공 형성
막 횡단 기 공 형성은 P2X7 수용 체, 고분자 교환, 결과의 정식 기능 및 세포 죽음으로 이어질 수 있습니다. 브로민+ 은 건강 한 세포;에서 제외는 큰 분자 (314 다) 그것의 이해 및 DNA와 후속 윤 형광 방출 귀착되 고 막 횡단 숨 구멍을 형성 하는 P2X7 수용 체의 기능을 평가 하기 위해 사용할 수 있습니다. 촉진제 ATP (1mm ATP) 및 BzATP의 응용 프로그램에 따라 (100 μ M) 40에 s (화살표로 표시), 시간 해결 cytometry 실시간 (그림 3A)에 셀 입력 ethidium 평범한 사람을 캡처합니다. 이 효과 P2X7 전용 억제제 AZ10606120에 의해 감쇠 했다. Ethidium 평범한 사람 이해 분석 결과 기능 P2X7 수용 체 C-말단17 보여줍니다 이며 전체 길이 P2X7 수용 체 식에 대 한 좋은 증거. ATP 농도 응답 분석 (그림 3B) 시간별 ethidium 평범한 사람 형광의 변화를 사용 하 여 P2X7 기 공 형성에 주 작동 근 농도의 효과를 보여 줍니다. 특정 수용 체 억제제와 함께 주 작동 근 복용량 농도 곡선 수용 체 활성화에 대 한 강력한 증거를 제공합니다.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59313/59313fig3.jpg"> 그림 3: 브로민 통풍 관에 의해 P2X7 막 횡단 기 공 형성 측정. 수집의 시작 전에 ethidium 평범한 사람 순간의 추가 P2X7 막 횡단 숨 구멍의 대형을 측정 하는 데 사용 됩니다. (A) P2X7 수용 체에 ATP와 BzATP 결과의 높은 농도 형성, ethidium 평범한 사람 셀을 입력 하려면 수 기 공. P2X7 억제 물 AZ10606120이이 현상 약화 하 고 기능 P2X7 수용 체에 대 한 증거를 제공 한다. (B) ATP 농도 응답 분석 500 μ M와 1mm만 더 낮은 농도에 중요 한 기 공 형성을 설명 했다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59313/59313fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
라이브 셀 cytometry에 의해 식 균 작용
우리의 그룹 이전 extracellular ATP P2X7 C-말단에는 골격에서 해리 하 여 P2X7 중재 먹어서 억제 보여주었다 특히 nonmuscle myosin IIA18,19. 이 방법은 hippocampal 의해 식 균 작용의 P2X7 수용 체 참여를 설명 하기 위해 이러한 결과에 확장 하 고 SVZ 신경 조상 세포 실시간 (그림 4, hippocampal 먹어서의 예). 1 µ m YG 라텍스 구슬의 노골적인된 먹어서 (제어) 수준 긍정적인 통제로 설립 되었다. ATP 5% 혈 청 폐지 모두 타고 난 먹어서20동안 일반적인 억제제, 즉 PFA 고정과 말라 중 합 억제제 cytochalasin D로 동일한 정도로 YG 구슬의 식 균 작용을 저해.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59313/59313fig4.jpg"> 그림 4: P2X7 수용 체를 통해 신경 창시자의 phagocytic 용량을 보여주는 YG 구슬 통풍 관. 신경 조상 세포로 YG 구슬 통풍 관은 관찰 라이브 셀을 사용 하 여 실시간으로 cytometry 흐름. 식 균 작용의 제어 수준은 처음 설립 되며 셀 수 허용 하는 경우 실행의 끝에 재확인. P2X7 수용 체의 참여로이 해리는 C-말단 막 골격에서 P2X7이 중재 cytoskeletal 재배열을 방지 한다 ATP의 식 균 작용의 억제에 의해 표시 됩니다. ATP의 응용 프로그램 차단 먹어서, paraformaldehyde (PFA), cytochalasin D (CytD) 등의 일반적인 억제제의 사용으로 동일한 정도로 먹어서. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59313/59313fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

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Real-time Live-cell Flow Cytometry to Investigate Calcium Influx, Pore Formation, and Phagocytosis by P2X7 Receptors in Adult Neural Progenitor Cells

단일 셀 감도 제공, 실시간 cytometry은 유일 하 게 라이브 문화의 복합 수용 체 기능을 계량 적합 합니다. 성숙한 신경 조상 세포를 사용 하 여, P2X7 수용 체 기능 칼슘 유입 칼슘 표시기 염료, ethidium 평범한 사람 통풍 관, 그리고 형광 라텍스 비즈를 사용 하 여 식 균 작용에 의해 막 횡단 기 공 형성에 의해 감지를 통해 평가 했다.

칼슘 유입, 기 공 형성 및 성숙한 신경 조상 세포 수용 체 P2X7에 의해 식 균 작용을 조사 하기 위해 실시간 라이브 셀 Cytometry

Live-cell flow cytometry is increasingly used among cell biologists to quantify biological processes in a living cell culture. This protocol describes a ...

P2X7 수용체는 매우 다재다능하며 현재의 작용제의 양에 따라 다르게 기능합니다. 이러한 방식으로, P2X7은 다른 기능을 가지고 있으며 많은 다른 시스템의 생리학을 조절 할 수 있습니다. 이 프로토콜은 P2X7 수용체의 세 가지 주요 기능에 대한 조사를 허용합니다.그것은 그것의 기능을 이해 하기 위한 신속 하 고 재현 가능한 정량화 하는 방법. P2X7 수용체가 신경 전구 세포에서 조절할 수 있는 방법에 대한 우리의 초점. 그러나 이 방법은 모든 세포 유형에 맞게 쉽게 적응할 수 있다.이 절차를 시도하기 전에 충분한 문학을 읽은 학생들은 하루에 이 모든 것을 배우고 두 세 번 의 시도 후에 혼자서 실행할 수 있습니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 바와 같이 성인 마우스의 심실 영역 및 해마에서 신경 전구 세포를 획득하여 이 절차를 시작합니다. 이산화탄소 5%로 섭씨 37도에서 문화를 유지합니다.신경구는 7~10일 후에 형성되어야 하며, 항로는 영하구역 배양과 15~20일 후에 해마 배양에서 형성되어야 한다. 초기 통과 제로 배양 단계에 따라 생물학적 안전 캐비닛 및 표준 조직 배양 관행을 사용하여 필요에 따라 7~10일마다 통과합니다. 직경이 150~200미크론에 도달하면 구체를 통과합니다.15 밀리리터 튜브에서 구체와 배지를 수집하고 2 분 동안 저속으로 회전하십시오. 배지를 제거하고 구체의 크기에 따라 섭씨 37도에서 7~10분 동안 해리 시약으로 세포를 배양한다. 마지막으로, 혈전계 또는 자동 세포 카운터를 사용하여 세포를 계산합니다.칼슘이 없는 나트륨 배지의 1밀리리터로 단일 세포를 일시 중단합니다. 그런 다음 칼슘 표시기 염료의 밀리리터 당 2 개의 니니그램과 5 %의 플루론산 10 마이크로 리터로 세포를로드합니다. 섭씨 37도에서 30분 동안 세포를 배양합니다.칼슘이 없는 나트륨 배지의 3~5밀리리터를 추가하고 부드럽게 원심분리를 하여 세포를 씻어내십시오. 상체를 제거하고 칼슘이없는 나트륨 배지에서 세포를 다시 일시 중단하여 두 번째로 세척하십시오. 칼슘이 없는 나트륨 배지의 1밀리리터에서 세포를 다시 중단합니다.그런 다음 세포를 얼음위에 놓고 30분 동안 세포를 제거하도록 허용합니다. 칼륨 배지와 원심분리기의 3~5밀리리터를 이전과 같이 첨가하여 세포를 한 번 더 씻으시다. 칼륨 배지에서 세포를 다시 중단한 후, FACS 튜브당 500 마이크로리터당 100만 개의 세포 농도로 형광 활성화 세포 선별 또는 FACS 튜브로 이리액을 넣습니다.세포를 분석할 준비가 될 때까지 FACS 튜브를 얼음 위에 놓습니다. 장기간 얼음에 세포를 두지 말고 가능한 한 빨리 분석작업을 시작합니다. 일부 샘플의 경우 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 P2X7 수용체 특이억제제로 세포를 사전 배양한다.첫 번째 샘플을 실행하기 몇 분 전에, 1 밀리머의 최종 농도에 염화 칼슘을 추가하고 복구할 수있는 섭씨 37도 수조에 튜브를 배치합니다. 깨끗한 작은 자기 교반기를 FACS 튜브에 떨어뜨리고 시료 온도를 제어하기 위해 순환되는 섭씨 37도 수조에 연결된 시간 모듈에 튜브를 배치합니다. 소용돌이 효과를 도입하지 않고 시료의 움직임을 보장하기 위해 낮은 교반 속도를 선택합니다.물 주전자와 튜브 어댑터를 샘플 플랫폼에 놓고 FACS 기계의 레버 암을 닫습니다. 샘플 수집을 시작하고 초당 약 1, 000 이벤트에서 3분 동안 샘플을 실행합니다. 40초 마크에서 튜브를 빠르게 제거하고 P2X7 작용제에 추가합니다.1 밀리머 ATP 또는 300 마이크로 몰라 BzATP. 그런 다음 튜브를 교체하여 인수를 계속합니다. 첫 번째 샘플이 기록하는 동안 염화 칼슘으로 두 번째 샘플을 준비합니다.분석 전에 세포가 예열될 수 있도록 섭씨 37도에 놓습니다. 첫 번째 샘플이 완료되면 물 샘플을 실행하여 섭취를 청소하십시오. 그런 다음 두 번째 샘플의 획득은 이전과 같이 시작될 수 있습니다.항상 샘플 사이의 섭취량을 청소하십시오. 이전과 같이 단일 셀 서스펜션을 만들고 조건부 배지의 몇 밀리리터를 저장합니다. 이 매체를 사용하여 FACS 튜브당 100마이크로리터당 100개의 세포 농도로 세포를 다시 중단하고 세포가 준비될 때까지 얼음 위에 놓습니다.분석서를 실행하기 전에 900 마이크로리터의 칼륨 배지를 추가하여 1 밀리리터의 최종 부피에 추가합니다. 튜브를 섭씨 37도의 수조에 10분간 놓아 복구합니다. 해당되는 경우 P2X7 특이 억제제를 포함한 치료로 세포를 사전 배양합니다.분석 을 실행하기 직전에 FACS 튜브에 25 마이크로 몰러 에디튬 브로마이드를 추가하십시오. 그런 다음 자기 교반기를 추가하고 FACS 기계에 튜브를 배치하고 이전과 같이 인수를 시작합니다. 세포막에서 모공의 형성을 유도하기 위해, 1 밀리머 ATP 또는 100 마이크로몰러 BzATP를 추가 40 취득의 시작 후 초.샘플을 초당 약 1, 000 이벤트에서 6분간 실행합니다. 첫 번째 샘플이 실행되는 동안, 얼음에서 두 번째 샘플을 가져 와서 분석 전에 세포가 회복 할 수있는 충분한 시간을 허용하기 위해 37섭씨 수조에 배치하십시오. 첫 번째 샘플 수집이 완료되고 섭취량이 정리되면 두 번째 샘플을 컴퓨터에 배치하여 레코딩을 시작할 수 있습니다.우리는 조건부 배지에서 단일 세포를 중단하고 FACS 튜브 당 100 마이크로 리터 당 적어도 백만 세포의 농도에서 FACS 튜브로 그들을 이액. 나트륨 매체로 밀리리터 당 백만 세포의 최종 농도로 세포를 희석하고 분석이 수행 될 때까지 얼음에 세포를 배치합니다. 실시간 phagocytosis 분석약에 대 한 phagocytic 대상으로 하나의 미크로네 넓은 G 구슬을 사용.첫 번째 샘플을 실행하기 전에 세포를 섭씨 37도로 옮기고 약 7~10분 동안 배양하여 세포가 회복되도록 합니다. ATP, 산화 ATP, 사이토켈리신 D 및 4% 파라포름알데히드를 포함한 각 튜브에 사전 인큐베이션을 요구하는 모든 트리트먼트를 추가합니다. 5%의 인간 혈청에는 사전 잠복이 필요하지 않습니다.치료가 거의 동시에 추가되면, 샘플은 연속적으로 실행될 수 있으며 다른 샘플은 인큐베이션 시간이 다양하기 때문에 계속 배양을 계속할 수 있습니다. 마그네틱 교반기로 사이토미터에 샘플을 놓고 이전과 같이 시료 수집을 시작합니다. 수집 시작 후 15~20초 후에 기계에서 샘플 튜브를 제거하고 희석되지 않은 YG 구슬 5마이크로리터를 추가합니다.샘플 FACS 튜브를 계측기로 반환하고 인수를 계속합니다. 초당 약 1, 000 이벤트에서 7~8분 동안 샘플을 실행합니다. 첫 번째 샘플이 실행되는 동안, 얼음에서 두 번째 샘플을 가져 와서 분석 하기 전에 세포가 복구 할 수있는 충분한 시간을 허용하기 위해 섭씨 37도 수조에 배치합니다.첫 번째 샘플이 완료되고 섭취량이 정리되면 두 번째 샘플에서 수집을 시작합니다. 시간이 지남에 따라 플롯 될 때, 칼슘 유입은 일반적으로 해마 와 지하 영역 신경 전구 세포에서 유사했다. 42번째 마크에 고뇌주의자가 추가되었습니다.BzATP는 P2X7 수용체를 빠르게 활성화하여 이온 채널을 열고 플루오-8 및 형광에 결합하는 칼슘 유입을 허용합니다. ATP 응용 프로그램은 일반적으로 더 점진적인 칼슘 유입을 초래합니다. BzATP에 비해 P2X7에 대한 선호도가 낮으며 G 단백질 결합 수용체 활성화도 초래할 것이다.아고니스트의 ATP와 BzATP의 적용에 따라, 시간 해결 혈중 세포측정은 실시간으로 막 기공을 통해 세포로 유입되는 에티듐 브로마이드를 포착한다. 이 효과는 P2X7 특이적 억제제에 의해 감쇠되었다. ATP 농도 반응 작용제는 시간이 지남에 따라 에티듐 브로마이드 형광의 변화를 사용하여 P2X7 모공 형성에 대한 고뇌농도의 효과를 보여준다.여기서 P2X7 수용체-관련 식세포는 해마 및 지하존 신경 전구 세포에 의한 교후세포가 실시간으로 나타나고 있다. YG 라텍스 구슬의 억제되지 않은 식세포증 수준이 긍정적 인 제어로 확립되었습니다. ATP는 비특이적 억제제, 즉 파라포름알데히드 고정및 액틴 중합 억제제 시토켈리신 D.5%의 혈청이 모든 선천적 식세포증을 폐지하는 비특이적 억제제와 같은 정도로 YG 구슬의 식증을 억제하였다.건강한 세포 인구를 유지하고 얼음에 시간을 줄이는 것은 재현 가능한 결과를 얻기 위해 매우 중요합니다. 전체 셀 분석에 대해 동일한 ATP 배치를 사용하여 가변성을 최소화할 수 있습니다. 여기에서 입증된 흐름 세포측정의 시간 지정 결과는 대상 하위 인구의 흐름 및 변화에 대한 수량을 계속 선택할 수 있는 유일한 메시지입니다.대체 방법은 형광 현미경 및 형광 플래터 판독기입니다. 그러나, 이 방법은 형광 친화성 프로그램 때문에 형광 변화를 지속적으로 측정할 수 없다. P2X7은 고유 멀티 모달입니다.관심 있는 셀에서 그 표현을 발견하는 것은 수사관이 탐구할 수 있는 일련의 독특한 질문을 열어주어집니다.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Direct Induction of Human Neural Stem Cells from Peripheral Blood Hematopoietic Progenitor Cells

말초 혈액 조혈 전구 세포에서 인간 신경 줄기 세포의 직접 유도

Human disease specific neuronal cultures are essential for generating in vitro models for human neurological diseases. However, the lack of access to ...

연구

발생학

Isolation of Neural Stem/Progenitor Cells from the Periventricular Region of the Adult Rat and Human Spinal Cord

뇌실 주위 백질 성인 쥐의 지역 및 인간의 척수에서 신경 줄기 / 전구 세포의 분리

Adult rat and human spinal cord neural stem/progenitor cells (NSPCs) cultured in growth factor-enriched medium allows for the proliferation of ...

Step-specific Sorting of Mouse Spermatids by Flow Cytometry

단계 별 마우스 정자의 정렬을 유동 세포 계측법에 의해

The differentiation of mouse spermatids is one critical process for the production of a functional male gamete with an intact genome to be transmitted to ...

Identification Of Erythromyeloid Progenitors And Their Progeny In The Mouse Embryo By Flow Cytometry

Flow Cytometry에 의한 마우스 태아의 적혈구 전구 세포 (Erythromyeloid Progenitors)와 그 자손의 동정

Macrophages are professional phagocytes from the innate arm of the immune system. In steady-state, sessile macrophages are found in adult tissues where ...

Isolating and Analyzing Cells of the Pancreas Mesenchyme by Flow Cytometry

분리 및 유동 세포 계측법에 의해 췌장 중간 엽 세포 분석

The pancreas is comprised of epithelial cells that are required for food digestion and blood glucose regulation. Cells of the pancreas microenvironment, ...

A Standardized Approach for Multispecies Purification of Mammalian Male Germ Cells by Mechanical Tissue Dissociation and Flow Cytometry

기계 조직 해리 및 유동 세포 계측법에 의한 포유 동물 수컷 세포의 다중 종 정제에 대한 표준화 된 접근법

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) has been one of the methods of choice to isolate enriched populations of mammalian testicular germ cells. ...

Multi-Photon Time Lapse Imaging to Visualize Development in Real-time: Visualization of Migrating Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos

실시간으로 개발을 시각화 하기 위해 다중 광자 시간 경과 영상: 마이그레이션 Zebrafish 태아 신경 크레스트 셀의 시각화

Congenital eye and craniofacial anomalies reflect disruptions in the neural crest, a transient population of migratory stem cells that give rise to ...

Use of Hematopoietic Stem Cell Transplantation to Assess the Origin of Myelodysplastic Syndrome

조 혈 줄기 세포 이식 Myelodysplastic 증후군의 평가에 사용

Myelodysplastic syndromes (MDS) are a diverse group of hematopoietic stem cell disorders that are defined by ineffective hematopoiesis, peripheral blood ...

Adult Mouse Digit Amputation and Regeneration: A Simple Model to Investigate Mammalian Blastema Formation and Intramembranous Ossification

성인 마우스 숫자 절단 및 재생 : 포유류 블라스터 마 형성 및 intramembranous Ossification을 조사하는 간단한 모델

Here, we present a protocol of adult mouse distal terminal phalanx (P3) amputation, a procedurally simple and reproducible mammalian model of epimorphic ...

Assessment of Oxidative Damage in the Primary Mouse Ocular Surface Cells/Stem Cells in Response to Ultraviolet-C (UV-C) Damage

Assessment of Oxidative Damage in the Primary Mouse Ocular Surface Cells/Stem Cells in Response to Ultraviolet-C UV-C Damage

자외선-C (UV-C) 손상에 응하여 1 차 마우스 안구 표면 세포/줄기 세포에 있는 산화 손상의 평가

The ocular surface is subjected to regular wear and tear due to various environmental factors. Exposure to UV-C radiation constitutes an occupational ...