Name: image processing protocol for the analysis of the diffusion and cluster size of membrane receptors by fluorescence microscopy
Uploaded: 2019-04-09T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Image Processing Protocol for the Analysis of the Diffusion and Cluster Size of Membrane Receptors by Fluorescence Microscopy at JoVE.com

نحن نشكر مانزو كارلو وماريا غارسيا براجو للتعليمات البرمجية الخاصة بهم في التعليمات ومصدر لتحليل معامل نشر. بتأييد هذا العمل في جزء من المنح المقدمة من وزارة العلوم الإسبانية، والابتكار والجامعات (القوات المسلحة السودانية عام 2017-82940-R) وبرنامج ريتيكس معهد الصحة "كارلوس الثالث" (RD12/0009/009 و RD16/0012/0006؛ RIER). تدريبيا والشركة معتمدة من قبل برنامج كومفوتورو للسفن العامة مؤسسة.

1-إعداد العينات البيولوجية
<ol><li>تنمو خلايا جوركات في المتوسط RPMI 1640 تستكمل مع 10 ٪ السفح، نابير ولام الجلوتامين (ربمي كاملة). الخلايا جوركات اليكتروبوراتي (20 × 106 خلايا/400 ميليلتر من 1640 RPMI مع السفح 10 ٪) مع ناقل مستقبلات chemokine أحادي بروتينات فلورية خضراء المسمى (CXCR4-أكجفب، 20 ميكروغرام) للسم?...

<ol>
	<li>Yu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+studies+in+live+cells.">Single-molecule studies in live cells.</a> Annual Review of Pysical Chemistry. 67 (565-585), (2016).</li><li>Mattheyses, A. L., Simon, S. M., Rappoport, J. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+with+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy+for+the+cell+biologist.">Imaging with total internal reflection fluorescence microscopy for the cell biologist.</a> Journal of Cell Science. 123 (Pt 21), 3621-3628 (2010).</li><li>Jaqaman, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+single-particle+tracking+in+live-cell+time-lapse+sequences.">Robust single-particle tracking in live-cell time-lapse sequences.</a> Nature Methods. 5 (8), 695-702 (2008).</li><li>Bakker, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lateral+mobility+of+individual+integrin+nanoclusters+orchestrates+the+onset+for+leukocyte+adhesion.">Lateral mobility of individual integrin nanoclusters orchestrates the onset for leukocyte adhesion.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 109 (13), 4869-4874 (2012).</li><li>Kusumi, A., Sako, Y., Yamamoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confined+lateral+diffusion+of+membrane+receptors+as+studied+by+single+particle+tracking+(nanovid+microscopy).+Effects+of+calcium-induced+differentiation+in+cultured+epithelial+cells.">Confined lateral diffusion of membrane receptors as studied by single particle tracking (nanovid microscopy). Effects of calcium-induced differentiation in cultured epithelial cells.</a> Biophysical Journal. 65 (5), 2021-2040 (1993).</li><li>Ferrari, R. M., Manfroi, A. J., Young, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strongly+and+weakly+self-similar+diffusion.">Strongly and weakly self-similar diffusion.</a> Physica D. 154, 111-137 (2001).</li><li>Sbalzarini, I. F., Koumoutsakos, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feature+point+tracking+and+trajectory+analysis+for+video+imaging+in+cell+biology.">Feature point tracking and trajectory analysis for video imaging in cell biology.</a> Journal of Structural Biology. 151 (2), 182-195 (2005).</li><li>Ewers, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-particle+tracking+of+murine+polyoma+virus-like+particles+on+live+cells+and+artificial+membranes.">Single-particle tracking of murine polyoma virus-like particles on live cells and artificial membranes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 102 (42), 15110-15115 (2005).</li><li>Manzo, C., Garcia-Parajo, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+progress+in+single+particle+tracking:+from+methods+to+biophysical+insights.">A review of progress in single particle tracking: from methods to biophysical insights.</a> Report on Progress in Physics. 78 (12), 124601 (2015).</li><li>Calebiro, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+analysis+of+fluorescently+labeled+G-protein-coupled+receptors+reveals+complexes+with+distinct+dynamics+and+organization.">Single-molecule analysis of fluorescently labeled G-protein-coupled receptors reveals complexes with distinct dynamics and organization.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 110 (2), 743-748 (2013).</li><li>Digman, M. A., Dalal, R., Horwitz, A. F., Gratton, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+the+number+of+molecules+and+brightness+in+the+laser+scanning+microscope.">Mapping the number of molecules and brightness in the laser scanning microscope.</a> Biophysical Journal. 94 (6), 2320-2332 (2008).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Martinez-Munoz, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separating+Actin-Dependent+Chemokine+Receptor+Nanoclustering+from+Dimerization+Indicates+a+Role+for+Clustering+in+CXCR4+Signaling+and+Function.">Separating Actin-Dependent Chemokine Receptor Nanoclustering from Dimerization Indicates a Role for Clustering in CXCR4 Signaling and Function.</a> Molecular Cell. 70 (1), 106-119 (2018).</li><li>Destainville, N., Salome, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+and+correction+of+systematic+errors+due+to+detector+time-averaging+in+single-molecule+tracking+experiments.">Quantification and correction of systematic errors due to detector time-averaging in single-molecule tracking experiments.</a> Biophysical Journal. 90 (2), L17-L19 (2006).</li></ol>

وصف الأسلوب السهل للقيام حتى بدون وجود أي خبرة سابقة في العمل مع Matlab. بيد أن الروتين Matlab تتطلب بالغة الدقة مع تسمية الأوامر المختلفة وإضفاء الطابع المحلي على المجلدات المختلفة المستخدمة من قبل البرنامج. في التعقب التحليل الروتيني (الخطوة 3)، يمكن تعديل معلمات متعددة. نافذة "إعداد خليط ضباب?...

بروتينات الغشاء جزءا لا يتجزأ من بلير الدهن في حركة مستمرة بسبب نشر الحرارية. ديناميتها ضرورية لتنظيم استجابات الخلية، كما جزيئية تسمح تشكيل المجمعات التي تختلف في الحجم من مونومرات إلى ليغومرات وتؤثر في استقرار مما يشير إلى المجمعات. وهكذا توضيح آليات السيطرة على ديناميات البروتين تحديا جديداً في بيولوجيا الخلايا، اللازمة لفهم سبل توصيل الإشارات وتحديد مهام الخلية غير متوقعة.
وقد وضعت بعض وسائل بصرية لدراسة هذه التفاعلات في معيشة الخلايا1. ومن بين هذه، يسمح الانعكاس الداخلي الكلي مجهرية الفلورية (TIRF)، وضعت في أوائل الثمانينات، دراسة التفاعلات الجزيئية على أو بالقرب جداً من غشاء الخلية2. دراسة المعاملات الحيوية من الغشاء بروتين المسارات التي تم الحصول عليها من بيانات TIRF في الخلايا الحية، مطلوب جسيم واحد تتبع أسلوب (SPT). على الرغم من أن تتوفر عدة خوارزميات لذلك، نستخدم حاليا تلك التي نشرتها جاكامان et al.3 التي تعالج تباين الحركة الجسيمات في حقل جسيمات كثيفة التي تربط الجزيئات بين إطارات متتالية للاتصال المسار الناتج شرائح في مسارات كاملة (اختفاء الجسيمات مؤقتة). البرنامج يلتقط الجسيمات دمج وتقسيم تلك النتيجة من التجميع وتفكك الأحداث3. من بيانات الإخراج من هذا البرنامج الكشف عن الجسيمات على طول المسار الكامل بتحديد مواقفها X و Y في كل إطار.
وبمجرد اكتشاف الجسيمات، نقوم بتطبيق خوارزميات مختلفة لتحديد تيميلاج قصيرة نشرها معامل (د1-4)4،5. بتطبيق التحليل8 7،،من6لحظة قياس الطيف (MSS) أو عن طريق تركيب القيمة 'ألفا' بالتكيف للتشرد متوسط مربع (MSD) ل المنحنى9، نحن أيضا تصنيف الجسيمات استناداً إلى نوع المسار.
تحليل كثافة بقعة في الصور الأسفار هدف مشترك للعلماء في ميدان10،11. الخوارزمية الأكثر شيوعاً المستخدمة هو عدد ما يسمى والسطوع. ومع ذلك لا يسمح هذا الأسلوب الكشف الصحيح الإطار بكثافة في الجسيمات في كسر الجوال. ونحن، وهكذا ولدت خوارزمية جديدة لتقييم هذه الجسيمات كثافات الإطار حسب الإطار وتحديد حالتها التجميع. بمجرد اكتشاف إحداثيات كل الجسيمات باستخدام البرمجيات Track2 يو3، علينا أن نحدد كثافة في كل إطار عبر مسار كامل، أيضا مع مراعاة الخلفية الخلية في كل إطار. هذا البرنامج يوفر إمكانيات مختلفة لتحديد كثافة بقعة وخلفية الخلية، واستخدام البروتينات أحادي و dimeric المعروفة كمراجع، يحسب العدد التقريبي للبروتينات في الكشف عن الجسيمات (حجم الكتلة).
في هذه المقالة، يصف لنا دليل دقيق لتنفيذ الخطوات الثلاثة التالية: 1) كشف وتتبع الجسيمات واحدة على طول شريط فيديو للأسفار مجهرية باستخدام يو-المسار؛ 2) تحليل معامل نشر فوري (د1-4) لتلك الجزيئات ونوع الحركة (المحصورة أو الحرة أو الموجهة) الجسيمات مع مسارات طويلة من MSS؛ 3) قياس كثافة بقعة على طول الفيديو تصحيح بالأسفار الخلفية المقدرة لكل نقطة. وهذا يسمح لتقدير حجم الكتلة، وتحديد الخطوات فوتوبليتشينج.
استخدام هذا البروتوكول لا تتطلب مهارات متخصصة ويمكن أن يؤديها في أي مختبر مع ثقافة الخلية، والتدفق الخلوي والفحص المجهري مرافق. يستخدم البروتوكول إيماجيج أو فيجي (توزيع ImageJ12) والمسار يو3وبعض إجراءات المخصصة المقدمة الإعلانية (http://i2pc.es/coss/Programs/protocolScripts.zip). إجراءات يو--المسار والمخصصة دهس Matlab التي يمكن تثبيتها في أي كمبيوتر متوافق.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:797px;" width="797">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">Human Jurkat cells</td>
			<td style="width:203px;">ATCC</td>
			<td style="width:203px;">CRL-10915</td>
			<td style="width:171px;">Human T cell line. Any other cell type can be analyzed with this software</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:221px;">pAcGFPm-N1 (PT3719-5)DNA3GFP</td>
			<td style="width:203px;">Clontech</td>
			<td style="width:203px;">632469</td>
			<td>Different fluorescent proteins can be followed and analyzed with this routine</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:221px;">Gene Pulse X Cell electroporator&#160;</td>
			<td>BioRad&#160;</td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td>We use 280V, 975 mF, for Jurkat cells.&#160; Use the transfection method best working in your hands.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cytomics FC 500 flow cytometer&#160;</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MoFlo Astrios Cell Sorter&#160;</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td>Depending on the level of transfection, cell sorting may not be required.&#160; You can also employ cells with stable expression of adequate levels of the receptor of interest.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">Dako Qifikit</td>
			<td style="width:203px;">DakoCytomation</td>
			<td style="width:203px;">K0078</td>
			<td>Used for quantification the number of receptors in the cell surface.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">Glass bottom microwell dishes</td>
			<td style="width:203px;">MatTek corporation</td>
			<td style="width:203px;">P35G-1.5-10-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:221px;">Human Fibronectin from plasma</td>
			<td style="width:203px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:203px;">F0895</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">Recombinant human CXCL12</td>
			<td style="width:203px;">PeproTech</td>
			<td style="width:203px;">300928A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">Inverted Leica AM TIRF</td>
			<td style="width:203px;">Leica</td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">EM-CCD camera</td>
			<td style="width:203px;">Andor&#160;</td>
			<td style="width:203px;">DU 885-CSO-#10-VP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">MATLAB</td>
			<td style="width:203px;">The MathWorks, Natick, MA</td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">U-Track2 software</td>
			<td style="width:203px;">Danuser Laboratory</td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">ImageJ</td>
			<td style="width:203px;">NIH</td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td>https://imagej.nih.gov/ij/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">FiJi</td>
			<td style="width:203px;">FiJI</td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td>https://imagej.net/Fiji)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">u-Track2 software</td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td>Matlab tool.&#160; For installing, download .zip file from the web page (http://lccb.hms.harvard.edu/software.html) and uncompress the file in a directory of your choice</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">GraphPad Prism</td>
			<td style="width:203px;">GraphPad software</td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

image processing protocol for the analysis of the diffusion and cluster size of membrane receptors by fluorescence microscopy

الجسيمات التي تتبع في تسلسل فيديو والتحليل اللاحق لمساراتها في الوقت الحاضر بعملية مشتركة في العديد من الدراسات البيولوجية. تحليل مستقبلات غشاء الخلية باستخدام مجموعات كنموذج، ونحن في الوقت الحاضر بروتوكول مفصل لهذه المهمة تحليل الصور باستخدام فيجي (إيماجيج) وإجراءات Matlab ل: 1) تحديد المناطق ذات الاهتمام وتصميم أقنعة تتكيف مع هذه المناطق؛ 2) تتبع الجسيمات في الأسفار مجهرية أشرطة الفيديو؛ 3) تحليل خصائص انتشار وشدة من المسارات المحددة. التحليل الكمي لمعاملات نشر، أنواع الحركة، وحجم الكتلة التي حصلت عليها مجهرية الأسفار ومعالجة الصور ويوفر أداة قيمة لتحديد موضوعيا ديناميات الجسيمات والمترتبة على تعديل الظروف البيئية. في هذا المقال نقدم بروتوكولات مفصلة لتحليل هذه الميزات. الطريقة الموضحة هنا ليس فقط يسمح الكشف عن تتبع جزيء واحد، ولكن أيضا أتمتة تقدير معلمات الانتشار الأفقي في غشاء الخلية ويصنف نوع مسار ويسمح تحليل كامل وبالتالي التغلب على الصعوبات في قياس حجم بقعة على مساره الكامل في غشاء الخلية.

يسمح استخدام هذا البروتوكول التتبع الآلي من الجسيمات التي اكتشفت في الأسفار مجهرية الأفلام وتحليل الخصائص الدينامية ل. في البداية، هي transfected الخلايا مع البروتين إلى جانب فلوريسسينتلي تعقبه. يعرض المستوى المناسب من مستقبلات على سطح الخلية يسمح SPT يتم الحصول عليها بالخلي?...

Watch this Scientific Journal Video about Image Processing Protocol for the Analysis of the Diffusion and Cluster Size of Membrane Receptors by Fluorescence Microscopy at JoVE.com

Image Processing Protocol for the Analysis of the Diffusion and Cluster Size of Membrane Receptors by Fluorescence Microscopy

معالجة البروتوكول لتحليل نشر وحجم الكتلة من مستقبلات الغشاء بالفحص المجهري Fluorescence الصور

نقدم هنا، بروتوكولا للجسيمات واحدة تتبع تحليل الصور التي تتيح التقييم الكمي لنشر معاملات، أنواع الحركة والكتلة أحجام الجسيمات واحد الكشف عنها بواسطة الفحص المجهري الأسفار.

Particle tracking on a video sequence and the posterior analysis of their trajectories is nowadays a common operation in many biological studies. Using ...

تتطلب تقنيات المجهر الجديدة تطوير أدوات كافية للفهم الصحيح للعمليات البيولوجية التي يتم دراستها. يصف هذا البروتوكول خطوات معالجة الصور المطلوبة لتتبع الجزيء الواحد، بما في ذلك تقدير معلمات الانتشار الجانبي والتدين الكمي لحجم البقعة على مسارها بأكمله في غشاء الخلية. يجمع هذا البروتوكول بين استخدام العديد من قطع البرامج ، بما في ذلك ImageJ و MATLAB و uTrack ، بالإضافة إلى بعض البروتينات التي تم تطويرها خصيصًا لهذا البروتوكول.ويتضح هذا الأسلوب مع تتبع مستقبلات الأغشية تحت المجهر الخفيف، ولكن يمكن تطبيقها على أي هيكل يشبه الجسيمات التي يمكن تتبع مساراتها مع مرور الوقت في تسلسل الفيديو. هذه التقنية تتعلق بالبحوث الأساسية وليس لها تطبيق مباشر في بيئة سريرية. ومع ذلك، يمكن استخدامه للمساعدة في توصيف الأحداث البيولوجية في كل من الأمراض المختلفة، وبالتالي في تحديد أهداف علاجية جديدة.هذا البروتوكول هو ذات الصلة لتتبع الجسيمات في الأغشية الخلوية، كما هو مبين في هذا الفيديو، ولكن يمكن أيضا أن تطبق لتتبع الخلايا الكاملة، والبكتيريا، والجسيمات النانوية في السوائل، أو أي كائن آخر يمكن تحديد مركزه بشكل جيد. هذا البروتوكول سهل الاستخدام ويتطلب فقط معرفة ثقافة الخلية وتقنيات الفحص المجهري. قد تروع التقنيات المختلفة وأدوات المعلوماتية المستخدمة في هذا البروتوكول مستخدم جديد.مظاهرة بصرية يساعد المرء على استخدام هذه التقنية مع الثقة. للبدء، تنمو خلايا جوركات، transfect لهم مع أحادية هجم GFP المسمى chemokine مستقبلات ناقلات، وحدد الخلايا مع مستويات التعبير المنخفضة من ناقلات المسمى، كما هو موضح في بروتوكول النص المرافق. إضافة وسائل الإعلام التي تحتوي على CXCL12 ليغاند أو وسائل الإعلام التحكم في كل الليفية المغلفة 35 ملليمتر الزجاج القاع أطباق المايكويل التي تم المغلفة مع fibronectin، واحتضان لمدة ساعة واحدة في 37 درجة مئوية.بعد ذلك، أضف الخلايا المفرزة إلى كل طبق، وحضن لمدة 20 دقيقة قبل تصوير الخلايا. بعد الحضانة، نقل الطبق الأول من الخلايا إلى مرحلة المجهر TIRF وتتحول إلى هدف غمر النفط 100x. تحديد موقع والتركيز على الخلايا باستخدام حقل مشرق لتقليل تأثيرات التحسس الضوئي.ثم قم بالتبديل إلى وضع TIRF وقم بإجراء تعديل التركيز الدقيق باستخدام كثافة الليزر المنخفضة. الحصول على أفلام بطول 50 ثانية تقريبًا، مما يقلل من الفاصل الزمني بين الإطارات. لكل ملف فيديو حالة تجريبية، قم بإنشاء مجلد جديد باتباع توجيهات بنية الملف الموضحة في بروتوكول نص هذا الفيديو.افتح الفيديو مع فيجي أو ImageJ عن طريق سحب وإسقاط الملف على شريط قوائم فيجي، وانقر على موافق لاستيراد الملف LIF باستخدام الفورم الحيوي. من أجل تصميم قناع، وأيضا استيراد المقابلة متعددة القنوات صورة. بعد ذلك، قم بإنشاء قناع عن طريق إنشاء صورة واحدة أولاً مع القنوات المفيدة لتصميم القناع.حدد صورة في قائمة الشريط، وانقر على اللون متبوعاً بـ Split Channels لعرض القنوات المختلفة كصور منفصلة. دمج القنوات الثلاث مرة أخرى في صورة واحدة عن طريق تحديد صورة في قائمة الشريط، والذهاب إلى اللون، وتحديد قنوات الدمج. تأكد من تحديد القنوات المناسبة ثم اضغط موافق لإنشاء صورة جديدة غير مكدسة.مزامنة الإطارين عن طريق الانتقال إلى قائمة الشريط، وتحديد تحليل، ثم الانتقال إلى أدوات وتحديد مزامنة Windows. ستظهر نافذة جديدة مع إمكانيات الصورة المتزامنة. الآن، مع مزامنة الإطارين، يمكن اقتصاص نفس المنطقة في كلا الإطارين.انتقل إلى صورة في قائمة الشريط وحدد اقتصاص. مع أداة اختيار مستطيلة، رسم المنطقة من الفائدة. سيتم عرض الصورتين المقتصتين بشكل فردي.بعد ذلك، عدم مزامنة كلا الإطارين. إذا لم يتم إنشاء قناع، ارسم المنطقة التي تهمك باستخدام أداة التحديد والمحاصيل. بعد ذلك، حفظ الفيديو كتسلسل صورة في دليل Videosec.ثم حدد الصورة متعددة القنوات، انتقل إلى الإضافات في القائمة، وحدد محرر التجزئة لفتح البرنامج المساعد محرر التجزئة. اختر أداة التحديد اليدوي، واستخدمها لتحديد تسمية خضراء وتصميم القناع الخارجي. بمجرد تصميمها، اضغط على زر Plus في خيار التحديد من النافذة المركبة، وسيتم عرض القناع المحدد على العارض.كرر هذه الخطوة لكافة التسميات. بمجرد تصميم جميع الأقنعة، احفظ القناع بنفس اسم الملف مثل الفيديو، مع الاسم: قناع.tif. افتح MATLAB وأضف دليل uTrack إلى المسار من خلال الانتقال إلى تعيين المسار ، وتحديد إضافة مع.ثم قم بتغيير "دليل العمل" إلى الدليل الذي يحتوي على سلسلة لتحليل. استدعاء uTrack عن طريق كتابة الفيلم محدد GUI في وحدة التحكم والضغط على أدخل. سيؤدي هذا إلى فتح إطار تحديد الفيلم.اضغط على زر فيلم جديد، وانتظر حتى تظهر نافذة "إضافة الفيلم". اضغط على إضافة قناة لاختيار الدليل مع الفيديو وملء المعلمات معلومات الفيلم. تعيين الدليل الإخراج لنتائج uTrack إلى النتائج، ثم، اضغط على إعدادات القناة المتقدمة، وملء المعلمات المتعلقة بالاستحواذ، وحفظ.بعد إنشاء الفيلم، اضغط على متابعة في إطار تحديد الفيلم. هنا، سوف uTrack يسأل عن نوع الكائن ليتم تحليلها. اختر الجسيمات المفردة، ثم ستظهر نافذة لوحة التحكم.بعد ذلك، حدد الخطوة الأولى، الخطوة 1: الكشف عن، وانقر على الإعداد. سوف تظهر إطار تركيب الخليط الغاوسي الإعداد. أدخل الإعدادات كما هو موضح هنا، ثم اضغط على تطبيق.في لوحة التحكم، انقر على تشغيل لتشغيل خطوة الكشف. بعد بضع دقائق، تحقق من النتائج عن طريق الضغط على زر النتيجة. يُظهر الفيلم دوائر حمراء على الجسيمات المكتشفة.إذا لم يتم عرض دائرة حمراء، فإن هذه الخطوة لم تعمل بشكل صحيح ويجب عليك المحاولة مرة أخرى. الآن، دمج الجسيمات التي تم الكشف عنها للتو في المسارات التي تمتد إطارات متعددة عن طريق إعداد المعلمات أولا كما هو مبين هنا. ثم اضغط على تشغيل في لوحة التحكم.بعد ذلك، قم بإجراء تحليل المسار. تعريف الإعدادات، كما هو موضح هنا، ثم اضغط على تطبيق وتشغيل. تحقق من النتائج عن طريق الضغط أولاً على زر النتيجة ، ثم ، انقر على إظهار رقم المسار من نافذة خيارات الفيلم وتحقق من الإطار حسب الإطار الذي تم تحديده بشكل صحيح كل مسار ، ووضع علامات على الجسيمات التي ليست حقيقية يدويًا.في MATLAB، أدخل الأمر كما هو موضح هنا. هذا الأمر سوف يسبب البرنامج لقراءة جميع المسارات وحساب معاملات الانتشار. بعد ذلك، استبعاد المسارات المقابلة للبقع أو المسارات التي تم تحديدها بشكل غير صحيح من خلال إعطاء قائمة البقع لاستبعادها.حساب معاملات الانتشار الفوري لكل واحد من مسارات هذه الخلية باتباعها في بروتوكول النص المصاحب. في هذه الحالة، حساب معامل الانتشار للتخلف الزمني يساوي 4 يسمى D1 إلى 4. عند الانتهاء، تتحلل المسارات إلى مسارات قصيرة وطويلة.لتحليل المسارات الطويلة، اكتب الأمر كما هو موضح هنا لتصنيف نوع الحركة من خلال طيف قياس اللحظات. تحليل كثافة كل جسيم على طول مسارها. تكوين هذا السلوك الأساسي بطرق مختلفة متعددة باتباعها في بروتوكول النص المصاحب.ثم، جمع معلومات الانتشار وكثافة لجميع المسارات. جمع فقط معلومات الانتشار وكثافة للمسارات القصيرة. وأخيراً، قم بجمع قياس الطيف في اللحظة ومعلومات الكثافة عن طريق كتابة ما يلي، حيث تكون فترة طويلة هي اللاحقة المستخدمة سابقاً.ويتيح استخدام التقنيات الموصوفة في هذا البروتوكول إمكانية التتبع الآلي للجسيمات المكتشفة في أفلام المجهر المفلورية وتحليل خصائصها الدينامية. من هذا التحليل، يمكن للمرء الحصول على خصائص مختلفة على أساس الاختلافات في المحفزات. وهذا يشمل، النسبة المئوية للبقع غير المُتحركة استناداً إلى أربعة محفزات مختلفة، والنسبة المئوية للمسارات الطويلة التي تزيد على 50 إطارًا، وأنواع الحركة على طول المسارات على النحو الذي تم تقسيمه بواسطة حركات موجهة أو حرة أو محصورة.وبالإضافة إلى ذلك، يمكن تحديد معامل الانتشار، وتكثّل البقعة المتوسط، وعدد المستقبلات لكل جسيم. وهذا يبين توزيع قيم معامل الانتشار القصير لكل بقعة استجابة للمحفزات المختلفة. يمثل الخط الأحمر القيمة الوسيطة، وهذا الرسم البياني المماثل يظهر متوسط كثافة البقعة لكل بقعة على طول إطاراتها العشرين الأولى استجابة لنفس المحفزات.مرة أخرى، يمثل الخط الأحمر قيمة متوسط الكثافة. كما ترتبط كثافة بقعة تصحيح متوسط مع عدد من البروتينات الفلورية الموجودة في هذه البقعة، يمكن للمرء أن يحسب مباشرة عدد المستقبلات لكل جسيم، كما هو مبين هنا. MATLAB هي لغة برمجة حساسة لحالة الأحرف.قد تختلف أسماء المتغيرات فيما يتعلق بتلك الموضحة في هذا البروتوكول، ولكن تأكد من أن تكون متناسقة في التسمية. لا يمكن تغيير أسماء الدالات، والفواصل، والقطّر، والفواصل من النقطتين مهمة لبناء جملة صحيح. يسمح المجهر أحادي الجزيء بالتصور للبروتينات الغشاء الفردية مع دقة ملعقة زمنية غير مسبوقة ويوفر فرصًا فريدة للكشف عن الجوانب غير المتوقعة لبيولوجيا الخلايا.هذه البروتوكولات تفتح أبوابا جديدة للتحليل الكمي لأشرطة الفيديو المجهرية في الخلايا والبيولوجيا الجزيئية.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Intravital Microscopy of the Spleen: Quantitative Analysis of Parasite Mobility and Blood Flow

Intravital الميكروسكوب في الطحال : التحليل الكمي للتنقل الطفيلي وتدفق الدم

The advent of intravital microscopy in experimental rodent malaria models has allowed major advances to the knowledge of parasite-host interactions 1,2. ...

Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

وحيد الخلية تحليل<emالعصوية الرقيقة> الأغشية الحيوية باستخدام المجهر الإسفار والتدفق الخلوي

Biofilm formation is a general attribute to almost all bacteria 1-6. When bacteria form biofilms, cells are encased in extracellular matrix that is mostly ...

Antigens Protected Functional Red Blood Cells By The Membrane Grafting Of Compact Hyperbranched Polyglycerols

محمي مستضدات خلايا الدم الحمراء وظيفية بواسطة الغشاء مسمار Polyglycerols Hyperbranched الاتفاق

Red blood cell (RBC) transfusion is vital for the treatment of a number of acute and chronic medical problems such as thalassemia major and sickle cell ...

Fluorescence Microscopy Methods for Determining the Viability of Bacteria in Association with Mammalian Cells

مضان المجهري طرق لتحديد الجدوى من البكتيريا في جمعية مع خلايا الثدييات

Central to the field of bacterial pathogenesis is the ability to define if and how microbes survive after exposure to eukaryotic cells. Current protocols ...

Analysis of the Epithelial Damage Produced by Entamoeba histolytica Infection

Analysis of the Epithelial Damage Produced by Entamoeba histolytica Infection

تحليل الأضرار الظهارية التي تنتجها<em&gt; المتحولة الحالة للنسج</em&gt; عدوى

Entamoeba histolytica is the causative agent of human amoebiasis, a major cause of diarrhea and hepatic abscess in tropical countries. Infection is ...

Measuring Phagosome pH by Ratiometric Fluorescence Microscopy

قياس درجة الحموضة يبلوع التي كتبها Ratiometric المجهر مضان

Phagocytosis is a fundamental process through which innate immune cells engulf bacteria, apoptotic cells or other foreign particles in order to kill or ...

Cortical Actin Flow in T Cells Quantified by Spatio-temporal Image Correlation Spectroscopy of Structured Illumination Microscopy Data

القشرية أكتين تدفق في خلايا T كميا بواسطة المكانية والزمانية صورة الارتباط الطيفي للهيكلة الإضاءة المجهر البيانات

Filamentous-actin plays a crucial role in a majority of cell processes including motility and, in immune cells, the formation of a key cell-cell ...

Preparation of CD4+ T Cells for Analysis of GD3 and GD2 Ganglioside Membrane Expression by Microscopy

Preparation of CD4+ T Cells for Analysis of GD3 and GD2 Ganglioside Membrane Expression by Microscopy

إعداد CD4<sup&gt; +</sup&gt; خلايا T للتحليل GD3 وGD2 غانغليوزيد غشاء التعبير بواسطة الميكروسكوب

The methods described herein for activation of na&#239;ve CD4+ T cells in suspension and their adherence in coverslips for confocal microscopy analysis ...

Molecular Diffusion in Plasma Membranes of Primary Lymphocytes Measured by Fluorescence Correlation Spectroscopy

إنتشار الجزيئي في أغشية البلازما الخلايا اللمفاوية الابتدائية تقاس الإسفار الارتباط الطيفي

Fluorescence correlation spectroscopy (FCS) is a powerful technique for studying the diffusion of molecules within biological membranes with high spatial ...