Name: image processing protocol for the analysis of the diffusion and cluster size of membrane receptors by fluorescence microscopy
Uploaded: 2019-04-09T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Image Processing Protocol for the Analysis of the Diffusion and Cluster Size of Membrane Receptors by Fluorescence Microscopy at JoVE.com

Vi er taknemmelige for Carlo Manzo og Maria García Parajo for deres hjælp og kilde kode af diffusion koefficient analyse. Dette arbejde blev delvist understøttet af tilskud fra den spanske Ministeriet for forskning, Innovation og universiteter (SAF 2017-82940-R) og RETICS Program af Instituto de salud Carlos III (RD12/0009/009 og RD16/0012/0006; RE). LMM og JV understøttes af programmet COMFUTURO af Fundación General CSIC.

1. forberedelse af biologiske prøver
<ol><li>Vokse Jurkat celler i RPMI 1640 medium suppleret med 10% FCS, NaPyr og L-glutamin (komplet RPMI). Electroporate Jurkat celler (20 x 106 celler/400 µL af RPMI 1640 med 10% FCS) med en monomere normal god landbrugspraksis-mærket chemokine receptor vektor (CXCR4-AcGFP, 20 μg) at tillade dens afsløring, ved hjælp af Fluorescens mikroskopi. Bemærk: Det er muligt at bruge andre monomere fluorescerende proteiner såsom mCherry, mScarlet, osv.</...

<ol>
	<li>Yu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+studies+in+live+cells.">Single-molecule studies in live cells.</a> Annual Review of Pysical Chemistry. 67 (565-585), (2016).</li><li>Mattheyses, A. L., Simon, S. M., Rappoport, J. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+with+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy+for+the+cell+biologist.">Imaging with total internal reflection fluorescence microscopy for the cell biologist.</a> Journal of Cell Science. 123 (Pt 21), 3621-3628 (2010).</li><li>Jaqaman, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+single-particle+tracking+in+live-cell+time-lapse+sequences.">Robust single-particle tracking in live-cell time-lapse sequences.</a> Nature Methods. 5 (8), 695-702 (2008).</li><li>Bakker, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lateral+mobility+of+individual+integrin+nanoclusters+orchestrates+the+onset+for+leukocyte+adhesion.">Lateral mobility of individual integrin nanoclusters orchestrates the onset for leukocyte adhesion.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 109 (13), 4869-4874 (2012).</li><li>Kusumi, A., Sako, Y., Yamamoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confined+lateral+diffusion+of+membrane+receptors+as+studied+by+single+particle+tracking+(nanovid+microscopy).+Effects+of+calcium-induced+differentiation+in+cultured+epithelial+cells.">Confined lateral diffusion of membrane receptors as studied by single particle tracking (nanovid microscopy). Effects of calcium-induced differentiation in cultured epithelial cells.</a> Biophysical Journal. 65 (5), 2021-2040 (1993).</li><li>Ferrari, R. M., Manfroi, A. J., Young, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strongly+and+weakly+self-similar+diffusion.">Strongly and weakly self-similar diffusion.</a> Physica D. 154, 111-137 (2001).</li><li>Sbalzarini, I. F., Koumoutsakos, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feature+point+tracking+and+trajectory+analysis+for+video+imaging+in+cell+biology.">Feature point tracking and trajectory analysis for video imaging in cell biology.</a> Journal of Structural Biology. 151 (2), 182-195 (2005).</li><li>Ewers, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-particle+tracking+of+murine+polyoma+virus-like+particles+on+live+cells+and+artificial+membranes.">Single-particle tracking of murine polyoma virus-like particles on live cells and artificial membranes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 102 (42), 15110-15115 (2005).</li><li>Manzo, C., Garcia-Parajo, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+progress+in+single+particle+tracking:+from+methods+to+biophysical+insights.">A review of progress in single particle tracking: from methods to biophysical insights.</a> Report on Progress in Physics. 78 (12), 124601 (2015).</li><li>Calebiro, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+analysis+of+fluorescently+labeled+G-protein-coupled+receptors+reveals+complexes+with+distinct+dynamics+and+organization.">Single-molecule analysis of fluorescently labeled G-protein-coupled receptors reveals complexes with distinct dynamics and organization.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 110 (2), 743-748 (2013).</li><li>Digman, M. A., Dalal, R., Horwitz, A. F., Gratton, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+the+number+of+molecules+and+brightness+in+the+laser+scanning+microscope.">Mapping the number of molecules and brightness in the laser scanning microscope.</a> Biophysical Journal. 94 (6), 2320-2332 (2008).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Martinez-Munoz, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separating+Actin-Dependent+Chemokine+Receptor+Nanoclustering+from+Dimerization+Indicates+a+Role+for+Clustering+in+CXCR4+Signaling+and+Function.">Separating Actin-Dependent Chemokine Receptor Nanoclustering from Dimerization Indicates a Role for Clustering in CXCR4 Signaling and Function.</a> Molecular Cell. 70 (1), 106-119 (2018).</li><li>Destainville, N., Salome, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+and+correction+of+systematic+errors+due+to+detector+time-averaging+in+single-molecule+tracking+experiments.">Quantification and correction of systematic errors due to detector time-averaging in single-molecule tracking experiments.</a> Biophysical Journal. 90 (2), L17-L19 (2006).</li></ol>

Den beskrevne metode er let at udføre selv uden at have nogen tidligere erfaring med Matlab. Matlab rutiner kræver imidlertid meget nøjagtighed med nomenklaturen for de forskellige kommandoer og lokalisering af de forskellige mapper ansat af programmet. I sporing analyse rutine (trin 3), flere parametre kan ændres. Vinduet "Indstilling Gaussisk-blanding Model Fitting" (trin 3.8) styrer, hvordan U-bane vil opdage én partikler på video. Dette gøres ved at montere en Gaussisk blanding model som beskrevet i<sup class=...

Membranproteiner indlejret i lipid tolagede er i kontinuerlig bevægelse på grund af termisk diffusion. Deres dynamics er vigtigt at regulere celle svar, da intermolekylære vekselvirkninger tillader dannelsen af komplekser, der varierer i størrelse fra monomerer til oligomerer og påvirke stabiliteten i signalering komplekser. Belyse de mekanismer, der styrer protein dynamics er således en ny udfordring i cellebiologi, nødvendigt at forstå signaltransduktionsveje og identificere uventede cellefunktioner.
Nogle optiske metoder er blevet udviklet til at studere disse interaktioner i levende celler,1. Blandt disse, total interne reflection fluorescens (JOHANNAS) mikroskopi, udviklet i begyndelsen af 1980 ' erne, giver mulighed for undersøgelse af molekylære vekselvirkninger på eller meget nær cellemembranen2. For at studere dynamiske parametre af membran protein baner fra JOHANNAS data i levende celler, er et enkelt partikel sporing metode (SPT) påkrævet. Selv om flere algoritmer er tilgængelige for det, bruger vi i øjeblikket dem udgivet af Jaqaman et al.3 , adresse partikel bevægelse heterogenitet i en tætte partikel felt ved at sammenkæde partikler mellem på hinanden følgende frames tilsluttes den resulterende spor segmenter i komplet baner (midlertidig partikel forsvinden). Softwaren indfanger partikel sammenlægning og opsplitning som følge af sammenlægning og dissociation begivenheder3. En af outputdata af denne software er påvisning af partikler langs hele bane ved at definere deres X og Y stillinger i hver ramme.
Når partikler er registreret, anvender vi forskellige algoritmer til at bestemme den korte vender diffusion koefficient (D1-4)4,5. Ved at anvende øjeblik skalering spektrum (MSS)6,7,8 analyse eller ved at montere 'alpha' værdien af justering af middelværdi deplacement (MSD) til kurven9klassificere vi også partikler i henhold til typen bane.
Analyse af spot intensitet i fluorescens billeder er et fælles mål for forskere i felt10,11. Den mest almindelige algoritme bruges er den såkaldte antallet og lysstyrke. Denne metode tillader alligevel ikke korrekte frame-by-frame intensitet påvisning i i partikler i den mobile fraktion. Vi har således, genereres en ny algoritme til at vurdere disse partikel intensiteter frame-by-frame og bestemme deres sammenlægning tilstand. Når koordinaterne for hver partikel er registreret ved hjælp af U-Track2 software3, definerer vi dens intensitet i hver ramme over komplet bane, også under hensyntagen til cellebaggrunden i hver ramme. Denne software tilbyder forskellige muligheder for at bestemme den spot intensitet og cellebaggrunden og ved hjælp af kendte monomere og dimerisk proteiner som referencer, beregner det omtrentlige antal proteiner i partikel opdaget (cluster størrelse).
I denne artikel vil vi beskrive en grundig guide til at udføre disse tre trin: 1) påvisning og sporing én partikler langs en video af Fluorescens mikroskopi ved hjælp af U-spor; 2) analyserer den øjeblikkelige diffusion koefficient (D1-4) af disse partikler og typen af bevægelsen (begrænset, gratis eller styret) af partikler med lange baner af MSS; 3) måling af spot intensiteten langs videoen korrigeret af de anslåede baggrund fluorescens af hver plet. Dette giver mulighed for klynge størrelse vurdering og identifikation af photobleaching trinene.
Anvendelse af denne protokol kræver ikke specialiserede færdigheder og kan udføres på et laboratorium med cellekultur, flow flowcytometri og mikroskopi faciliteter. Protokollen bruger ImageJ eller Fiji (en distribution af ImageJ12), U-track3, og nogle ad hoc-lavet rutiner (http://i2pc.es/coss/Programs/protocolScripts.zip). U-bane og ad hoc-rutiner kørt over Matlab, som kan installeres på enhver kompatibel computer.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:797px;" width="797">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">Human Jurkat cells</td>
			<td style="width:203px;">ATCC</td>
			<td style="width:203px;">CRL-10915</td>
			<td style="width:171px;">Human T cell line. Any other cell type can be analyzed with this software</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:221px;">pAcGFPm-N1 (PT3719-5)DNA3GFP</td>
			<td style="width:203px;">Clontech</td>
			<td style="width:203px;">632469</td>
			<td>Different fluorescent proteins can be followed and analyzed with this routine</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:221px;">Gene Pulse X Cell electroporator&#160;</td>
			<td>BioRad&#160;</td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td>We use 280V, 975 mF, for Jurkat cells.&#160; Use the transfection method best working in your hands.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cytomics FC 500 flow cytometer&#160;</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MoFlo Astrios Cell Sorter&#160;</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td>Depending on the level of transfection, cell sorting may not be required.&#160; You can also employ cells with stable expression of adequate levels of the receptor of interest.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">Dako Qifikit</td>
			<td style="width:203px;">DakoCytomation</td>
			<td style="width:203px;">K0078</td>
			<td>Used for quantification the number of receptors in the cell surface.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">Glass bottom microwell dishes</td>
			<td style="width:203px;">MatTek corporation</td>
			<td style="width:203px;">P35G-1.5-10-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:221px;">Human Fibronectin from plasma</td>
			<td style="width:203px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:203px;">F0895</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">Recombinant human CXCL12</td>
			<td style="width:203px;">PeproTech</td>
			<td style="width:203px;">300928A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">Inverted Leica AM TIRF</td>
			<td style="width:203px;">Leica</td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">EM-CCD camera</td>
			<td style="width:203px;">Andor&#160;</td>
			<td style="width:203px;">DU 885-CSO-#10-VP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">MATLAB</td>
			<td style="width:203px;">The MathWorks, Natick, MA</td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">U-Track2 software</td>
			<td style="width:203px;">Danuser Laboratory</td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">ImageJ</td>
			<td style="width:203px;">NIH</td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td>https://imagej.nih.gov/ij/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">FiJi</td>
			<td style="width:203px;">FiJI</td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td>https://imagej.net/Fiji)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">u-Track2 software</td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td>Matlab tool.&#160; For installing, download .zip file from the web page (http://lccb.hms.harvard.edu/software.html) and uncompress the file in a directory of your choice</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">GraphPad Prism</td>
			<td style="width:203px;">GraphPad software</td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

image processing protocol for the analysis of the diffusion and cluster size of membrane receptors by fluorescence microscopy

Partiklen tracking på en videosekvens, og de posteriore analyse af deres baner er i dag en fælles operation i mange biologiske undersøgelser. Ved hjælp af analyse af cellens membran receptor klynger som en model, vi præsenterer en detaljeret protokol for dette billede analyse opgave ved hjælp af Fiji (ImageJ) og Matlab rutiner til: 1) definere områder af interesse og designe masker tilpasset til disse regioner; 2) spore partikler i Fluorescens mikroskopi videoer; 3) analysere diffusion og intensitet egenskaber over udvalgte spor. Kvantitativ analyse af diffusion koefficienter, typer af motion, og cluster størrelse fremstillet af Fluorescens mikroskopi og billedbehandling giver et værdifuldt redskab for at objektivt bestemme partikel dynamics og konsekvenserne af ændring miljøforhold. I denne artikel præsenterer vi detaljerede protokoller til analyse af disse funktioner. Metoden beskrevet her ikke kun giver mulighed for enkelt-molekyle inddeling opdagelse, men også automatiserer estimering af lateral diffusion parametre på cellemembranen, klassificerer typen bane og giver mulighed for komplet analyse således at overvinde den vanskeligheder med at kvantificere spot størrelse over dens hele bane på cellemembranen.

Brug af denne protokol tillader automatiseret sporing af partikler fundet i Fluorescens mikroskopi film og analyse af deres dynamiske egenskaber. I første omgang er celler transfekteret med fluorescently kombineret protein kan spores. Det passende niveau for receptorer præsenterer på celleoverfladen, der giver mulighed for sømløse rør fremstilles af cellen sortering (figur 1). Markerede celler er analyseret af JOHANNAS mikroskopi, der genererer videoer ...

Watch this Scientific Journal Video about Image Processing Protocol for the Analysis of the Diffusion and Cluster Size of Membrane Receptors by Fluorescence Microscopy at JoVE.com

Image Processing Protocol for the Analysis of the Diffusion and Cluster Size of Membrane Receptors by Fluorescence Microscopy

Billedbehandling protokol for analysen af Diffusion og Cluster størrelse af membranreceptorer af Fluorescens mikroskopi

Vi præsenterer her, en protokol for enkelt partikel tracking billedanalyse, der giver mulighed for kvantitative evaluering af diffusion koefficienter, typer af motion og klynge størrelser af én partikler opdaget af Fluorescens mikroskopi.

Particle tracking on a video sequence and the posterior analysis of their trajectories is nowadays a common operation in many biological studies. Using ...

Nye mikroskopiteknikker kræver udvikling af passende værktøjer til korrekt forståelse af de biologiske processer, der undersøges. Denne protokol beskriver de billedbehandlingstrin, der kræves til sporing af et enkelt molekyle, herunder estimering af laterale diffusionsparametre og kvantificering af staffagestørrelse over hele dens bane ved cellemembranen. Denne protokol kombinerer brugen af flere softwarestykker, herunder ImageJ, MATLAB og uTrack, samt nogle proteiner, der er udviklet specielt til denne protokol.Denne metode er illustreret med sporing af membranreceptorer under lysmikroskopi, men den kan anvendes på enhver partikellignende struktur, hvis baner kan spores over tid i en videosekvens. Denne teknik vedrører grundforskning og har ingen direkte anvendelse i kliniske omgivelser. Det kan dog bruges til at støtte karakteriseringen af biologiske hændelser i både forskellige sygdomme og dermed i forbindelse med identifikationen af nye terapeutiske mål.Denne protokol er relevant for sporing af partikler i cellulære membraner, som vist i denne video, men det kan også anvendes til sporing af fulde celler, bakterier, nanopartikler i en væske, eller alt efter hvilket andet objekt, hvis centrum kan bestemmes godt. Denne protokol er brugervenlig og kræver kun viden om cellekultur og mikroskopiteknikker. De forskellige teknikker og informatik værktøjer, der anvendes i denne protokol kan skræmme en ny bruger.Den visuelle demonstration hjælper en til at bruge denne teknik med tillid. Til at begynde, dyrke Jurkat celler, transfect dem med en monomerisk GFP-mærket chemokine receptor vektor, og vælge celler med lave udtryksniveauer af den mærkede vektor, som beskrevet i den medfølgende tekstprotokol. Tilføj medier, der indeholder CXCL12 ligand eller kontrol medier til hver fibronectin-belagt 35-millimeter glas-bund microwell retter, der er blevet belagt med fibronectin, og inkubere i en time ved 37 grader Celsius.Dernæst tilføje sorterede celler til hver skål, og inkubere i 20 minutter før imaging cellerne. Efter inkubation, overføre den første skål af celler til en TIRF mikroskop fase og henvende sig til 100x olie nedsænkning mål. Find og fokuser på cellerne ved hjælp af lysfelt for at minimere fotobleachingseffekter.Skift derefter til TIRF-tilstand, og udfør en justering med fin fokus ved hjælp af lav laserintensitet. Hent film med en længde på ca. 50 sekunder, hvilket minimerer tidsintervallet mellem rammerne. For hver videofil med eksperimentel betingelse skal du oprette en ny mappe efter de rutevejledninger for filstrukturen, der er beskrevet i denne videos tekstprotokol.Åbn videoen med Fiji eller ImageJ ved at trække og slippe filen på Fijis menulinje, og klik på OK for at importere LIF-filen ved hjælp af bioformater. Hvis du vil designe en maske, skal du også importere det tilsvarende billede med flere kanaler. Derefter skal du oprette en maske ved først at oprette et enkelt billede med de kanaler, der er nyttige til designet af masken.Vælg Billede i søjlemenuen, og klik på Farve efterfulgt af Opdel kanaler for at få vist de forskellige kanaler som separate billeder. Flet igen de tre kanaler i et enkelt billede ved at vælge Billede i søjlemenuen, gå til Farve og vælge Flet kanaler. Sørg for at vælge de relevante kanaler, og tryk derefter på OK for at generere et nyt ikke-stablet billede.Synkroniser de to vinduer ved at gå til søjlemenuen, vælge Analysér og derefter gå til Funktioner og vælge Synkroniser Windows. Der vises et nyt vindue med de synkroniserede billedmuligheder. Nu, hvor de to vinduer er synkroniseret, kan det samme område i begge vinduer beskæres.Gå til Billede i søjlemenuen, og vælg Beskær. Med det rektangulære markeringsværktøj skal du tegne interesseområdet. De to beskårne billeder vises individuelt.Dernæst skal du fjerne synkronisering af begge vinduer. Hvis der ikke er oprettet en maske, skal du tegne interesseområdet med markeringsværktøjet og beskæringen. Derefter skal du gemme videoen som en billedsekvens i mappen Videosec.Vælg derefter multikanalbilledet, gå til Plugins i menuen, og vælg Segmenteringseditor for at åbne segmenteditor-plugin'et. Vælg frihåndsmarkeringsværktøjet, og brug det til at vælge en grøn etiket og designe den yderste maske. Når designet, skal du trykke på Plus-knappen i valgindstillingen for sammensat vindue, og den valgte maske vises på fremviseren.Gentag dette trin for alle etiketter. Når alle masker er designet, skal du gemme masken med samme filnavn som videoen med navnet:mask.tif. Åbn MATLAB, og føj uTrack-mappen til stien ved at gå til Angiv kurve og vælge Tilføj med.Skift derefter arbejdsmappen til den mappe, der indeholder den serie, der skal analyseres. Inkl. insymp uTrack ved at skrive Movie Selector GUI i konsollen og trykke på Enter. Dette medfører, at vinduet til valg af film åbnes.Tryk på knappen Ny film, og vent på, at vinduet Film tilføjelse vises. Tryk på Tilføj kanal for at vælge mappen med videoen og udfyld parametrene for filmoplysninger. Indstil outputmappen for resultaterne af uTrack til Resultater, og tryk derefter på Avancerede kanalindstillinger, fyld de parametre, der er relateret til anskaffelsen, og gem.Når du har oprettet filmen, skal du trykke på Fortsæt i filmvalgsvinduet. Her vil uTrack spørge om, hvilken type objekt der skal analyseres. Vælg Enkelte partikler, hvorpanelvinduet vises.Vælg derefter det første trin, trin 1:Registrering, og klik på Indstilling. Vinduet Indstilling af Gaussisk blandingsmodelmontering vises. Angiv indstillingerne som vist her, og tryk derefter på Anvend.Klik på Kør i kontrolpanelet for at køre registreringstrinnet. Efter et par minutter skal du kontrollere resultaterne ved at trykke på knappen Resultat. Filmen viser røde cirkler på de fundne partikler.Hvis der ikke vises en rød cirkel, er dette trin ikke fungeret korrekt, og du skal prøve igen. Nu skal du flette de partikler, der lige blev opdaget i spor, der spænder over flere rammer ved først at konfigurere parametrene som vist her. Tryk derefter på Kør i kontrolpanelet.Udfør derefter Sporanalyse. Definer indstillingerne, som vist her, og tryk derefter på Anvend og kør. Kontroller resultaterne ved først at trykke på knappen Resultat, og klik derefter på Vis spor nummer på vinduet med filmindstillinger, og kontroller, at hvert spor er korrekt identificeret, og marker partikler, der ikke er sande partikler, manuelt.I MATLAB skal du indtaste kommandoen som vist her. Denne kommando vil få programmet til at læse alle de baner og beregne diffusion koefficienter. Udeluk derefter for bane, der svarer til forkert identificerede pletter eller baner, ved at angive en liste over steder, der skal udelades.Beregn de øjeblikkelige diffusionskoefficienter for hvert af sporene i denne celle ved at følge med i den medfølgende tekstprotokol. I dette tilfælde beregnes diffusionskoefficienten for en tidsforskydning lig med 4 kaldet D1 til 4. Når du er færdig, nedbrydes baner i korte og lange baner.Hvis du vil analysere lange baner, skal du skrive kommandoen som vist her for at klassificere bevægelsestypen gennem deres momentskaleringspektrum. Analysere intensiteten af hver partikel langs deres bane. Konfigurer denne grundlæggende funktionsmåde på mange forskellige måder ved at følge med i den medfølgende tekstprotokol.Derefter indsamle diffusion og intensitet oplysninger for alle baner. Saml kun diffusions- og intensitetsoplysningerne for korte baner. Endelig skal du samle øjeblikket spektrum skalering og intensiteten oplysninger ved at skrive følgende, hvor længe er suffikset bruges tidligere.Brugen af de teknikker, der er beskrevet i denne protokol, gør det muligt automatisk at spore partikler, der er påvist i fluorescensmikroskopifilm, og analyse af deres dynamiske egenskaber. Fra denne analyse, kan man opnå forskellige egenskaber baseret på variationer i stimuli. Dette omfatter procentdelen af immobile pletter baseret på fire forskellige stimuli, procentdelen af lange baner på mere end 50 rammer, og de typer af bevægelse langs baner som brudt op af rettet, fri eller begrænset bevægelser.Desuden kan diffusionskoefficienten, de gennemsnitlige punktintensiteter og antallet af receptorer pr. partikel bestemmes. Dette viser fordelingen af de korte diffusionskoefficientværdier for hvert sted som reaktion på forskellige stimuli. Den røde linje repræsenterer medianværdien, denne lignende graf viser de gennemsnitlige staffageintensiteter for hvert sted langs de første 20 billeder som svar på de samme stimuli.Igen repræsenterer den røde linje middelintensitetsværdien. Som et spot gennemsnitlige korrigeret intensitet er relateret til antallet af fluorescerende proteiner til stede på dette sted, kan man direkte beregne antallet af receptorer pr partikel, som vist her. MATLAB er et programmeringssprog, der ikke er til at se ud.Du kan variere variabelnavnene i forhold til dem, der er beskrevet i denne protokol, men sørg for at være konsekvent i navngivningen. Navnene på funktionerne kan ikke ændres, og kommaer, kolon og semikolon er vigtige for en korrekt syntaks. Enkeltmolekylemikroskopi giver mulighed for visualisering af individuelle membranproteiner med hidtil uset spatio-tidsmæssig opløsning og giver unikke muligheder for at afsløre uventede aspekter af cellebiologi.Denne protokoller åbner nye døre for kvantitativ analyse af mikroskopi videoer i celler og molekylærbiologi.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Intravital Microscopy of the Spleen: Quantitative Analysis of Parasite Mobility and Blood Flow

Intravital Mikroskopi af milten: Kvantitativ analyse af Parasite mobilitet og Blood Flow

The advent of intravital microscopy in experimental rodent malaria models has allowed major advances to the knowledge of parasite-host interactions 1,2. ...

Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

Encellede Analyse af Bacillus subtilis Biofilm Brug fluorescensmikroskopi og Flowcytometri

Biofilm formation is a general attribute to almost all bacteria 1-6. When bacteria form biofilms, cells are encased in extracellular matrix that is mostly ...

Antigens Protected Functional Red Blood Cells By The Membrane Grafting Of Compact Hyperbranched Polyglycerols

Antigener Beskyttet Funktionelle røde blodlegemer ved The Membrane podning af Compact hyperforgrenet Polyglyceroler

Red blood cell (RBC) transfusion is vital for the treatment of a number of acute and chronic medical problems such as thalassemia major and sickle cell ...

Fluorescence Microscopy Methods for Determining the Viability of Bacteria in Association with Mammalian Cells

Fluorescensmikroskopi Metoder til bestemmelse af levedygtighed Bakterier i foreningen med pattedvrceller

Central to the field of bacterial pathogenesis is the ability to define if and how microbes survive after exposure to eukaryotic cells. Current protocols ...

Analysis of the Epithelial Damage Produced by Entamoeba histolytica Infection

Analysis of the Epithelial Damage Produced by Entamoeba histolytica Infection

Analyse af epitelbeskadigelse Produceret af<em&gt; Entamoeba histolytica</em&gt; Infektion

Entamoeba histolytica is the causative agent of human amoebiasis, a major cause of diarrhea and hepatic abscess in tropical countries. Infection is ...

Measuring Phagosome pH by Ratiometric Fluorescence Microscopy

Måling fagosom pH ved Ratiometrisk fluorescensmikroskopi

Phagocytosis is a fundamental process through which innate immune cells engulf bacteria, apoptotic cells or other foreign particles in order to kill or ...

Cortical Actin Flow in T Cells Quantified by Spatio-temporal Image Correlation Spectroscopy of Structured Illumination Microscopy Data

Kortikal Actin Flow i T-celler kvantificeret ved Spatio-temporale billede Korrelation spektroskopi af Struktureret Illumination Microscopy data

Filamentous-actin plays a crucial role in a majority of cell processes including motility and, in immune cells, the formation of a key cell-cell ...

Preparation of CD4+ T Cells for Analysis of GD3 and GD2 Ganglioside Membrane Expression by Microscopy

Preparation of CD4+ T Cells for Analysis of GD3 and GD2 Ganglioside Membrane Expression by Microscopy

Fremstilling af CD4<sup&gt; +</sup&gt; T-celler til analyse af GD3 og GD2 gangliosidet Membrane Expression ved mikroskopi

The methods described herein for activation of na&#239;ve CD4+ T cells in suspension and their adherence in coverslips for confocal microscopy analysis ...

Molecular Diffusion in Plasma Membranes of Primary Lymphocytes Measured by Fluorescence Correlation Spectroscopy

Molekylær diffusion i plasma Membraner af primær lymfocytter målt ved fluorescenskorrelationsspektroskopi

Fluorescence correlation spectroscopy (FCS) is a powerful technique for studying the diffusion of molecules within biological membranes with high spatial ...