Name: image processing protocol for the analysis of the diffusion and cluster size of membrane receptors by fluorescence microscopy
Uploaded: 2019-04-09T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Image Processing Protocol for the Analysis of the Diffusion and Cluster Size of Membrane Receptors by Fluorescence Microscopy at JoVE.com

Wij zijn Carlo Manzo en Maria García Parajo dankbaar voor hun hulp en source code van de analyse van de coëfficiënt diffusie. Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door subsidies van het Spaanse ministerie van wetenschap, innovatie en universiteiten (SAF 2017-82940-R) en het RETICS-programma van het Instituto de salud Carlos III (RD12/0009/009 en RD16/0012/0006; RIER). LMM en JV worden ondersteund door het programma van de COMFUTURO van de Fundación generaal CSIC.

1. bereiding van biologische monsters
<ol><li>Groeien Jurkat cellen in RPMI 1640 medium aangevuld met 10% FCS, NaPyr en L-glutamine (volledige RPMI). Electroporate Jurkat cellen (20 x 106 cellen/400 µL van RPMI 1640 met 10% FCS) met een monomeer GFP-gelabelde chemokine receptor vector (CXCR4-AcGFP, 20 μg) dat de detectie met behulp van fluorescentie microscopie. Opmerking: Het is mogelijk om te gebruiken andere monomeer fluorescerende eiwitten zoals mCherry, mScarlet, enz.</li>
	<li>24 ...

<ol>
	<li>Yu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+studies+in+live+cells.">Single-molecule studies in live cells.</a> Annual Review of Pysical Chemistry. 67 (565-585), (2016).</li><li>Mattheyses, A. L., Simon, S. M., Rappoport, J. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+with+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy+for+the+cell+biologist.">Imaging with total internal reflection fluorescence microscopy for the cell biologist.</a> Journal of Cell Science. 123 (Pt 21), 3621-3628 (2010).</li><li>Jaqaman, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+single-particle+tracking+in+live-cell+time-lapse+sequences.">Robust single-particle tracking in live-cell time-lapse sequences.</a> Nature Methods. 5 (8), 695-702 (2008).</li><li>Bakker, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lateral+mobility+of+individual+integrin+nanoclusters+orchestrates+the+onset+for+leukocyte+adhesion.">Lateral mobility of individual integrin nanoclusters orchestrates the onset for leukocyte adhesion.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 109 (13), 4869-4874 (2012).</li><li>Kusumi, A., Sako, Y., Yamamoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confined+lateral+diffusion+of+membrane+receptors+as+studied+by+single+particle+tracking+(nanovid+microscopy).+Effects+of+calcium-induced+differentiation+in+cultured+epithelial+cells.">Confined lateral diffusion of membrane receptors as studied by single particle tracking (nanovid microscopy). Effects of calcium-induced differentiation in cultured epithelial cells.</a> Biophysical Journal. 65 (5), 2021-2040 (1993).</li><li>Ferrari, R. M., Manfroi, A. J., Young, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strongly+and+weakly+self-similar+diffusion.">Strongly and weakly self-similar diffusion.</a> Physica D. 154, 111-137 (2001).</li><li>Sbalzarini, I. F., Koumoutsakos, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feature+point+tracking+and+trajectory+analysis+for+video+imaging+in+cell+biology.">Feature point tracking and trajectory analysis for video imaging in cell biology.</a> Journal of Structural Biology. 151 (2), 182-195 (2005).</li><li>Ewers, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-particle+tracking+of+murine+polyoma+virus-like+particles+on+live+cells+and+artificial+membranes.">Single-particle tracking of murine polyoma virus-like particles on live cells and artificial membranes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 102 (42), 15110-15115 (2005).</li><li>Manzo, C., Garcia-Parajo, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+progress+in+single+particle+tracking:+from+methods+to+biophysical+insights.">A review of progress in single particle tracking: from methods to biophysical insights.</a> Report on Progress in Physics. 78 (12), 124601 (2015).</li><li>Calebiro, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+analysis+of+fluorescently+labeled+G-protein-coupled+receptors+reveals+complexes+with+distinct+dynamics+and+organization.">Single-molecule analysis of fluorescently labeled G-protein-coupled receptors reveals complexes with distinct dynamics and organization.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 110 (2), 743-748 (2013).</li><li>Digman, M. A., Dalal, R., Horwitz, A. F., Gratton, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+the+number+of+molecules+and+brightness+in+the+laser+scanning+microscope.">Mapping the number of molecules and brightness in the laser scanning microscope.</a> Biophysical Journal. 94 (6), 2320-2332 (2008).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Martinez-Munoz, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separating+Actin-Dependent+Chemokine+Receptor+Nanoclustering+from+Dimerization+Indicates+a+Role+for+Clustering+in+CXCR4+Signaling+and+Function.">Separating Actin-Dependent Chemokine Receptor Nanoclustering from Dimerization Indicates a Role for Clustering in CXCR4 Signaling and Function.</a> Molecular Cell. 70 (1), 106-119 (2018).</li><li>Destainville, N., Salome, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+and+correction+of+systematic+errors+due+to+detector+time-averaging+in+single-molecule+tracking+experiments.">Quantification and correction of systematic errors due to detector time-averaging in single-molecule tracking experiments.</a> Biophysical Journal. 90 (2), L17-L19 (2006).</li></ol>

De beschreven methode is gemakkelijk uit te voeren zelfs zonder enige eerdere ervaring werken met Matlab. Matlab routines echter uiterst nauwkeurigheid met de nomenclatuur van de verschillende opdrachten en de lokalisatie van de verschillende mappen in dienst van het programma. In de tracking routine analyse (stap 3), meerdere parameters kunnen worden gewijzigd. Het venster van "Instelling Gaussiaans-mengsel Model betaamt" (stap 3.8) bepaalt hoe U-track detecteert enkele deeltjes op de video. Dit wordt gedaan door het aa...

Membraaneiwitten ingebed in de lipide dubbelgelaagde zijn in continue beweging als gevolg van thermische diffusie. Hun dynamiek zijn essentieel voor het reguleren van de antwoorden van de cel, zoals Intermoleculaire interacties toestaan vorming van complexen die variëren in grootte van monomeren tot oligomeren en invloed hebben op de stabiliteit van complexen signalering. Het ophelderen van de mechanismen beheersen eiwit dynamiek is dus een nieuwe uitdaging in de celbiologie, vereist voor het begrijpen van signaaltransductie trajecten en omgaan met onverwachte cel.
Sommige optische methodes ontwikkeld om te studeren van deze interacties in levende cellen1. Daaronder staat de totale interne reflectie (TIRF) fluorescentie microscopie, ontwikkeld in de vroege jaren 1980, de studie van moleculaire interacties op of vlakbij de celmembraan2. Studeren dynamische parameters membraan eiwit gevaar opleverende verkregen TIRF gegevens in levende cellen, is een enkel deeltje tracking methode (SPT) vereist. Hoewel verschillende algoritmen beschikbaar voor dit zijn, wij gebruiken momenteel die zijn gepubliceerd door Jaqaman et al.3 , die betrekking hebben op particle beweging heterogeniteit in een dichte deeltje veld door deeltjes tussen opeenvolgende frames om verbinding te maken met de resulterende track te koppelen segmenten in volledige trajecten (tijdelijke deeltje verdwijnen). De software vangt het deeltje samenvoegen en splitsen van dat resultaat van aggregatie en dissociatie gebeurtenissen3. Één van de uitvoergegevens van deze software is de detectie van de deeltjes langs het hele traject door hun X- en Y-posities in elk frame te definiëren.
Zodra de deeltjes worden geconstateerd, passen we verschillende algoritmen om te bepalen van de korte tijdsverschil diffusie coëfficiënt (D1-4)4,5. Door het Moment schalen Spectrum (MSS)6,7,8 analyse toe te passen of door het aanbrengen van de 'alpha'-waarde door aanpassing van de verplaatsing (MSD) van de gemiddelde plein aan de kromme9, indelen we ook de deeltjes volgens het type traject.
Analyse van plek intensiteit in fluorescentie beelden is een gedeelde doelstelling voor wetenschappers in het veld10,11. De meest voorkomende algoritme is het zogenaamde aantal en helderheid. Deze methode toch staat geen detectie van de juiste frame-voor-frame intensiteit in deeltjes in de mobiele Fractie. We hebben dus een nieuw algoritme te evalueren deze deeltje intensiteiten frame-voor-frame en te bepalen wat de status van hun aggregatie gegenereerd. Zodra de coördinaten van elk deeltje worden gedetecteerd met behulp van U-Track2 software3, definiëren we de intensiteit in elk frame over het volledige traject, ook rekening houdend met de celachtergrond in elk frame. Deze software biedt verschillende mogelijkheden om te bepalen van de intensiteit van de plek en de achtergrond van de cel en berekent op basis van bekende monomeer en dimeric eiwitten als verwijzingen, het geschatte aantal eiwitten in het deeltje ontdekt (clustergrootte).
In dit artikel beschrijven we een zorgvuldige gids voor het uitvoeren van deze drie stappen: 1) opsporen en volgen enkele deeltjes langs een video van fluorescentie microscopie met behulp van U-track; 2) analyseren de momentane diffusie coëfficiënt (D1-4) van die deeltjes en het soort verkeer (beperkt, vrije of gerichte) van deeltjes met lange trajecten door MSS begint; 3) het meten van de plek intensiteit langs de video gecorrigeerd door de fluorescentie van de geschatte achtergrond voor elke vlek. Hierdoor cluster grootte schatting en identificatie van de photobleaching stappen.
Het gebruik van dit protocol niet vereist gespecialiseerde vaardigheden en kan worden uitgevoerd in een laboratorium met celcultuur, stroom cytometry en microscopie faciliteiten. Het protocol gebruikt ImageJ of Fiji (een verdeling van ImageJ12), U-track3en enkele ad hoc gemaakt routines (http://i2pc.es/coss/Programs/protocolScripts.zip). U-track en ad hoc routines overreden Matlab die kan worden geïnstalleerd in elke compatibele computer.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:797px;" width="797">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">Human Jurkat cells</td>
			<td style="width:203px;">ATCC</td>
			<td style="width:203px;">CRL-10915</td>
			<td style="width:171px;">Human T cell line. Any other cell type can be analyzed with this software</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:221px;">pAcGFPm-N1 (PT3719-5)DNA3GFP</td>
			<td style="width:203px;">Clontech</td>
			<td style="width:203px;">632469</td>
			<td>Different fluorescent proteins can be followed and analyzed with this routine</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:221px;">Gene Pulse X Cell electroporator&#160;</td>
			<td>BioRad&#160;</td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td>We use 280V, 975 mF, for Jurkat cells.&#160; Use the transfection method best working in your hands.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cytomics FC 500 flow cytometer&#160;</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MoFlo Astrios Cell Sorter&#160;</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td>Depending on the level of transfection, cell sorting may not be required.&#160; You can also employ cells with stable expression of adequate levels of the receptor of interest.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">Dako Qifikit</td>
			<td style="width:203px;">DakoCytomation</td>
			<td style="width:203px;">K0078</td>
			<td>Used for quantification the number of receptors in the cell surface.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">Glass bottom microwell dishes</td>
			<td style="width:203px;">MatTek corporation</td>
			<td style="width:203px;">P35G-1.5-10-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:221px;">Human Fibronectin from plasma</td>
			<td style="width:203px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:203px;">F0895</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">Recombinant human CXCL12</td>
			<td style="width:203px;">PeproTech</td>
			<td style="width:203px;">300928A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">Inverted Leica AM TIRF</td>
			<td style="width:203px;">Leica</td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">EM-CCD camera</td>
			<td style="width:203px;">Andor&#160;</td>
			<td style="width:203px;">DU 885-CSO-#10-VP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">MATLAB</td>
			<td style="width:203px;">The MathWorks, Natick, MA</td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">U-Track2 software</td>
			<td style="width:203px;">Danuser Laboratory</td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">ImageJ</td>
			<td style="width:203px;">NIH</td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td>https://imagej.nih.gov/ij/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">FiJi</td>
			<td style="width:203px;">FiJI</td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td>https://imagej.net/Fiji)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">u-Track2 software</td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td>Matlab tool.&#160; For installing, download .zip file from the web page (http://lccb.hms.harvard.edu/software.html) and uncompress the file in a directory of your choice</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">GraphPad Prism</td>
			<td style="width:203px;">GraphPad software</td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

image processing protocol for the analysis of the diffusion and cluster size of membrane receptors by fluorescence microscopy

Deeltje bijhouden op een videofragment en de achterste analyse van hun trajecten is tegenwoordig een gemeenschappelijke operatie in veel biologische studies. Met behulp van de analyse van de celmembraan receptor clusters als een model, presenteren we een gedetailleerd protocol voor deze afbeelding analyse taak met behulp van Fiji (ImageJ) en Matlab routines voor: 1) definiëren gebieden van belang en ontwerpen van maskers aangepast aan deze regio's; 2) bijhouden van de deeltjes in de fluorescentie microscopie video's; 3) analyseren de kenmerken van de verspreiding en de intensiteit van geselecteerde tracks. De kwantitatieve analyse van de coëfficiënten van de verspreiding, de soorten bewegingen en een clustergrootte verkregen door fluorescentie microscopie en beeldverwerking biedt een waardevol hulpmiddel om objectief vast deeltje dynamiek en de gevolgen van het wijzigen milieu-omstandigheden. In dit artikel presenteren we gedetailleerde protocollen voor de analyse van deze functies. De beschreven methode hier kunt niet alleen single-molecuul tracking detectie, maar ook automatiseert de schatting van de parameters voor de laterale verspreiding op het celmembraan, classificeert het type traject en het volledige analyse dus overwinnen stelt de problemen in het kwantificeren van de grootte van de plek over zijn gehele traject op de celmembraan.

Het gebruik van dit protocol maakt het geautomatiseerde volgen van deeltjes ontdekt in fluorescentie microscopie films en de analyse van hun dynamische kenmerken. In eerste instantie zijn cellen transfected met de fluorescently-coupled eiwit worden bijgehouden. Het passende niveau van receptoren presenteert op het celoppervlak waarmee dat SPT wordt verkregen door de cel sorteren (Figuur 1). Geselecteerde cellen worden geanalyseerd door TIRF microscopie die vi...

Watch this Scientific Journal Video about Image Processing Protocol for the Analysis of the Diffusion and Cluster Size of Membrane Receptors by Fluorescence Microscopy at JoVE.com

Image Processing Protocol for the Analysis of the Diffusion and Cluster Size of Membrane Receptors by Fluorescence Microscopy

Beeldverwerking Protocol voor de analyse van de verspreiding en de clustergrootte van membraan receptoren door fluorescentie microscopie

Hier presenteren we een protocol voor één deeltje beeldanalyse waarmee kwantitatieve evaluatie van diffusie coëfficiënten, soorten van beweging en cluster grootte van enkele deeltjes ontdekt door fluorescentie microscopie bijhouden.

Particle tracking on a video sequence and the posterior analysis of their trajectories is nowadays a common operation in many biological studies. Using ...

Nieuwe microscopietechnieken vereisen de ontwikkeling van adequate instrumenten voor het juiste begrip van de onderzochte biologische processen. Dit protocol beschrijft de beeldverwerkingsstappen die nodig zijn voor het bijhouden van één molecuul, inclusief schatting van laterale diffusieparameters en kwantificering van de spotgrootte over de gehele baan bij het celmembraan. Dit protocol combineert het gebruik van verschillende softwarestukken, waaronder ImageJ, MATLAB en uTrack, evenals enkele eiwitten die speciaal voor dit protocol zijn ontwikkeld.Deze methode wordt geïllustreerd met het volgen van membraanreceptoren onder lichtmicroscopie, maar het kan worden toegepast op elke deeltjesachtige structuur waarvan de trajecten in de loop van de tijd in een videosequentie kunnen worden gevolgd. Deze techniek heeft betrekking op fundamenteel onderzoek en heeft geen directe toepassing in een klinische setting. Het kan echter worden gebruikt om te helpen bij de karakterisering van biologische gebeurtenissen bij zowel verschillende ziekten als dus bij de identificatie van nieuwe therapeutische doelen.Dit protocol is relevant voor het volgen van deeltjes in cellulaire membranen, zoals getoond in deze video, maar het kan ook worden toegepast voor het volgen van volledige cellen, bacteriën, nanodeeltjes in een vloeistof, of welk ander object waarvan het centrum goed kan worden bepaald. Dit protocol is gebruiksvriendelijk en vereist alleen kennis van celcultuur en microscopietechnieken. De verschillende technieken en informatica tools die worden gebruikt in dit protocol kan intimideren een nieuwe gebruiker.De visuele demonstratie helpt om deze techniek met vertrouwen te gebruiken. Om te beginnen groeien Jurkat cellen, transfect ze met een monomerische GFP-gelabelde chemokine receptor vector, en selecteer cellen met lage expressieniveaus van de gelabelde vector, zoals beschreven in de bijbehorende tekst protocol. Voeg media met de CXCL12 ligand of controlemedia toe aan elke met fibronectine gecoate microwell met glazen bodem die zijn bekleed met fibronectine en een uur lang uitbroeden bij 37 graden Celsius.Voeg vervolgens gesorteerde cellen toe aan elk gerecht en broed gedurende 20 minuten voordat de cellen worden weergegeven. Na incubatie breng je de eerste schotel van cellen over naar een TIRF-microscoopstadium en ga je naar de 100x olieonderdompelingsdoelstelling. Zoek en concentreer u op de cellen met behulp van helder veld om fotobleaching effecten te minimaliseren.Schakel vervolgens over naar de TIRF-modus en voer een fijne scherpstelling uit met een lage laserintensiteit. Verwerf films van ongeveer 50 seconden lang, waardoor het tijdsinterval tussen frames wordt geminimaliseerd. Maak voor elk videobestand met experimentele conditie een nieuwe map volgens de routebeschrijvingen van de bestandsstructuur die in het tekstprotocol van deze video worden beschreven.Open de video met Fiji of ImageJ door het bestand op de menubalk van Fiji te slepen en te laten vallen en klik op OK om het LIF-bestand te importeren met behulp van bioformaten. Als u een masker wilt ontwerpen, importeert u ook de bijbehorende afbeelding met meerdere kanalen. Maak vervolgens een masker door eerst één afbeelding te maken met de kanalen die handig zijn voor het ontwerp van het masker.Selecteer Afbeelding in het balkmenu en klik op Kleur gevolgd door Gesplitste kanalen om de verschillende kanalen als afzonderlijke afbeeldingen weer te geven. Voeg de drie kanalen opnieuw in één afbeelding samen door Afbeelding in het balkmenu te selecteren, naar Kleur te gaan en Kanalen samenvoegen te selecteren. Zorg ervoor dat u de juiste kanalen selecteert en druk op OK om een nieuwe niet-gestapelde afbeelding te genereren.Synchroniseer de twee vensters door naar het balkmenu te gaan, Analyseren te selecteren en vervolgens naar Extra te gaan en Windows synchroniseren te selecteren. Er wordt een nieuw venster met de gesynchroniseerde beeldmogelijkheden weergegeven. Nu, met de twee vensters gesynchroniseerd, kan hetzelfde gebied in beide vensters worden bijgesneden.Ga naar Afbeelding in het balkmenu en selecteer Bijsnijden. Teken met het rechthoekige selectiegereedschap het interessegebied. De twee bijgesneden afbeeldingen worden afzonderlijk weergegeven.Vervolgens kunnen beide vensters worden ongesynchroniseerd. Als er geen masker is gemaakt, tekent u het interessegebied met het selectiegereedschap en bijsnijden. Sla de video daarna op als een beeldreeks in de map Videosec.Selecteer vervolgens de afbeelding met meerdere kanalen, ga naar Plug-ins in het menu en selecteer Segmentatieeditor om de plug-in voor segmentatieeditor te openen. Kies het gereedschap keuze uit de vrije hand en gebruik het om een groen label te selecteren en het buitenste masker te ontwerpen. Druk na het ontwerp op de Plus-knop in de selectieoptie van samengesteld venster en wordt het geselecteerde masker weergegeven op de viewer.Herhaal deze stap voor alle labels. Zodra alle maskers zijn ontworpen, slaat u het masker op met dezelfde bestandsnaam als de video, met de naam:masker.tif. Open MATLAB en voeg de uTrack-map toe aan het pad door pad instellen te gaan en selecteer Toevoegen met.Wijzig vervolgens de werkmap in de map met de reeks die moet worden geanalyseerd. Roep uTrack aan door Movie Selector GUI in de console te typen en op Enter te drukken. Hierdoor wordt het venster voor filmselectie geopend.Druk op de knop Nieuwe film en wacht tot het venster Filmtoevoever wordt weergegeven. Druk op Kanaal toevoegen om de map met de video te kiezen en vul de filminformatieparameters in. Stel de uitvoermap voor de resultaten van uTrack in op Resultaten en druk vervolgens op de geavanceerde kanaalinstellingen, vul de parameters met betrekking tot de acquisitie en sla deze op.Nadat u de film hebt gemaakt, drukt u op Doorgaan in het venster voor filmselectie. Hier vraagt uTrack naar het type object dat moet worden geanalyseerd. Kies Enkele deeltjes en vervolgens verschijnt het venster van het configuratiescherm.Selecteer vervolgens de eerste stap, Stap 1:Detectie, en klik op Instellen. Het venster Instelling Gaussian Mixture Model Fitting verschijnt. Voer de instellingen in zoals hier wordt weergegeven en druk op Toepassen.Klik in het configuratiescherm op Uitvoeren om de detectiestap uit te voeren. Controleer na enkele minuten de resultaten door op de knop Resultaat te drukken. De film toont rode cirkels op de gedetecteerde deeltjes.Als er geen rode cirkel wordt weergegeven, dan heeft deze stap niet correct gewerkt en moet u het opnieuw proberen. Voeg nu de deeltjes die net zijn gedetecteerd samen in tracks die meerdere frames omvatten door eerst de parameters in te stellen zoals hier wordt weergegeven. Druk vervolgens op Uitvoeren in het bedieningspaneel.Voer vervolgens Track Analysis uit. Definieer de instellingen, zoals hier wordt weergegeven, en druk op Toepassen en Uitvoeren. Controleer de resultaten door eerst op de knop Resultaat te drukken en klik vervolgens op Track Number van het venster Filmopties weergeven en controleer frame-voor-frame dat elk spoor correct is geïdentificeerd, waardoor deeltjes die geen echte deeltjes zijn handmatig markeren.Voer in MATLAB de opdracht in zoals hier wordt weergegeven. Deze opdracht zorgt ervoor dat het programma alle trajecten leest en de diffusiecoëfficiënten berekent. Sluit vervolgens trajecten uit die overeenkomen met onjuist geïdentificeerde vlekken of trajecten door de lijst met plekken uit te sluiten.Bereken de momentane diffusiecoëfficiënten voor elk van de sporen van deze cel door mee te volgen in het bijbehorende tekstprotocol. Bereken in dit geval de diffusiecoëfficiënt voor een vertraging gelijk aan 4 d1 tot en met 4. Wanneer u klaar bent, ontbindt u de trajecten in korte en lange trajecten.Als u lange trajecten wilt analyseren, typt u de opdracht zoals hier wordt weergegeven om het type beweging door hun momentschalingspectrum te classificeren. Analyseer de intensiteit van elk deeltje langs hun baan. Configureer dit basisgedrag op veel verschillende manieren door mee te volgen in het bijbehorende tekstprotocol.Verzamel vervolgens de diffusie- en intensiteitsinformatie voor alle trajecten. Verzamel alleen de diffusie- en intensiteitsinformatie voor korte trajecten. Ten slotte, verzamelen van het moment spectrum schalen en de intensiteit informatie door het typen van de volgende, waar lang is het achtervoegsel eerder gebruikt.Het gebruik van de technieken beschreven in dit protocol zorgt voor het geautomatiseerd volgen van deeltjes gedetecteerd in fluorescentie microscopie films en de analyse van hun dynamische kenmerken. Uit deze analyse kan men verschillende kenmerken verkrijgen op basis van variaties in stimuli. Dit omvat het percentage onbeweeglijke vlekken op basis van vier verschillende stimuli, het percentage lange trajecten van meer dan 50 frames en de soorten bewegingen langs de trajecten zoals opgesplitst door gerichte, vrije of beperkte bewegingen.Bovendien kunnen de diffusiecoëfficiënt, gemiddelde steunintensiteiten en het aantal receptoren per deeltje worden bepaald. Dit toont de verdeling van de korte diffusiecoëfficiënt waarden voor elke plek in reactie op verschillende stimuli. De rode lijn vertegenwoordigt de mediaan waarde, deze vergelijkbare grafiek toont de gemiddelde spot intensiteiten voor elke plek langs de eerste 20 frames in reactie op dezelfde stimuli.Nogmaals, de rode lijn vertegenwoordigt de gemiddelde intensiteitswaarde. Omdat de gemiddelde gecorrigeerde intensiteit van een spot gerelateerd is aan het aantal fluorescerende eiwitten dat op deze plek aanwezig is, kan men direct het aantal receptoren per deeltje berekenen, zoals hier wordt weergegeven. MATLAB is een casegevoelige programmeertaal.U de variabele namen variëren met betrekking tot de namen die in dit protocol worden beschreven, maar zorg ervoor dat u consistent bent in uw naamgeving. De namen van de functies kunnen niet worden gewijzigd en komma's, dubbele punten en puntkomma's zijn belangrijk voor een juiste syntaxis. Single-molecule microscopie zorgt voor de visualisatie van individuele membraaneiwitten met een ongekende spatio-temporele resolutie en biedt unieke mogelijkheden om onverwachte aspecten van celbiologie te onthullen.Deze protocollen openen nieuwe deuren voor de kwantitatieve analyse van microscopievideo's in cellen en moleculaire biologie.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Intravital Microscopy of the Spleen: Quantitative Analysis of Parasite Mobility and Blood Flow

Intravitale Microscopie van de milt: Kwantitatieve Analyse van Parasite Mobiliteit en Blood Flow

The advent of intravital microscopy in experimental rodent malaria models has allowed major advances to the knowledge of parasite-host interactions 1,2. ...

Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

Single-cell analyse van Bacillus subtilis Biofilms met fluorescentie microscopie en Flow cytometrie

Biofilm formation is a general attribute to almost all bacteria 1-6. When bacteria form biofilms, cells are encased in extracellular matrix that is mostly ...

Antigens Protected Functional Red Blood Cells By The Membrane Grafting Of Compact Hyperbranched Polyglycerols

Antigenen functionele rode bloedcellen die beschermd worden door de membraan enten van Compact Hypervertakte Polyglycerolen

Red blood cell (RBC) transfusion is vital for the treatment of a number of acute and chronic medical problems such as thalassemia major and sickle cell ...

Fluorescence Microscopy Methods for Determining the Viability of Bacteria in Association with Mammalian Cells

Fluorescentiemicroscopiemethodes voor het bepalen van de levensvatbaarheid van bacteriën in Associatie met zoogdiercellen

Central to the field of bacterial pathogenesis is the ability to define if and how microbes survive after exposure to eukaryotic cells. Current protocols ...

Analysis of the Epithelial Damage Produced by Entamoeba histolytica Infection

Analysis of the Epithelial Damage Produced by Entamoeba histolytica Infection

Analyse van de epitheelbeschadiging Geproduceerd door<em&gt; Entamoeba histolytica</em&gt; Infectie

Entamoeba histolytica is the causative agent of human amoebiasis, a major cause of diarrhea and hepatic abscess in tropical countries. Infection is ...

Measuring Phagosome pH by Ratiometric Fluorescence Microscopy

Meten phagosome pH door Ratiometrische fluorescentie microscopie

Phagocytosis is a fundamental process through which innate immune cells engulf bacteria, apoptotic cells or other foreign particles in order to kill or ...

Cortical Actin Flow in T Cells Quantified by Spatio-temporal Image Correlation Spectroscopy of Structured Illumination Microscopy Data

Corticale actine Flow in T-cellen gekwantificeerd door ruimte en tijd Afbeelding Correlatie Spectroscopie van Structured Verlichting Microscopie Gegevens

Filamentous-actin plays a crucial role in a majority of cell processes including motility and, in immune cells, the formation of a key cell-cell ...

Preparation of CD4+ T Cells for Analysis of GD3 and GD2 Ganglioside Membrane Expression by Microscopy

Preparation of CD4+ T Cells for Analysis of GD3 and GD2 Ganglioside Membrane Expression by Microscopy

Bereiding van CD4<sup&gt; +</sup&gt; T cellen voor analyse van GD3 ganglioside GD2 en Membraanexpressie door Microscopie

The methods described herein for activation of na&#239;ve CD4+ T cells in suspension and their adherence in coverslips for confocal microscopy analysis ...

Molecular Diffusion in Plasma Membranes of Primary Lymphocytes Measured by Fluorescence Correlation Spectroscopy

Moleculaire Diffusion in de plasmamembraan van Primary lymfocyten gemeten met behulp van fluorescentie Correlatie Spectroscopie

Fluorescence correlation spectroscopy (FCS) is a powerful technique for studying the diffusion of molecules within biological membranes with high spatial ...