Name: image processing protocol for the analysis of the diffusion and cluster size of membrane receptors by fluorescence microscopy
Uploaded: 2019-04-09T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Image Processing Protocol for the Analysis of the Diffusion and Cluster Size of Membrane Receptors by Fluorescence Microscopy at JoVE.com

Wir sind dankbar, dass Carlo Manzo und Maria García Parajo für ihre Hilfe und Quell-Code der Diffusion Koeffizient Analyse. Diese Arbeit wurde teilweise unterstützt durch Zuschüsse vom spanischen Ministerium für Wissenschaft, Innovation und Universitäten (SAF 2017-82940-R) und die RETICS-Programm des Instituto de Salud Carlos III (RD12/0009/009 und RD16/0012/0006; RIER). LMM und JV unterstützt das COMFUTURO-Programm von der Fundación General CSIC.

1. Vorbereitung von biologischen Proben
<ol><li>Jurkat Zellen in RPMI 1640 Medium ergänzt mit 10 % FCS, NaPyr und L-Glutamin (komplette RPMI). Electroporate Jurkat-Zellen (20 x 106 Zellen/400 µL von RPMI 1640 mit 10 % FCS) mit einem Monomeren GFP gekennzeichnet Chemokin-Rezeptor Vektor (CXCR4-AcGFP, 20 μg) ermöglichen die Erkennung mit Fluoreszenz-Mikroskopie. Hinweis: Es ist möglich, andere Monomeren fluoreszierende Proteine wie mCherry, mScarlet, etc. zu verwenden.</li>
	<li>24 h n...

<ol>
	<li>Yu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+studies+in+live+cells.">Single-molecule studies in live cells.</a> Annual Review of Pysical Chemistry. 67 (565-585), (2016).</li><li>Mattheyses, A. L., Simon, S. M., Rappoport, J. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+with+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy+for+the+cell+biologist.">Imaging with total internal reflection fluorescence microscopy for the cell biologist.</a> Journal of Cell Science. 123 (Pt 21), 3621-3628 (2010).</li><li>Jaqaman, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+single-particle+tracking+in+live-cell+time-lapse+sequences.">Robust single-particle tracking in live-cell time-lapse sequences.</a> Nature Methods. 5 (8), 695-702 (2008).</li><li>Bakker, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lateral+mobility+of+individual+integrin+nanoclusters+orchestrates+the+onset+for+leukocyte+adhesion.">Lateral mobility of individual integrin nanoclusters orchestrates the onset for leukocyte adhesion.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 109 (13), 4869-4874 (2012).</li><li>Kusumi, A., Sako, Y., Yamamoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confined+lateral+diffusion+of+membrane+receptors+as+studied+by+single+particle+tracking+(nanovid+microscopy).+Effects+of+calcium-induced+differentiation+in+cultured+epithelial+cells.">Confined lateral diffusion of membrane receptors as studied by single particle tracking (nanovid microscopy). Effects of calcium-induced differentiation in cultured epithelial cells.</a> Biophysical Journal. 65 (5), 2021-2040 (1993).</li><li>Ferrari, R. M., Manfroi, A. J., Young, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strongly+and+weakly+self-similar+diffusion.">Strongly and weakly self-similar diffusion.</a> Physica D. 154, 111-137 (2001).</li><li>Sbalzarini, I. F., Koumoutsakos, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feature+point+tracking+and+trajectory+analysis+for+video+imaging+in+cell+biology.">Feature point tracking and trajectory analysis for video imaging in cell biology.</a> Journal of Structural Biology. 151 (2), 182-195 (2005).</li><li>Ewers, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-particle+tracking+of+murine+polyoma+virus-like+particles+on+live+cells+and+artificial+membranes.">Single-particle tracking of murine polyoma virus-like particles on live cells and artificial membranes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 102 (42), 15110-15115 (2005).</li><li>Manzo, C., Garcia-Parajo, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+progress+in+single+particle+tracking:+from+methods+to+biophysical+insights.">A review of progress in single particle tracking: from methods to biophysical insights.</a> Report on Progress in Physics. 78 (12), 124601 (2015).</li><li>Calebiro, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+analysis+of+fluorescently+labeled+G-protein-coupled+receptors+reveals+complexes+with+distinct+dynamics+and+organization.">Single-molecule analysis of fluorescently labeled G-protein-coupled receptors reveals complexes with distinct dynamics and organization.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 110 (2), 743-748 (2013).</li><li>Digman, M. A., Dalal, R., Horwitz, A. F., Gratton, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+the+number+of+molecules+and+brightness+in+the+laser+scanning+microscope.">Mapping the number of molecules and brightness in the laser scanning microscope.</a> Biophysical Journal. 94 (6), 2320-2332 (2008).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Martinez-Munoz, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separating+Actin-Dependent+Chemokine+Receptor+Nanoclustering+from+Dimerization+Indicates+a+Role+for+Clustering+in+CXCR4+Signaling+and+Function.">Separating Actin-Dependent Chemokine Receptor Nanoclustering from Dimerization Indicates a Role for Clustering in CXCR4 Signaling and Function.</a> Molecular Cell. 70 (1), 106-119 (2018).</li><li>Destainville, N., Salome, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+and+correction+of+systematic+errors+due+to+detector+time-averaging+in+single-molecule+tracking+experiments.">Quantification and correction of systematic errors due to detector time-averaging in single-molecule tracking experiments.</a> Biophysical Journal. 90 (2), L17-L19 (2006).</li></ol>

Das beschriebene Verfahren ist einfach durchzuführen, auch ohne Vorkenntnisse, die Arbeit mit Matlab. Matlab-Routinen erfordern jedoch extrem Genauigkeit mit der Nomenklatur der verschiedenen Befehle und die Lokalisation der verschiedenen Ordner das Programm angestellt. In der Überwachungsdatenbank Analyse-Routine (Schritt 3), mehrere Parameter können geändert werden. Das Fenster "Einstellung passend Gauß-Mischung-Modell" (Schritt 3,8) steuert, wie U-Track einzelne Partikel auf dem Video zu erkennen. Dies geschieht ...

Membranproteine in der Lipid-Bilayer eingebettet sind in kontinuierlicher Bewegung durch thermische Diffusion. Ihre Dynamik sind für Zell-Reaktionen zu regulieren wie intermolekulare Wechselwirkungen Bildung von komplexen, die variieren in der Größe von Monomeren, Oligomeren und beeinflussen die Stabilität erlauben der komplexe Signalisierung. Aufklärung der Mechanismen, die Steuerung von Proteindynamik ist somit eine neue Herausforderung in der Zellbiologie, notwendig, Transduktion Signalwege zu verstehen und unerwartete Zellfunktionen zu identifizieren.
Einige optische Methoden zu studieren diese Interaktionen in lebenden Zellen1. Unter diesen ermöglicht Totalreflexion (TIRF) Fluoreszenzmikroskopie, entwickelt in den frühen 1980er Jahren die Untersuchung der molekularen Wechselwirkungen an oder sehr nahe der Zellmembran2. Um dynamische Parameter der Membrane Protein Trajektorien gewonnenen TIRF Daten in lebenden Zellen zu untersuchen, ist ein einzelnes Teilchen tracking-Methode (SPT) erforderlich. Obwohl mehrere Algorithmen dafür zur Verfügung stehen, verwenden wir derzeit von Jaqaman Et Al.3 , die Partikel Bewegung Heterogenität in einem dichten Partikel Feld Adresse durch die Verknüpfung von Teilchen zwischen den aufeinander folgenden Frames, die daraus resultierende Strecke verbinden Segmente in komplette Trajektorien (temporäre Teilchen verschwinden). Die Software erfasst das Teilchen zusammenführen und teilen, die sich aus der Aggregation und Dissoziation Veranstaltungen3. Die Ausgabedaten dieser Software gehört Erkennung der Partikel entlang der gesamten Flugbahn durch die Festlegung ihrer X und Y Positionen in jedem Frame.
Sobald Partikel erkannt werden, wenden wir verschiedene Algorithmen, um die kurze Spanne Diffusion-Koeffizient (D1-4)4,5zu bestimmen. Durch Anwendung der Moment Skalierung Spektrum (MSS)6,7,8 Analyse oder durch den Einbau des 'Alpha'-Wert durch Anpassung der mittlere quadratische Verschiebung (MSD) auf der Kurve9klassifizieren wir auch die Partikel der Typ der Flugbahn.
Analyse der spot Intensität in Fluoreszenzbilder ist ein gemeinsames Ziel für Wissenschaftler im Bereich10,11. Der am häufigsten verwendete Algorithmus ist die so genannte Zahl und Helligkeit. Diese Methode erlaubt dennoch keine richtige Frame-by-Frame-Intensität-Erkennung in Teilchen in der mobilen Fraktion. Wir haben, so einen neuen Algorithmus, diese Teilchen Intensitäten Frame-by-Frame zu bewerten und zu bestimmen, deren Aggregatzustand erzeugt. Sobald die Koordinaten jedes Partikels mit U-Track2 Software3erkannt werden, definieren wir ihre Intensität in jedem Frame über die gesamte Flugbahn, auch unter Berücksichtigung der Hintergrund der Zelle in jedem Frame. Diese Software bietet verschiedene Möglichkeiten, die vor Ort Intensität und der Hintergrund der Zelle bestimmen und mit bekannten Monomeren und dimeres Proteine als Referenzen, die ungefähre Anzahl der Proteine in der Partikel erkannt (Clustergröße) berechnet.
In diesem Artikel beschreiben wir eine sorgfältige Anleitung um diese drei Schritte ausführen: 1) Erkennung und Verfolgung einzelner Partikel entlang ein Video von Fluoreszenz-Mikroskopie mit U-Track; (2) Analyse der momentanen Diffusionskoeffizienten (D1-4) von diesen Teilchen und die Art der Bewegung (geschlossenen, frei oder gerichtet) Partikel mit lange Flugbahnen von MSS; (3) Messung der vor Ort Intensität entlang der Video korrigiert, indem die geschätzten Hintergrundfluoreszenz für jeden Fleck. Dadurch können Cluster Größe Schätzung und Ermittlung von Immunofluoreszenz-Schritte.
Die Verwendung dieses Protokolls erfordert keine spezielle Fähigkeiten und kann in jedem Labor mit Zellkulturen durchgeführt werden, fließen Cytometry und Mikroskopie Einrichtungen. Das Protokoll verwendet ImageJ oder Fidschi (eine Verteilung von ImageJ-12), U-Track3und einige Ad-Hoc gemacht-Routinen (http://i2pc.es/coss/Programs/protocolScripts.zip). U-Track und ad-hoc-Routinen Überfahren von Matlab, die in jedem kompatiblen Computer installieren kann.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:797px;" width="797">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">Human Jurkat cells</td>
			<td style="width:203px;">ATCC</td>
			<td style="width:203px;">CRL-10915</td>
			<td style="width:171px;">Human T cell line. Any other cell type can be analyzed with this software</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:221px;">pAcGFPm-N1 (PT3719-5)DNA3GFP</td>
			<td style="width:203px;">Clontech</td>
			<td style="width:203px;">632469</td>
			<td>Different fluorescent proteins can be followed and analyzed with this routine</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:221px;">Gene Pulse X Cell electroporator&#160;</td>
			<td>BioRad&#160;</td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td>We use 280V, 975 mF, for Jurkat cells.&#160; Use the transfection method best working in your hands.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cytomics FC 500 flow cytometer&#160;</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MoFlo Astrios Cell Sorter&#160;</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td>Depending on the level of transfection, cell sorting may not be required.&#160; You can also employ cells with stable expression of adequate levels of the receptor of interest.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">Dako Qifikit</td>
			<td style="width:203px;">DakoCytomation</td>
			<td style="width:203px;">K0078</td>
			<td>Used for quantification the number of receptors in the cell surface.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">Glass bottom microwell dishes</td>
			<td style="width:203px;">MatTek corporation</td>
			<td style="width:203px;">P35G-1.5-10-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:221px;">Human Fibronectin from plasma</td>
			<td style="width:203px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:203px;">F0895</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">Recombinant human CXCL12</td>
			<td style="width:203px;">PeproTech</td>
			<td style="width:203px;">300928A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">Inverted Leica AM TIRF</td>
			<td style="width:203px;">Leica</td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">EM-CCD camera</td>
			<td style="width:203px;">Andor&#160;</td>
			<td style="width:203px;">DU 885-CSO-#10-VP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">MATLAB</td>
			<td style="width:203px;">The MathWorks, Natick, MA</td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">U-Track2 software</td>
			<td style="width:203px;">Danuser Laboratory</td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">ImageJ</td>
			<td style="width:203px;">NIH</td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td>https://imagej.nih.gov/ij/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">FiJi</td>
			<td style="width:203px;">FiJI</td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td>https://imagej.net/Fiji)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">u-Track2 software</td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td>Matlab tool.&#160; For installing, download .zip file from the web page (http://lccb.hms.harvard.edu/software.html) and uncompress the file in a directory of your choice</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">GraphPad Prism</td>
			<td style="width:203px;">GraphPad software</td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

image processing protocol for the analysis of the diffusion and cluster size of membrane receptors by fluorescence microscopy

Particle tracking auf einer Videosequenz und die hinteren Analyse ihre Flugbahnen ist heutzutage ein häufiger Vorgang in vielen biologischen Studien. Mit der Analyse der Zellmembran Rezeptor-Cluster als Modell, präsentieren wir Ihnen ein detailliertes Protokoll für dieses Bild Analyseaufgabe Fidschi (ImageJ) und Matlab Routinen zu verwenden: 1) Regionen von Interesse zu definieren und gestalten Masken angepasst auf diese Regionen; (2) die Partikel in Fluoreszenz-Mikroskopie-Videos zu verfolgen; (3) Analyse der Verbreitung und Intensität Eigenschaften der ausgewählten Stücke. Die Quantitative Analyse der die Diffusionskoeffizienten, Arten von Bewegung und Cluster-Größe durch Fluoreszenz-Mikroskopie und Bildverarbeitung bietet ein wertvolles Werkzeug, um Partikel Dynamik und die Folgen einer Änderung Objektiv zu bestimmen Umweltbedingungen. In diesem Artikel präsentieren wir ausführliche Protokolle für die Analyse dieser Funktionen. Die beschriebene Methode hier können nicht nur Einzelmolekül-Tracking-Erkennung, aber auch automatisiert die Schätzung der lateralen Diffusion Parameter an der Zellmembran, klassifiziert den Typ der Flugbahn und ermöglicht die vollständige Analyse so überwinden die Schwierigkeiten bei der Quantifizierung der Punktgröße in seiner gesamten Flugbahn an der Zellmembran.

Die Verwendung dieses Protokolls ermöglicht die automatische Verfolgung von Fluoreszenz-Mikroskopie-Filme und die Analyse ihrer dynamischen Eigenschaften detektierten Partikel. Zunächst werden Zellen mit dem Eindringmittel gekoppelt Protein zu verfolgenden transfiziert. Die angemessene Höhe der Rezeptoren präsentiert auf der Zelloberfläche, die ermöglicht, dass SPT durch Zelle sortieren (Abbildung 1) gewonnen wird. Markierten Zellen werden von TIRF-Mikr...

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Image Processing Protocol for the Analysis of the Diffusion and Cluster Size of Membrane Receptors by Fluorescence Microscopy

Bildverarbeitungs-Protokoll für die Analyse der Diffusion und Cluster-Größe von Membranrezeptoren durch Fluoreszenz-Mikroskopie

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll für die einzelnen Partikels tracking Bildanalyse, die quantitative Bewertung des Diffusionskoeffizienten, Arten von Bewegung und Cluster-Größen der einzelnen Partikel erkannt durch Fluoreszenz-Mikroskopie ermöglicht.

Particle tracking on a video sequence and the posterior analysis of their trajectories is nowadays a common operation in many biological studies. Using ...

Neue Mikroskopietechniken erfordern die Entwicklung geeigneter Werkzeuge für das richtige Verständnis der untersuchten biologischen Prozesse. Dieses Protokoll beschreibt die Bildverarbeitungsschritte, die für die Einzelmolekülverfolgung erforderlich sind, einschließlich der Schätzung der lateralen Diffusionsparameter und der Quantifizierung der Spotgröße über die gesamte Flugbahn an der Zellmembran. Dieses Protokoll kombiniert die Verwendung mehrerer Softwareteile, einschließlich ImageJ, MATLAB und uTrack, sowie einige Proteine, die speziell für dieses Protokoll entwickelt wurden.Diese Methode wird mit der Verfolgung von Membranrezeptoren unter Lichtmikroskopie veranschaulicht, kann aber auf jede partikelähnliche Struktur angewendet werden, deren Flugbahnen im Laufe der Zeit in einer Videosequenz verfolgt werden können. Diese Technik bezieht sich auf die Grundlagenforschung und hat keine direkte Anwendung in einem klinischen Umfeld. Es kann jedoch zur Charakterisierung biologischer Ereignisse sowohl bei verschiedenen Krankheiten als auch bei der Identifizierung neuer therapeutischer Ziele verwendet werden.Dieses Protokoll ist für die Verfolgung von Partikeln in Zellmembranen relevant, wie in diesem Video gezeigt, aber es kann auch für die Verfolgung von vollständigen Zellen, Bakterien, Nanopartikeln in einer Flüssigkeit oder dem anderen Objekt, dessen Zentrum gut bestimmt werden kann, angewendet werden. Dieses Protokoll ist benutzerfreundlich und erfordert nur Kenntnisse der Zellkultur und Mikroskopietechniken. Die verschiedenen Techniken und Informatik-Tools, die in diesem Protokoll verwendet werden, können einen neuen Benutzer einschüchtern.Die visuelle Demonstration hilft, diese Technik mit Zuversicht zu verwenden. Zunächst wachsen Jurkat-Zellen, transfekten sie mit einem monomeren GFP-beschrifteten Chemokin-Rezeptorvektor und wählen Sie Zellen mit niedrigen Expressionsgehalten des beschrifteten Vektors aus, wie im begleitenden Textprotokoll beschrieben. Fügen Sie Medien, die den CXCL12-Ligand enthalten, oder Kontrollmedien zu jedem fibronectinbeschichteten 35-Millimeter-Mikrobrunnen-Mikrobrunnen-Geschirr mit Glasfaser, das mit Fibronectin beschichtet wurde, und brüten Sie eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius.Fügen Sie als Nächstes sortierte Zellen zu jeder Schale hinzu und brüten Sie 20 Minuten lang, bevor Sie die Zellen bildgeben. Nach der Inkubation die erste Zellschale auf ein TIRF-Mikroskopstadium übertragen und auf das 100-fache Öl-Tauchziel umstellen. Suchen und konzentrieren Sie sich auf die Zellen mit hellem Feld, um Photobleicheffekte zu minimieren.Wechseln Sie dann in den TIRF-Modus und führen Sie eine Feinfokuseinstellung mit geringer Laserintensität durch. Erfassen Sie Filme mit einer Länge von ca. 50 Sekunden, wodurch das Zeitintervall zwischen Frames minimiert wird. Erstellen Sie für jede Videodatei mit experimentellen Bedingungen einen neuen Ordner, der den Anweisungen der Dateistruktur folgt, die im Textprotokoll dieses Videos beschrieben sind.Öffnen Sie das Video mit Fidschi oder ImageJ, indem Sie die Datei in der Fidschi-Menüleiste ziehen und ablegen, und klicken Sie auf OK, um die LIF-Datei mithilfe von Bioformaten zu importieren. Um eine Maske zu entwerfen, importieren Sie auch das entsprechende Mehrkanalbild. Erstellen Sie als Nächstes eine Maske, indem Sie zuerst ein einzelnes Bild mit den Kanälen erstellen, die für das Design der Maske nützlich sind.Wählen Sie Bild im Balkenmenü aus, und klicken Sie auf Farbe gefolgt von Kanäle teilen, um die verschiedenen Kanäle als separate Bilder anzuzeigen. Führen Sie die drei Kanäle in einem einzelnen Bild erneut zusammen, indem Sie Bild im Balkenmenü auswählen, zu Farbe wechseln und Kanäle zusammenführen auswählen. Stellen Sie sicher, dass Sie die entsprechenden Kanäle auswählen, und drücken Sie dann OK, um ein neues nicht gestapeltes Bild zu generieren.Synchronisieren Sie die beiden Fenster, indem Sie zum Balkenmenü wechseln, Analysieren auswählen und dann zu Extras wechseln und Windows synchronisieren auswählen. Ein neues Fenster mit den synchronisierten Bildmöglichkeiten wird angezeigt. Nachdem die beiden Fenster synchronisiert sind, kann nun der gleiche Bereich in beiden Fenstern zugeschnitten werden.Gehen Sie im Balkenmenü zu Bild und wählen Sie Zuschneiden aus. Zeichnen Sie mit dem rechteckigen Auswahlwerkzeug den Interessenbereich. Die beiden zugeschnittenen Bilder werden einzeln angezeigt.Als Nächstes wird die Synchronisierung beider Fenster aufkleben. Wenn keine Maske erstellt wurde, zeichnen Sie den Interessenbereich mit dem Auswahlwerkzeug und dem Zuschneiden. Danach speichern Sie das Video als Bildsequenz im Verzeichnis Videosec.Wählen Sie dann das Mehrkanalbild aus, gehen Sie zu Plugins im Menü, und wählen Sie Segmentierungs-Editor aus, um das Segmentierungs-Editor-Plugin zu öffnen. Wählen Sie das Freihandauswahlwerkzeug aus, und wählen Sie damit ein grünes Etikett aus und entwerfen Sie die äußerste Maske. Nach der Konstruktion drücken Sie die Plus-Taste in der Auswahloption des zusammengesetzten Fensters, und die ausgewählte Maske wird auf dem Viewer angezeigt.Wiederholen Sie diesen Schritt für alle Beschriftungen. Sobald alle Masken entworfen wurden, speichern Sie die Maske mit dem gleichen Dateinamen wie das Video, mit dem Namen:mask.tif. Öffnen Sie MATLAB, und fügen Sie das uTrack-Verzeichnis zum Pfad hinzu, indem Sie zu Pfad festlegen und Add With auswählen.Ändern Sie dann das Arbeitsverzeichnis in das Verzeichnis, das die zu analysierende Serie enthält. Rufen Sie uTrack auf, indem Sie Movie Selector GUI in die Konsole eingeben und Enter drücken. Dadurch wird das Filmauswahlfenster geöffnet.Drücken Sie die Schaltfläche "Neuer Film", und warten Sie, bis das Fenster "Filmhinzufügen" angezeigt wird. Drücken Sie auf Kanal hinzufügen, um das Verzeichnis mit dem Video auszuwählen und die Filminformationsparameter auszufüllen. Legen Sie das Ausgabeverzeichnis für die Ergebnisse von uTrack auf Ergebnisse fest, drücken Sie dann auf die erweiterten Kanaleinstellungen, füllen Sie die Parameter im Zusammenhang mit der Erfassung und speichern Sie sie.Nachdem Sie den Film erstellt haben, drücken Sie im Filmauswahlfenster auf Weiter. Hier fragt uTrack nach dem Typ des zu analysierenden Objekts. Wählen Sie Einzelne Partikel aus, und dann wird das Bedienfeldfenster angezeigt.Wählen Sie als Nächstes den ersten Schritt, Schritt 1:Erkennung, und klicken Sie auf Einstellung. Das Fenster Einstellung Gaussian Mixture Model Fitting wird angezeigt. Geben Sie die Einstellungen wie hier gezeigt ein, und drücken Sie dann Anwenden.Klicken Sie im Bedienfeld auf Ausführen, um den Erkennungsschritt auszuführen. Überprüfen Sie nach einigen Minuten die Ergebnisse, indem Sie die Ergebnistaste drücken. Der Film zeigt rote Kreise auf den erkannten Teilchen.Wenn kein roter Kreis angezeigt wird, hat dieser Schritt nicht richtig funktioniert, und Sie sollten es erneut versuchen. Führen Sie nun die soeben erkannten Partikel in Spuren zusammen, die sich über mehrere Frames erstrecken, indem Sie zuerst die Parameter wie hier gezeigt einrichten. Drücken Sie dann in der Steuerung auf Ausführen.Führen Sie als Nächstes die Spuranalyse durch. Definieren Sie die Einstellungen, wie hier gezeigt, und drücken Sie dann Anwenden und Ausführen. Überprüfen Sie die Ergebnisse, indem Sie zuerst auf die Schaltfläche Ergebnis drücken, dann auf Spurnummer des Filmoptionen-Fensters anzeigen klicken und Frame-für-Frame überprüfen, ob jede Spur korrekt identifiziert wurde, und markieren Sie Partikel, die keine echten Partikel sind.Geben Sie in MATLAB den Befehl ein, wie hier gezeigt. Dieser Befehl bewirkt, dass das Programm alle Flugbahnen liest und die Diffusionskoeffizienten berechnet. Als Nächstes schließen Sie Flugbahnen aus, die falsch identifizierten Flecken oder Flugbahnen entsprechen, indem Sie die Liste der auszuschließenden Punkte angeben.Berechnen Sie die momentanen Diffusionskoeffizienten für jede der Spuren dieser Zelle, indem Sie dem begleitenden Textprotokoll folgen. Berechnen Sie in diesem Fall den Diffusionskoeffizienten für eine Zeitverzögerung gleich 4, d. h. D1 bis 4. Wenn Sie fertig sind, zersetzen Sie die Bahnen in kurze und lange Bahnen.Um lange Flugbahnen zu analysieren, geben Sie den Befehl wie hier gezeigt ein, um den Bewegungstyp durch ihr Momentskalierungsspektrum zu klassifizieren. Analysieren Sie die Intensität jedes Partikels entlang ihrer Flugbahn. Konfigurieren Sie dieses grundlegende Verhalten auf viele verschiedene Arten, indem Sie das begleitende Textprotokoll mitverfolgen.Sammeln Sie dann die Diffusions- und Intensitätsinformationen für alle Flugbahnen. Sammeln Sie nur die Diffusions- und Intensitätsinformationen für kurze Bahnen. Schließlich sammeln Sie die Momentspektrumskalierung und die Intensitätsinformationen, indem Sie Folgendes eingeben, wobei das zuvor verwendete Suffix lang ist.Die Verwendung der in diesem Protokoll beschriebenen Techniken ermöglicht die automatisierte Verfolgung von Partikeln, die in Fluoreszenzmikroskopiefilmen nachgewiesen werden, und die Analyse ihrer dynamischen Eigenschaften. Aus dieser Analyse kann man unterschiedliche Eigenschaften auf der Grundlage von Variationen der Reize erhalten. Dazu gehören der Prozentsatz der unbeweglichen Flecken, basierend auf vier verschiedenen Reizen, der Prozentsatz der langen Bahnen von mehr als 50 Rahmen und die Bewegungsarten entlang der Flugbahnen, die durch gerichtete, freie oder beschränkte Bewegungen aufgebrochen werden.Darüber hinaus können der Diffusionskoeffizient, die mittleren Punktintensitäten und die Anzahl der Rezeptoren pro Partikel bestimmt werden. Dies zeigt die Verteilung der kurzen Diffusionskoeffizientenwerte für jeden Punkt als Reaktion auf unterschiedliche Reize. Die rote Linie stellt den Medianwert dar, dieses ähnliche Diagramm zeigt die mittleren Spotintensitäten für jeden Punkt entlang seiner ersten 20 Frames als Reaktion auf die gleichen Reize.Auch hier stellt die rote Linie den mittleren Intensitätswert dar. Da die mittlere korrigierte Intensität eines Spots mit der Anzahl der fluoreszierenden Proteine in diesem Punkt zusammenhängt, kann man direkt die Anzahl der Rezeptoren pro Teilchen berechnen, wie hier gezeigt. MATLAB ist eine Programmiersprache mit Groß-/Kleinschreibung.Sie können die Variablennamen in Bezug auf die in diesem Protokoll beschriebenen ändern, aber stellen Sie sicher, dass Sie in Ihrer Benennung konsistent sind. Die Namen der Funktionen können nicht geändert werden, und Kommas, Doppelpunkte und Semikolons sind für eine korrekte Syntax wichtig. Die Einzelmolekülmikroskopie ermöglicht die Visualisierung einzelner Membranproteine mit einer nie dagewesenen raumzeitlichen Auflösung und bietet einzigartige Möglichkeiten, unerwartete Aspekte der Zellbiologie aufzudecken.Diese Protokolle öffnen neue Türen für die quantitative Analyse von Mikroskopievideos in Zellen und molekularer Biologie.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Intravital Microscopy of the Spleen: Quantitative Analysis of Parasite Mobility and Blood Flow

Intravitalmikroskopie der Milz: Quantitative Analyse von Parasite Mobility und die Durchblutung

The advent of intravital microscopy in experimental rodent malaria models has allowed major advances to the knowledge of parasite-host interactions 1,2. ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

Einzel-Zell-Analyse Bacillus subtilis Biofilme mittels Fluoreszenzmikroskopie und Durchflusszytometrie

Biofilm formation is a general attribute to almost all bacteria 1-6. When bacteria form biofilms, cells are encased in extracellular matrix that is mostly ...

Antigens Protected Functional Red Blood Cells By The Membrane Grafting Of Compact Hyperbranched Polyglycerols

Antigene geschützten funktionellen Red Blood Cells durch die Membran Pfropfung von Compact hyperverzweigten Polyglycerinen

Red blood cell (RBC) transfusion is vital for the treatment of a number of acute and chronic medical problems such as thalassemia major and sickle cell ...

Fluorescence Microscopy Methods for Determining the Viability of Bacteria in Association with Mammalian Cells

Fluoreszenz-Mikroskopie-Methoden zur Bestimmung der Lebensfähigkeit der Bakterien in Verbindung mit Säugerzellen

Central to the field of bacterial pathogenesis is the ability to define if and how microbes survive after exposure to eukaryotic cells. Current protocols ...

Analysis of the Epithelial Damage Produced by Entamoeba histolytica Infection

Analysis of the Epithelial Damage Produced by Entamoeba histolytica Infection

Die Analyse der epithelialen Schäden Produziert von<em&gt; Entamoeba histolytica</em&gt; Infektion

Entamoeba histolytica is the causative agent of human amoebiasis, a major cause of diarrhea and hepatic abscess in tropical countries. Infection is ...

Measuring Phagosome pH by Ratiometric Fluorescence Microscopy

Mess Phagosomen pH durch ratiometrische Fluoreszenzmikroskopie

Phagocytosis is a fundamental process through which innate immune cells engulf bacteria, apoptotic cells or other foreign particles in order to kill or ...

Cortical Actin Flow in T Cells Quantified by Spatio-temporal Image Correlation Spectroscopy of Structured Illumination Microscopy Data

Kortikalen Aktin Fluss in T-Zellen durch Raum-zeitliche Bildkorrelationsspektroskopie von Structured Illumination Microscopy Daten Quantifizierte

Filamentous-actin plays a crucial role in a majority of cell processes including motility and, in immune cells, the formation of a key cell-cell ...

Preparation of CD4+ T Cells for Analysis of GD3 and GD2 Ganglioside Membrane Expression by Microscopy

Preparation of CD4+ T Cells for Analysis of GD3 and GD2 Ganglioside Membrane Expression by Microscopy

Herstellung von CD4<sup&gt; +</sup&gt; T-Zellen für die Analyse von GD3 und GD2 Gangliosid Membran-Expression durch Mikroskopie

The methods described herein for activation of na&#239;ve CD4+ T cells in suspension and their adherence in coverslips for confocal microscopy analysis ...

Molecular Diffusion in Plasma Membranes of Primary Lymphocytes Measured by Fluorescence Correlation Spectroscopy

Molekulare Diffusion in Plasmamembranen von primären Lymphozyten mittels Fluoreszenz-Korrelations-Spektroskopie gemessen

Fluorescence correlation spectroscopy (FCS) is a powerful technique for studying the diffusion of molecules within biological membranes with high spatial ...