Name: image processing protocol for the analysis of the diffusion and cluster size of membrane receptors by fluorescence microscopy
Uploaded: 2019-04-09T14:30:00
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Nous sommes reconnaissants à Carlo Manzo et Maria García Parajo pour leur aide et le code source de l’analyse de coefficient de diffusion. Ce travail a été soutenu en partie par des subventions du ministère espagnol de la Science, l’Innovation et des universités (SAF 2017-82940-R) et le programme RETICS de l’Instituto de salud Carlos III (RD12/0009/009 et RD16/0012/0006 ; RIER). LMM et JV sont pris en charge par le programme COMFUTURO de la Fundación General CSIC.

1. préparation des échantillons biologiques
<ol><li>La croissance de cellules Jurkat dans RPMI 1640 additionné de 10 % FCS, NaPyr et L-glutamine (RPMI complet). Cellules Electroporate Jurkat (20 x 106 cellules/400 µL de milieu RPMI 1640 avec 10 % FCS) avec un vecteur de récepteurs monomères chemokine GFP-étiqueté (CXCR4-AcGFP, 20 μg) afin de permettre sa détection à l’aide de la microscopie de fluorescence. Remarque : Il est possible d’utiliser d’autres protéines fluore...

<ol>
	<li>Yu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+studies+in+live+cells.">Single-molecule studies in live cells.</a> Annual Review of Pysical Chemistry. 67 (565-585), (2016).</li><li>Mattheyses, A. L., Simon, S. M., Rappoport, J. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+with+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy+for+the+cell+biologist.">Imaging with total internal reflection fluorescence microscopy for the cell biologist.</a> Journal of Cell Science. 123 (Pt 21), 3621-3628 (2010).</li><li>Jaqaman, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+single-particle+tracking+in+live-cell+time-lapse+sequences.">Robust single-particle tracking in live-cell time-lapse sequences.</a> Nature Methods. 5 (8), 695-702 (2008).</li><li>Bakker, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lateral+mobility+of+individual+integrin+nanoclusters+orchestrates+the+onset+for+leukocyte+adhesion.">Lateral mobility of individual integrin nanoclusters orchestrates the onset for leukocyte adhesion.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 109 (13), 4869-4874 (2012).</li><li>Kusumi, A., Sako, Y., Yamamoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confined+lateral+diffusion+of+membrane+receptors+as+studied+by+single+particle+tracking+(nanovid+microscopy).+Effects+of+calcium-induced+differentiation+in+cultured+epithelial+cells.">Confined lateral diffusion of membrane receptors as studied by single particle tracking (nanovid microscopy). Effects of calcium-induced differentiation in cultured epithelial cells.</a> Biophysical Journal. 65 (5), 2021-2040 (1993).</li><li>Ferrari, R. M., Manfroi, A. J., Young, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strongly+and+weakly+self-similar+diffusion.">Strongly and weakly self-similar diffusion.</a> Physica D. 154, 111-137 (2001).</li><li>Sbalzarini, I. F., Koumoutsakos, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feature+point+tracking+and+trajectory+analysis+for+video+imaging+in+cell+biology.">Feature point tracking and trajectory analysis for video imaging in cell biology.</a> Journal of Structural Biology. 151 (2), 182-195 (2005).</li><li>Ewers, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-particle+tracking+of+murine+polyoma+virus-like+particles+on+live+cells+and+artificial+membranes.">Single-particle tracking of murine polyoma virus-like particles on live cells and artificial membranes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 102 (42), 15110-15115 (2005).</li><li>Manzo, C., Garcia-Parajo, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+progress+in+single+particle+tracking:+from+methods+to+biophysical+insights.">A review of progress in single particle tracking: from methods to biophysical insights.</a> Report on Progress in Physics. 78 (12), 124601 (2015).</li><li>Calebiro, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+analysis+of+fluorescently+labeled+G-protein-coupled+receptors+reveals+complexes+with+distinct+dynamics+and+organization.">Single-molecule analysis of fluorescently labeled G-protein-coupled receptors reveals complexes with distinct dynamics and organization.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 110 (2), 743-748 (2013).</li><li>Digman, M. A., Dalal, R., Horwitz, A. F., Gratton, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+the+number+of+molecules+and+brightness+in+the+laser+scanning+microscope.">Mapping the number of molecules and brightness in the laser scanning microscope.</a> Biophysical Journal. 94 (6), 2320-2332 (2008).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Martinez-Munoz, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separating+Actin-Dependent+Chemokine+Receptor+Nanoclustering+from+Dimerization+Indicates+a+Role+for+Clustering+in+CXCR4+Signaling+and+Function.">Separating Actin-Dependent Chemokine Receptor Nanoclustering from Dimerization Indicates a Role for Clustering in CXCR4 Signaling and Function.</a> Molecular Cell. 70 (1), 106-119 (2018).</li><li>Destainville, N., Salome, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+and+correction+of+systematic+errors+due+to+detector+time-averaging+in+single-molecule+tracking+experiments.">Quantification and correction of systematic errors due to detector time-averaging in single-molecule tracking experiments.</a> Biophysical Journal. 90 (2), L17-L19 (2006).</li></ol>

La méthode décrite est facile à réaliser, même sans avoir aucune expérience antérieure de travail avec Matlab. Toutefois, les routines Matlab exigent extrêmement précision avec la nomenclature des différentes commandes et la localisation des différents dossiers utilisés par le programme. Dans le suivi routine d’analyse (étape 3), plusieurs paramètres peuvent être modifiés. La fenêtre « Réglage mélange gaussien modèle convenable » (étape 3,8) contrôle comment U-track permet de détecter des par...

Protéines de la membrane intégrées dans la bicouche lipidique sont en mouvement continu en raison de la diffusion thermique. Leur dynamique est essentielle pour réguler les réactions de cellules, comme les interactions intermoléculaires permettent la formation de complexes qui varient en taille de monomères d’oligomères et influencent la stabilité des complexes de signalisation. Élucider les mécanismes qui contrôlent la dynamique des protéines est donc un nouveau défi en biologie cellulaire, nécessaire pour comprendre les voies de transduction de signal et d’identifier les fonctions des cellules imprévus.
Certaines méthodes optiques ont été développées pour étudier ces interactions dans la vie des cellules1. Parmi ceux-ci, microscopie à fluorescence (FRBR) réflexion totale interne, mis au point dans les années 1980, permet l’étude des interactions moléculaires à ou très près de la membrane de la cellule2. Afin d’étudier les paramètres dynamiques des trajectoires de protéine de membrane FRBR données dans les cellules vivantes, il faut une seule particule suivi méthode (SPT). Bien que plusieurs algorithmes sont disponibles pour cela, nous utilisons actuellement celles publiées par Jaqaman et al.3 qui abordent l’hétérogénéité de mouvement de particules dans un champ de particules denses en liant les particules entre images consécutives pour relier la piste qui en résulte segments en trajectoires complets (disparition temporaire de particules). Le logiciel capture la particule qui résulte de l’agrégation et la dissociation des événements3de fractionnement et fusion. Parmi les données de sortie de ce logiciel est détection des particules le long de la trajectoire toute en définissant leurs positions X et Y dans chaque image.
Une fois que les particules sont détectés, nous appliquons différents algorithmes pour déterminer le décalage court diffusion coefficient (D1-4)4,5. En appliquant l’analyse du spectre de mise à l’échelle de Moment (MSS)6,7,8 , ou en ajustant la valeur « alpha » par un ajustement de la déplacement quadratique moyenne (TMS) à la courbe9, nous avons également classer les particules selon le type de trajectoire.
Analyse d’intensité spot en images de fluorescence est un objectif commun pour les scientifiques dans le domaine10,11. L’algorithme couramment utilisé est la soi-disant numéro et la luminosité. Cette méthode néanmoins ne permet pas bonne intensité d’image par image détection de particules dans la fraction mobile. Nous avons, par conséquent, généré un nouvel algorithme d’évaluer ces particules intensités image par image et de déterminer leur état d’agrégation. Une fois que les coordonnées de chaque particule sont détectées à l’aide de logiciel U-Track23, nous définissons son intensité dans chaque image sur la trajectoire complète, compte tenu également de l’arrière-plan de la cellule dans chaque image. Ce logiciel offre différentes possibilités afin de déterminer l’intensité du spot et l’arrière-plan de la cellule et, à l’aide de protéines monomériques et dimériques connues comme références, calcule le nombre approximatif des protéines dans la particule détectés (taille de cluster).
Dans cet article, nous décrivons un guide attentif pour effectuer ces trois étapes : 1) détecter et suivre des particules seul le long d’une vidéo de microscopie de fluorescence à l’aide de rail-U ; 2) analysant le coefficient de diffusion instantanée (D1-4) de ces particules et le type de mouvement (clos, libre ou dirigée) des particules avec longues trajectoires par MSS ; 3) mesure de l’intensité de tache le long de la vidéo corrigée par la fluorescence de fond estimée pour chaque tache. Cela permet l’estimation de taille de cluster et l’identification des étapes Photoblanchiment.
L’utilisation du présent protocole ne nécessite pas de compétences spécialisées et peut être effectuée dans n’importe quel laboratoire de culture cellulaire, flow cytometry et microscopie des installations. Le protocole utilise ImageJ ou Fidji (une distribution de ImageJ12), U-piste3et des routines de hoc fait ad (http://i2pc.es/coss/Programs/protocolScripts.zip). U-track et ad hoc routines écrasé de Matlab qui peut être installé dans n’importe quel ordinateur compatible.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:797px;" width="797">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">Human Jurkat cells</td>
			<td style="width:203px;">ATCC</td>
			<td style="width:203px;">CRL-10915</td>
			<td style="width:171px;">Human T cell line. Any other cell type can be analyzed with this software</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:221px;">pAcGFPm-N1 (PT3719-5)DNA3GFP</td>
			<td style="width:203px;">Clontech</td>
			<td style="width:203px;">632469</td>
			<td>Different fluorescent proteins can be followed and analyzed with this routine</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:221px;">Gene Pulse X Cell electroporator&#160;</td>
			<td>BioRad&#160;</td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td>We use 280V, 975 mF, for Jurkat cells.&#160; Use the transfection method best working in your hands.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cytomics FC 500 flow cytometer&#160;</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MoFlo Astrios Cell Sorter&#160;</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td>Depending on the level of transfection, cell sorting may not be required.&#160; You can also employ cells with stable expression of adequate levels of the receptor of interest.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">Dako Qifikit</td>
			<td style="width:203px;">DakoCytomation</td>
			<td style="width:203px;">K0078</td>
			<td>Used for quantification the number of receptors in the cell surface.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">Glass bottom microwell dishes</td>
			<td style="width:203px;">MatTek corporation</td>
			<td style="width:203px;">P35G-1.5-10-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:221px;">Human Fibronectin from plasma</td>
			<td style="width:203px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:203px;">F0895</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">Recombinant human CXCL12</td>
			<td style="width:203px;">PeproTech</td>
			<td style="width:203px;">300928A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">Inverted Leica AM TIRF</td>
			<td style="width:203px;">Leica</td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">EM-CCD camera</td>
			<td style="width:203px;">Andor&#160;</td>
			<td style="width:203px;">DU 885-CSO-#10-VP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">MATLAB</td>
			<td style="width:203px;">The MathWorks, Natick, MA</td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">U-Track2 software</td>
			<td style="width:203px;">Danuser Laboratory</td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">ImageJ</td>
			<td style="width:203px;">NIH</td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td>https://imagej.nih.gov/ij/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">FiJi</td>
			<td style="width:203px;">FiJI</td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td>https://imagej.net/Fiji)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">u-Track2 software</td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td>Matlab tool.&#160; For installing, download .zip file from the web page (http://lccb.hms.harvard.edu/software.html) and uncompress the file in a directory of your choice</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">GraphPad Prism</td>
			<td style="width:203px;">GraphPad software</td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

image processing protocol for the analysis of the diffusion and cluster size of membrane receptors by fluorescence microscopy

Suivi sur une séquence vidéo et de l’analyse postérieure de leurs trajectoires de particules est aujourd'hui une opération courante dans de nombreuses études biologiques. À l’aide de l’analyse des récepteurs de la membrane cellulaire des grappes comme modèle, nous présentons un protocole détaillé pour cette tâche d’analyse image à l’aide de Fidji (ImageJ) et routines Matlab pour : 1) définir des zones d’intérêt et de concevoir des masques adaptés à ces régions ; 2) suivre les particules dans les vidéos de microscopie de fluorescence ; 3) analyser les caractéristiques de diffusion et de l’intensité des titres sélectionnés. L’analyse quantitative des coefficients de diffusion, les types de mouvement et la taille de cluster obtenues en microscopie par fluorescence et de traitement d’image fournit un outil précieux pour déterminer objectivement la dynamique des particules et les conséquences de la modification conditions environnementales. Dans cet article, nous présentons des protocoles détaillés pour l’analyse de ces fonctionnalités. La méthode décrite ici non seulement permet la détection de molécules simples suivi, mais automatise également l’estimation des paramètres de diffusion latérale à la membrane cellulaire, classifie le type de trajectoire et permet une analyse complète ainsi surmonter la difficultés pour quantifier la taille du spot sur sa trajectoire entière à la membrane cellulaire.

L’utilisation de ce protocole permet le suivi automatique des particules détectées dans les films de microscopie par fluorescence et de l’analyse de leurs caractéristiques dynamiques. Au début, les cellules sont transfectées avec la protéine fluorescent couplé à suivre. Le niveau approprié des récepteurs présente sur la surface de la cellule qui permet la que SPT est obtenue par cellule tri (Figure 1). Les cellules sélectionnées sont analysé...

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Image Processing Protocol for the Analysis of the Diffusion and Cluster Size of Membrane Receptors by Fluorescence Microscopy

Traitement d’image protocole pour l’analyse de la Diffusion et la taille de Cluster de récepteurs membranaires par microscopie de Fluorescence

Nous présentons ici un protocole pour une seule particule suivi d’analyse d’images qui permet une évaluation quantitative des coefficients de diffusion, types de tailles de motion et cluster de simples particules détectées par microscopie à fluorescence.

Particle tracking on a video sequence and the posterior analysis of their trajectories is nowadays a common operation in many biological studies. Using ...

Les nouvelles techniques de microscopie nécessitent le développement d’outils adéquats pour la compréhension correcte des processus biologiques étudiés. Ce protocole décrit les étapes de traitement d’image requises pour le suivi d’une molécule unique, y compris l’estimation des paramètres de diffusion latérale et la quantification de la taille des taches sur toute sa trajectoire à la membrane cellulaire. Ce protocole combine l’utilisation de plusieurs logiciels, y compris ImageJ, MATLAB et uTrack, ainsi que certaines protéines qui ont été développées spécifiquement pour ce protocole.Cette méthode est illustrée par le suivi des récepteurs membranaires sous microscopie légère, mais elle peut être appliquée à n’importe quelle structure en forme de particule dont les trajectoires peuvent être suivies au fil du temps dans une séquence vidéo. Cette technique se rapporte à la recherche fondamentale et n’a pas d’application directe en milieu clinique. Cependant, il peut être utilisé pour aider à la caractérisation des événements biologiques à la fois dans différentes maladies et donc dans l’identification de nouvelles cibles thérapeutiques.Ce protocole est pertinent pour le suivi des particules dans les membranes cellulaires, comme le montre cette vidéo, mais il peut également être appliqué pour le suivi des cellules complètes, bactéries, nanoparticules dans un fluide, ou tout autre objet dont le centre peut être bien déterminé. Ce protocole est convivial et ne nécessite que des connaissances sur la culture cellulaire et les techniques de microscopie. Les différentes techniques et outils informatiques utilisés dans ce protocole peuvent intimider un nouvel utilisateur.La démonstration visuelle permet d’utiliser cette technique en toute confiance. Pour commencer, cultivez les cellules de Jurkat, transfectez-les avec un vecteur monomérique de récepteur de chimiokine gfp-étiqueté, et sélectionnez des cellules avec de faibles niveaux d’expression du vecteur étiqueté, tel que décrit dans le protocole de texte d’accompagnement. Ajoutez des supports contenant le ligand CXCL12 ou des supports de contrôle à chaque microwell en verre enduit de fibronectine de 35 millimètres qui ont été recouverts de fibronectine et incubent pendant une heure à 37 degrés Celsius.Ensuite, ajoutez des cellules triées à chaque plat et incubez pendant 20 minutes avant d’imagerier les cellules. Après l’incubation, transférer le premier plat de cellules à un stade de microscope TIRF et se tourner vers l’objectif d’immersion d’huile 100x. Localiser et se concentrer sur les cellules à l’aide de champ lumineux pour minimiser les effets de photobleaching.Passez ensuite au mode TIRF et effectuez un réglage de mise au point fine à l’aide d’une faible intensité laser. Acquérir des films d’environ 50 secondes de longueur, en minimisant l’intervalle de temps entre les images. Pour chaque fichier vidéo d’état expérimental, créez un nouveau dossier suivant les instructions de structure de fichier décrites dans le protocole texte de cette vidéo.Ouvrez la vidéo avec Fidji ou ImageJ en faisant glisser et en laissant tomber le fichier sur la barre de menu fidjienne, et cliquez sur OK pour importer le fichier LIF à l’aide de bioformats. Afin de concevoir un masque, importez également l’image multicanal correspondante. Ensuite, créez un masque en créant d’abord une seule image avec les canaux utiles pour la conception du masque.Sélectionnez Image dans le menu de la barre, et cliquez sur Couleur suivie par Split Channels pour afficher les différents canaux sous forme d’images séparées. Fusionnez à nouveau les trois canaux en une seule image en sélectionnant l’image dans le menu du bar, en allant à la couleur et en sélectionnant les canaux de fusion. Assurez-vous de sélectionner les canaux appropriés, puis appuyez sur OK pour générer une nouvelle image non empilée.Synchronisez les deux fenêtres en allant au menu de la barre, en sélectionnant Analyser, puis en allant aux outils et en sélectionnant Sync Windows. Une nouvelle fenêtre avec les possibilités d’image synchronisée sera affichée. Maintenant, avec les deux fenêtres synchronisées, la même région dans les deux fenêtres peut être recadrée.Passez à l’image dans le menu du bar et sélectionnez Crop. Avec l’outil de sélection rectangulaire, dessinez la région d’intérêt. Les deux images recadrées seront diffusées individuellement.Ensuite, désynchroniser les deux fenêtres. Si aucun masque n’a été créé, dessinez la région d’intérêt avec l’outil de sélection et la culture. Après cela, enregistrer la vidéo comme une séquence d’image dans le répertoire Videosec.Sélectionnez ensuite l’image multicanal, rendez-vous sur Plugins dans le menu et sélectionnez Segmentation Editor pour ouvrir le plugin de l’éditeur de segmentation. Choisissez l’outil de sélection à main levée, et l’utiliser pour sélectionner une étiquette verte et concevoir le masque le plus externe. Une fois conçu, appuyez sur le bouton Plus dans l’option de sélection de la fenêtre composite, et le masque sélectionné sera affiché sur la visionneuse.Répétez cette étape pour toutes les étiquettes. Une fois que tous les masques sont conçus, enregistrez le masque avec le même nom de fichier que la vidéo, avec le nom: masque.tif. Ouvrez MATLAB et ajoutez l’annuaire uTrack au chemin en allant à Set Path, et en sélectionnant Add With.Ensuite, modifiez le répertoire de travail en répertoire contenant la série à analyser. Invoquez uTrack en tapant Movie Selector GUI dans la console et en appuyant sur Enter. Cela provoquera l’ouverture de la fenêtre de sélection du film.Appuyez sur le bouton Nouveau film et attendez que la fenêtre Movie Addition apparaisse. Appuyez sur Add Channel pour choisir l’annuaire avec la vidéo et remplir les paramètres d’information du film. Définissez l’annuaire de sortie pour les résultats d’uTrack aux résultats, puis appuyez sur les paramètres avancés du canal, remplissez les paramètres liés à l’acquisition et économisez.Après avoir créé le film, appuyez sur Continuer dans la fenêtre de sélection du film. Ici, uTrack vous posera des questions sur le type d’objet à analyser. Choisissez des particules simples, puis la fenêtre du panneau de commande apparaîtra.Ensuite, sélectionnez la première étape, Étape 1: Détection, et cliquez sur Réglage. La fenêtre d’ajustement du modèle de mélange gaussien de réglage apparaîtra. Entrez les paramètres comme indiqué ici, puis appuyez sur Appliquer.Dans le panneau de commande, cliquez sur Exécuter pour exécuter l’étape de détection. Après quelques minutes, vérifiez les résultats en appuyant sur le bouton Résultat. Le film montre des cercles rouges sur les particules détectées.Si aucun cercle rouge n’est affiché, alors cette étape n’a pas fonctionné correctement et vous devriez essayer à nouveau. Maintenant, fusionnez les particules qui viennent d’être détectées en pistes qui couvrent plusieurs cadres en installant d’abord les paramètres comme indiqué ici. Appuyez ensuite sur Exécuter dans le panneau de commande.Ensuite, effectuez l’analyse de la piste. Définissez les paramètres, comme indiqué ici, puis appuyez sur Appliquer et exécuter. Vérifiez les résultats en appuyant d’abord sur le bouton Résultat, puis cliquez sur Afficher le numéro de piste de la fenêtre d’options de film et vérifiez image par image que chaque piste a été correctement identifiée, marquant manuellement les particules qui ne sont pas de véritables particules.Dans MATLAB, entrez la commande comme indiqué ici. Cette commande fera en sorte que le programme lira toutes les trajectoires et calculera les coefficients de diffusion. Ensuite, exclure les trajectoires correspondant à des taches ou des trajectoires mal identifiées en donnant la liste des taches à exclure.Calculez les coefficients instantanés de diffusion pour chacune des pistes de cette cellule en suivant le protocole texte qui l’accompagne. Dans ce cas, calculer le coefficient de diffusion pour un décalage horaire équivaut à 4 appelé D1 à 4. Une fois terminées, décomposez les trajectoires en trajectoires courtes et longues.Pour analyser les trajectoires longues, tapez la commande comme indiqué ici pour classer le type de mouvement à travers leur spectre d’échelle de moment. Analyser l’intensité de chaque particule le long de sa trajectoire. Configurez ce comportement de base de différentes façons en suivant le protocole texte qui l’accompagne.Ensuite, recueillir les informations de diffusion et d’intensité pour toutes les trajectoires. Ne recueillez que l’information sur la diffusion et l’intensité pour de courtes trajectoires. Enfin, recueillir l’échelle du spectre moment et l’information d’intensité en tapant ce qui suit, où longtemps est le suffixe utilisé précédemment.L’utilisation des techniques décrites dans ce protocole permet le suivi automatisé des particules détectées dans les films de microscopie de fluorescence et l’analyse de leurs caractéristiques dynamiques. De cette analyse, on peut obtenir différentes caractéristiques basées sur des variations de stimuli. Cela inclut, le pourcentage de taches immobiles basées sur quatre stimuli différents, le pourcentage de longues trajectoires de plus de 50 images, et les types de mouvement le long des trajectoires telles que brisées par des mouvements dirigés, libres ou confinés.En outre, le coefficient de diffusion, les intensités ponctuelles moyennes et le nombre de récepteurs par particule peuvent être déterminés. Cela montre la répartition des valeurs de coefficient de diffusion court pour chaque endroit en réponse à différents stimuli. La ligne rouge représente la valeur médiane, ce graphique similaire montre les intensités ponctuelles moyennes pour chaque endroit le long de ses 20 premiers cadres en réponse aux mêmes stimuli.Encore une fois, la ligne rouge représente la valeur moyenne d’intensité. Comme l’intensité moyenne corrigée d’un spot est liée au nombre de protéines fluorescentes présentes à cet endroit, on peut calculer directement le nombre de récepteurs par particule, comme le montre ici. MATLAB est un langage de programmation sensible aux cas.Vous pouvez varier les noms variables par rapport à ceux décrits dans ce protocole, mais assurez-vous d’être cohérent dans votre nommage. Les noms des fonctions ne peuvent pas être changés, et les virgules, les colons et les semi-colons sont importants pour une syntaxe correcte. La microscopie à molécule unique permet la visualisation de protéines membranaires individuelles avec une résolution spatio-temporelle sans précédent et offre des possibilités uniques de révéler des aspects imprévus de la biologie cellulaire.Ces protocoles ouvrent de nouvelles portes pour l’analyse quantitative des vidéos de microscopie dans les cellules et la biologie moléculaire.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Intravital Microscopy of the Spleen: Quantitative Analysis of Parasite Mobility and Blood Flow

Microscopie intravitale de la rate: Analyse quantitative de la mobilité des parasites et la circulation sanguine

The advent of intravital microscopy in experimental rodent malaria models has allowed major advances to the knowledge of parasite-host interactions 1,2. ...

Recherche

Immunologie et infection

Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

Analyse unicellulaire des<emBacillus subtilis> Les biofilms par microscopie à fluorescence et cytométrie de flux

Biofilm formation is a general attribute to almost all bacteria 1-6. When bacteria form biofilms, cells are encased in extracellular matrix that is mostly ...

Antigens Protected Functional Red Blood Cells By The Membrane Grafting Of Compact Hyperbranched Polyglycerols

Protégé antigènes fonctionnels globules rouges par la membrane greffage de compacts Polyglycérols hyperbranchés

Red blood cell (RBC) transfusion is vital for the treatment of a number of acute and chronic medical problems such as thalassemia major and sickle cell ...

Fluorescence Microscopy Methods for Determining the Viability of Bacteria in Association with Mammalian Cells

Fluorescence méthodes de microscopie pour déterminer la viabilité des bactéries en association avec des cellules de mammifères

Central to the field of bacterial pathogenesis is the ability to define if and how microbes survive after exposure to eukaryotic cells. Current protocols ...

Analysis of the Epithelial Damage Produced by Entamoeba histolytica Infection

Analysis of the Epithelial Damage Produced by Entamoeba histolytica Infection

Analyse de l&#39;altération de l&#39;épithélium Produit par<em&gt; Entamoeba histolytica</em&gt; Maladies infectieuses

Entamoeba histolytica is the causative agent of human amoebiasis, a major cause of diarrhea and hepatic abscess in tropical countries. Infection is ...

Measuring Phagosome pH by Ratiometric Fluorescence Microscopy

Mesure Phagosome pH par Ratiométrique microscopie à fluorescence

Phagocytosis is a fundamental process through which innate immune cells engulf bacteria, apoptotic cells or other foreign particles in order to kill or ...

Cortical Actin Flow in T Cells Quantified by Spatio-temporal Image Correlation Spectroscopy of Structured Illumination Microscopy Data

Actine corticale Débit en cellules T quantifiée par spatio-temporelle image spectroscopie par corrélation de Structured Illumination Microscopy données

Filamentous-actin plays a crucial role in a majority of cell processes including motility and, in immune cells, the formation of a key cell-cell ...

Preparation of CD4+ T Cells for Analysis of GD3 and GD2 Ganglioside Membrane Expression by Microscopy

Preparation of CD4+ T Cells for Analysis of GD3 and GD2 Ganglioside Membrane Expression by Microscopy

Préparation des cellules CD4<sup&gt; +</sup&gt; Cellules T pour l&#39;analyse de GD3 et GD2 ganglioside Membrane Expression par Microscopie

The methods described herein for activation of na&#239;ve CD4+ T cells in suspension and their adherence in coverslips for confocal microscopy analysis ...

Molecular Diffusion in Plasma Membranes of Primary Lymphocytes Measured by Fluorescence Correlation Spectroscopy

Diffusion moléculaire Membranes plasmatiques de Lymphocytes primaires mesurées par Fluorescence Correlation Spectroscopy

Fluorescence correlation spectroscopy (FCS) is a powerful technique for studying the diffusion of molecules within biological membranes with high spatial ...