Name: image processing protocol for the analysis of the diffusion and cluster size of membrane receptors by fluorescence microscopy
Uploaded: 2019-04-09T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Image Processing Protocol for the Analysis of the Diffusion and Cluster Size of Membrane Receptors by Fluorescence Microscopy at JoVE.com

אנחנו מודים ועד מאנזו קרלו מריה גארסיה Parajo שלהם עזרה וקוד המקור של ניתוח מקדם דיפוזיה. עבודה זו נתמך בחלקה על ידי מענקים מן הספרדית משרד המדע, חדשנות אוניברסיטאות (SAF 2017-82940-R), את תוכנית RETICS של אינסטיטוטו דה סאלוד Carlos III (RD12/0009/009, RD16/0012/0006; RIER). LMM JV נתמכים על-ידי התוכנית COMFUTURO של CSIC Fundación הכללי.

1. הכנת דגימות ביולוגיות
<ol><li>לגדל תאים Jurkat בינוני RPMI 1640 בתוספת 10% FCS, NaPyr וגלוטמין (RPMI מלאה). Electroporate Jurkat תאים (20 x 106 תאים/400 µL של RPMI 1640 עם 10% FCS) עם וקטור קולטן כימוקין מתויג-GFP monomeric (CXCR4-AcGFP, 20 μg) כדי לאפשר זיהוי שלו באמצעות מיקרוסקופ זריחה. הערה: זה אפשרי להשתמש בחלבונים פלורסנט mon...

<ol>
	<li>Yu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+studies+in+live+cells.">Single-molecule studies in live cells.</a> Annual Review of Pysical Chemistry. 67 (565-585), (2016).</li><li>Mattheyses, A. L., Simon, S. M., Rappoport, J. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+with+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy+for+the+cell+biologist.">Imaging with total internal reflection fluorescence microscopy for the cell biologist.</a> Journal of Cell Science. 123 (Pt 21), 3621-3628 (2010).</li><li>Jaqaman, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+single-particle+tracking+in+live-cell+time-lapse+sequences.">Robust single-particle tracking in live-cell time-lapse sequences.</a> Nature Methods. 5 (8), 695-702 (2008).</li><li>Bakker, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lateral+mobility+of+individual+integrin+nanoclusters+orchestrates+the+onset+for+leukocyte+adhesion.">Lateral mobility of individual integrin nanoclusters orchestrates the onset for leukocyte adhesion.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 109 (13), 4869-4874 (2012).</li><li>Kusumi, A., Sako, Y., Yamamoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confined+lateral+diffusion+of+membrane+receptors+as+studied+by+single+particle+tracking+(nanovid+microscopy).+Effects+of+calcium-induced+differentiation+in+cultured+epithelial+cells.">Confined lateral diffusion of membrane receptors as studied by single particle tracking (nanovid microscopy). Effects of calcium-induced differentiation in cultured epithelial cells.</a> Biophysical Journal. 65 (5), 2021-2040 (1993).</li><li>Ferrari, R. M., Manfroi, A. J., Young, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strongly+and+weakly+self-similar+diffusion.">Strongly and weakly self-similar diffusion.</a> Physica D. 154, 111-137 (2001).</li><li>Sbalzarini, I. F., Koumoutsakos, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feature+point+tracking+and+trajectory+analysis+for+video+imaging+in+cell+biology.">Feature point tracking and trajectory analysis for video imaging in cell biology.</a> Journal of Structural Biology. 151 (2), 182-195 (2005).</li><li>Ewers, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-particle+tracking+of+murine+polyoma+virus-like+particles+on+live+cells+and+artificial+membranes.">Single-particle tracking of murine polyoma virus-like particles on live cells and artificial membranes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 102 (42), 15110-15115 (2005).</li><li>Manzo, C., Garcia-Parajo, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+progress+in+single+particle+tracking:+from+methods+to+biophysical+insights.">A review of progress in single particle tracking: from methods to biophysical insights.</a> Report on Progress in Physics. 78 (12), 124601 (2015).</li><li>Calebiro, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+analysis+of+fluorescently+labeled+G-protein-coupled+receptors+reveals+complexes+with+distinct+dynamics+and+organization.">Single-molecule analysis of fluorescently labeled G-protein-coupled receptors reveals complexes with distinct dynamics and organization.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 110 (2), 743-748 (2013).</li><li>Digman, M. A., Dalal, R., Horwitz, A. F., Gratton, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+the+number+of+molecules+and+brightness+in+the+laser+scanning+microscope.">Mapping the number of molecules and brightness in the laser scanning microscope.</a> Biophysical Journal. 94 (6), 2320-2332 (2008).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Martinez-Munoz, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separating+Actin-Dependent+Chemokine+Receptor+Nanoclustering+from+Dimerization+Indicates+a+Role+for+Clustering+in+CXCR4+Signaling+and+Function.">Separating Actin-Dependent Chemokine Receptor Nanoclustering from Dimerization Indicates a Role for Clustering in CXCR4 Signaling and Function.</a> Molecular Cell. 70 (1), 106-119 (2018).</li><li>Destainville, N., Salome, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+and+correction+of+systematic+errors+due+to+detector+time-averaging+in+single-molecule+tracking+experiments.">Quantification and correction of systematic errors due to detector time-averaging in single-molecule tracking experiments.</a> Biophysical Journal. 90 (2), L17-L19 (2006).</li></ol>

השיטה המתוארת קל לבצע אפילו מבלי ניסיון עבודה עם Matlab. עם זאת, Matlab רוטינות לדרוש מאוד דיוק עם המינוח של פקודות שונות, הלוקליזציה של התיקיות שונות המועסקים על-ידי התוכנית. ב המעקב אחר ניתוח שגרתי (שלב 3), ניתן לשנות פרמטרים מרובים. חלון "הגדרה Gaussian-תערובת דגם נאוה" (שלב 3.8) קובעת איך U-track יזהה חלקי...

חלבוני ממברנה שמוטבע על שכבה ליפידית הן בתנועה מתמדת עקב פיזור תרמי. הדינמיקה שלהם חיוניים כדי לווסת את התגובות התא, כפי האינטראקציות הבין-מולקולרי לאפשר היווצרות מתחמים להשתנות בגודלו מונומרים כדי oligomers ולהשפיע על יציבותו של איתות תסביכים. שחקרתי את מנגנוני שליטה חלבון דינמיקה היא לפיכך אתגר חדש ב ביולוגיה של התא, הדרושים כדי להבין את האות התמרה חושית מסלולים וכדי לזהות פונקציות תא בלתי צפויות.
פותחו מספר שיטות אופטי ללמוד אינטראקציות אלה החיים תאים1. בין אלה, מיקרוסקופ קרינה פלואורסצנטית (TIRF) גמורה, שפותחה בשנות ה-80 המוקדמות, מאפשר חקר אינטראקציות מולקולרית ליד או מאוד את קרום התא2. ללמוד פרמטרים דינמיים של מסלולים חלבון ממברנה המתקבל TIRF נתונים בתאים חיים, חלקיק בודד שיטת (SPT) מעקב נדרש. למרות מספר אלגוריתמים זמינים עבור זה, אנו כעת להשתמש לאלה שפורסמו על ידי Jaqaman et al.3 המטפלות הטרוגניות תנועה של חלקיקים בשדה החלקיקים צפופים על-ידי קישור חלקיקים בין מסגרות רצופים כדי להתחבר למסלול וכתוצאה מכך מקטעי לתוך מסלולים מלאה (היעלמות זמנית החלקיקים). התוכנה לוכדת את החלקיקים מיזוג ופיצול הנגרמות כתוצאה צבירת ו דיסוציאציה אירועים3. אחד נתוני הפלט של תוכנה זו היא זיהוי של החלקיקים לאורך המסלול כולו על-ידי הגדרת את עמדותיהם X ו- Y בכל מסגרת.
ברגע זוהו חלקיקים, אנו מיישמים אלגוריתמים שונים כדי לקבוע את timelag קצר דיפוזיה מקדם (ד1-4)4,5. על-ידי החלת הניתוח8 רגע דרוג ספקטרום (MSS)7,6,, או על-ידי התאמת הערך 'alpha' על-ידי התאמה של ממוצע הריבועים הזחה (MSD) עקומת9, אנחנו גם לסווג את החלקיקים על פי סוג מסלול.
ניתוח בעוצמה ספוט בתמונות פלורסצנטיות הוא מטרה משותפת עבור מדענים שדה10,11. האלגוריתם הנפוץ ביותר בשימוש הוא מספר כביכול בהירות. שיטה זו בכל זאת אינו מאפשר זיהוי נכון מסגרת עוצמת ב חלקיקי השבר ניידים. לנו יש, לכן, שנוצר אלגוריתם חדש כדי להעריך אלו חלקיקים בעוצמות-המסגרת וכדי לקבוע את מצב צבירת שלהם. ברגע נקודות הציון של כל חלקיק מזוהים באמצעות תוכנת U-Track23, אנו מגדירים בעוצמתה בכל מסגרת מעל המסלול המלא, גם אם ניקח בחשבון את הרקע לתא בכל מסגרת. תוכנה זו מציעה אפשרויות שונות כדי לקבוע את עוצמת המקום והרקע תא לקניה, באמצעות חלבונים monomeric ו- dimeric ידוע גם הפניות, מחשבת את המספר המשוער של חלבונים בהחלקיק זוהה (גודל האשכול).
במאמר זה, אנו מתארים מדריך זהיר כדי לבצע את השלבים 3: 1) זיהוי ומעקב אחר חלקיקים בודדים לאורך וידאו של מיקרוסקופיית פלורסצנטיות באמצעות U-track; 2) מנתח את מקדם דיפוזיה מיידי (ד1-4) של החלקיקים כאלו וסוג התנועה (מוגבל, חינם או מכוונת) של חלקיקים עם מסלולים ארוכים על ידי MSS; 3) מדידת עוצמת ספוט לאורך הווידאו על-ידי קרינה פלואורסצנטית הרקע מוערך בכל מקום. כך מתאפשר הערכת גודל האשכול וזיהוי של השלבים photobleaching.
השימוש בפרוטוקול זה אינו דורש כישורים מיוחדים ניתן לבצע במעבדה כלשהי עם תרבית תאים, flow cytometry ומתקני מיקרוסקופ. הפרוטוקול משתמש ImageJ או פיג'י (הפצה של ImageJ12), U-track3והשגרה הוק עשה כמה לספירה (http://i2pc.es/coss/Programs/protocolScripts.zip). U-track, אד הוק רוטינות לדרוס Matlab שניתן להתקין בכל מחשב תואם.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:797px;" width="797">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">Human Jurkat cells</td>
			<td style="width:203px;">ATCC</td>
			<td style="width:203px;">CRL-10915</td>
			<td style="width:171px;">Human T cell line. Any other cell type can be analyzed with this software</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:221px;">pAcGFPm-N1 (PT3719-5)DNA3GFP</td>
			<td style="width:203px;">Clontech</td>
			<td style="width:203px;">632469</td>
			<td>Different fluorescent proteins can be followed and analyzed with this routine</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:221px;">Gene Pulse X Cell electroporator&#160;</td>
			<td>BioRad&#160;</td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td>We use 280V, 975 mF, for Jurkat cells.&#160; Use the transfection method best working in your hands.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cytomics FC 500 flow cytometer&#160;</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MoFlo Astrios Cell Sorter&#160;</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td>Depending on the level of transfection, cell sorting may not be required.&#160; You can also employ cells with stable expression of adequate levels of the receptor of interest.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">Dako Qifikit</td>
			<td style="width:203px;">DakoCytomation</td>
			<td style="width:203px;">K0078</td>
			<td>Used for quantification the number of receptors in the cell surface.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">Glass bottom microwell dishes</td>
			<td style="width:203px;">MatTek corporation</td>
			<td style="width:203px;">P35G-1.5-10-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:221px;">Human Fibronectin from plasma</td>
			<td style="width:203px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:203px;">F0895</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">Recombinant human CXCL12</td>
			<td style="width:203px;">PeproTech</td>
			<td style="width:203px;">300928A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">Inverted Leica AM TIRF</td>
			<td style="width:203px;">Leica</td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">EM-CCD camera</td>
			<td style="width:203px;">Andor&#160;</td>
			<td style="width:203px;">DU 885-CSO-#10-VP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">MATLAB</td>
			<td style="width:203px;">The MathWorks, Natick, MA</td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">U-Track2 software</td>
			<td style="width:203px;">Danuser Laboratory</td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">ImageJ</td>
			<td style="width:203px;">NIH</td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td>https://imagej.nih.gov/ij/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">FiJi</td>
			<td style="width:203px;">FiJI</td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td>https://imagej.net/Fiji)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">u-Track2 software</td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td>Matlab tool.&#160; For installing, download .zip file from the web page (http://lccb.hms.harvard.edu/software.html) and uncompress the file in a directory of your choice</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">GraphPad Prism</td>
			<td style="width:203px;">GraphPad software</td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

image processing protocol for the analysis of the diffusion and cluster size of membrane receptors by fluorescence microscopy

חלקיק מעקב על רצף וידאו וניתוח האחורי של מסלולים שלהם היא כיום פעולה נפוצה במחקרים ביולוגיים רבים. באמצעות הניתוח של קרום התא קולטן אשכולות כמודל, אנו מציגים פרוטוקול מפורט עבור משימה זו ניתוח התמונה באמצעות פיג'י (ImageJ) ו- Matlab שגרות: 1) מגדירים אזורים מעניינים ומעצבים את מסכות המותאמים לאזורים אלה; 2) לאתר את חלקיקי קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ וידאו; 3) לנתח את מאפייני דיפוזיה והעוצמה של הרצועות. ניתוח כמותי של מקדמי דיפוזיה, סוגי תנועה וגודל האשכול מתקבל על ידי קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ, עיבוד תמונה מספק כלי חשוב כדי לקבוע באופן אובייקטיבי dynamics החלקיקים ואת ההשלכות של שינוי תנאים סביבתיים. במאמר זה אנו מציגים פרוטוקולים מפורט לניתוח של תכונות אלה. השיטה המתוארת כאן לא רק מאפשר זיהוי מעקב מולקולה בודדת, אבל גם ממכן הערכת פרמטרים דיפוזיה לרוחב-קרום התא, מסווג את סוג המסלול, מאפשר ניתוח מלא ובכך להתגבר קשיים לכימות בגודל נקודה לאורך המסלול כולו שלו-קרום התא.

השימוש של פרוטוקול זה מאפשר את מעקב אוטומטי של חלקיקים זוהה סרטים מיקרוסקופ פלורסצנטיות, הניתוח של המאפיינים דינמי שלהם. בתחילה, התאים הם transfected עם החלבון מצמידים fluorescently לבצע אחריהם מעקב. הרמה המתאימה של קולטנים מציג על פני התא, המאפשר ש-SPT מתקבל על ידי התא מיון (<strong class="xfi...

Watch this Scientific Journal Video about Image Processing Protocol for the Analysis of the Diffusion and Cluster Size of Membrane Receptors by Fluorescence Microscopy at JoVE.com

Image Processing Protocol for the Analysis of the Diffusion and Cluster Size of Membrane Receptors by Fluorescence Microscopy

עיבוד פרוטוקול עבור הניתוח של פעפוע וגודל האשכול של קולטני ממברנה על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ תמונה

כאן, אנו מציגים עבור חלקיק יחיד מעקב וניתוח תמונות המאפשר הערכה כמותית של דיפוזיה מקדמים, סוגי תנועה וגדלי אשכול של חלקיקים אחד שזוהה על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ פרוטוקול.

Particle tracking on a video sequence and the posterior analysis of their trajectories is nowadays a common operation in many biological studies. Using ...

טכניקות מיקרוסקופיות חדשות דורשות פיתוח כלים מתאימים להבנה נכונה של התהליכים הביולוגיים הנחקרים. פרוטוקול זה מתאר את שלבי עיבוד התמונה הנדרשים למעקב אחר מולקולה יחידה, כולל הערכה של פרמטרי דיפוזיה רוחבית וכמות גודל ספוט לאורך כל מסלולו בממברנה של התא. פרוטוקול זה משלב שימוש במספר חלקי תוכנה, כולל ImageJ, MATLAB ו- uTrack, כמו גם כמה חלבונים שפותחו במיוחד עבור פרוטוקול זה.שיטה זו מאוירת עם מעקב אחר קולטני קרום תחת מיקרוסקופ אור, אבל זה יכול להיות מיושם על כל מבנה דמוי חלקיקים אשר מסלוליו ניתן לעקוב לאורך זמן ברצף וידאו. טכניקה זו מתייחסת למחקר בסיסי ואין לה יישום ישיר בסביבה קלינית. עם זאת, ניתן להשתמש בו כדי לסייע באפיון אירועים ביולוגיים הן במחלות שונות ולכן בזיהוי מטרות טיפוליות חדשות.פרוטוקול זה רלוונטי למעקב אחר חלקיקים בממברנות הסלולר, כפי שמוצג בסרטון זה, אך ניתן ליישמו גם למעקב אחר תאים מלאים, חיידקים, חלקיקים בנוזל, או כל אובייקט אחר שמרכזו ניתן לקבוע היטב. פרוטוקול זה ידידותי למשתמש ודורש רק ידע בתרבות התאים ובטכניקות מיקרוסקופיה. הטכניקות השונות וכלים לא פורמטיים המשמשים בפרוטוקול זה עשויים להפחיד משתמש חדש.ההדגמה החזותית מסייעת להשתמש בטכניקה זו בביטחון. כדי להתחיל, לגדל תאי Jurkat, לשנות אותם עם וקטור קולטן כימוקין מונומרי GFP שכותרתו, ולבחור תאים עם רמות ביטוי נמוכות של וקטור שכותרתו, כמתואר בפרוטוקול הטקסט הנלווה. הוסף מדיה המכילה את הליגנד CXCL12 או את מדיית הבקרה לכל צלחות מיקרווול מצופות זכוכית מצופות פיברונקטין באורך 35 מילימטרים, מצופות בפיברונקטין, ודגירה למשך שעה אחת ב-37 מעלות צלזיוס.לאחר מכן, מוסיפים תאים ממוינים לכל מנה, ומדגרים במשך 20 דקות לפני הדמיה של התאים. לאחר הדגירה, להעביר את המנה הראשונה של תאים לשלב מיקרוסקופ TIRF ולהפוך את המטרה טבילת שמן 100x. אתר את התאים באמצעות שדה בהיר והתמקד בהם כדי למזער אפקטים של שכפול תמונות.לאחר מכן עבור למצב TIRF ובצע כוונון מיקוד עדין בעוצמת לייזר נמוכה. רכוש סרטים באורך של כ- 50 שניות, תוך מזעור מרווח הזמן בין המסגרות. עבור כל קובץ וידאו של תנאי ניסיוני, צור תיקיה חדשה בהתאם לכיווני מבנה הקבצים המתוארים בפרוטוקול הטקסט של וידאו זה.פתח את הווידאו עם פיג'י או ImageJ על ידי גרירה ושחרור של הקובץ על שורת התפריטים פיג'י, ולחץ על אישור לייבא את קובץ LIF באמצעות bioformats. כדי לעצב מסיכה, יש לייבא גם את התמונה מרובת הערוצים המתאימה. לאחר מכן, צרו מסיכה על-ידי יצירת תמונה אחת תחילה עם הערוצים השימושיים לעיצוב המסיכה.בחרו 'תמונה' בתפריט 'סרגל', ולחצו על 'צבע' ואחריו 'פיצול ערוצים' כדי להציג את הערוצים השונים כתמונות נפרדות. מזג שוב את שלושת הערוצים בתמונה בודדת על-ידי בחירה באפשרות תמונה בתפריט הבר, עבור אל צבע ובחירה באפשרות מזג ערוצים. הקפד לבחור את הערוצים המתאימים ולאחר מכן לחץ על אישור כדי ליצור תמונה חדשה שאינה מוערמת.סנכרן את שני החלונות על-ידי הפעלה לתפריט הבר, בחירה באפשרות נתח ולאחר מכן עבור אל כלים ובחירה באפשרות סנכרן את Windows. חלון חדש עם אפשרויות התמונה המסונכרנת יוצג. כעת, כאשר שני החלונות מסונכרנים, ניתן לחתוך את אותו אזור בשני החלונות.עבור אל תמונה בתפריט הבר ובחר חתוך. בעזרת כלי הבחירה המלבני, ציירו את אזור העניין. שתי התמונות החתוכה יראה בנפרד.לאחר מכן, בטל את הסנכרון של שני החלונות. אם לא נוצרה מסיכה, ציירו את אזור העניין בכלי הבחירה ובחיתוך. לאחר מכן, שמור את הווידאו כרצף תמונות בספריה Videosec.לאחר מכן בחרו בתמונה מרובת הערוצים, עברו לתוספות בתפריט ובחרו 'עורך פילוח' לפתיחת תוסף עורך הפילוח. בחרו בכלי הבחירה ביד חופשית, ולהשתמש בו לבחירת תווית ירוקה ולעיצוב המסיכה החיצונית ביותר. לאחר עיצובו, לחץ על לחצן הפלוס באפשרות בחירה של חלון ללא הפרדות צבע, והמסיכה שנבחרה תוצג במציג.חזור על שלב זה עבור כל התוויות. לאחר שכל המסיכות מעוצבות, שמרו את המסיכה עם שם קובץ זהה לשם הסרטון, עם השם:מסיכה.tif. פתח את MATLAB והוסף את ספריית uTrack לנתיב על-ידי בחירה באפשרות הגדר נתיב ובחירה באפשרות הוסף באמצעות.לאחר מכן, שנה את ספריית העבודה לספריה המכילה את הסדרה שיש לנתח. הפעל את uTrack על-ידי הקלדת GUI של בורר סרטים במסוף והקשה על Enter. פעולה זו תגרום לחלון בחירת הסרט להיפתח.לחץ על לחצן סרט חדש והמתן עד שיופיע החלון הוספת סרט. לחץ על הוסף ערוץ כדי לבחור את הספריה עם הווידאו ולמלא את הפרמטרים של פרטי הסרט. הגדר את ספריית הפלט עבור התוצאות של uTrack לתוצאות ולאחר מכן לחץ על הגדרות ערוץ מתקדמות, מלא את הפרמטרים הקשורים לרכישה ושמור.לאחר יצירת הסרט, הקש על המשך בחלון בחירת הסרט. כאן, uTrack ישאל על סוג האובייקט שיש לנתח. בחר חלקיקים בודדים ולאחר מכן יופיע חלון לוח הבקרה.לאחר מכן, בחר את השלב הראשון, שלב 1:זיהוי, ולחץ על הגדרה. יופיע החלון 'התאמת מודל תערובת גאוסיאנית'. הזן את ההגדרות כפי שמוצג כאן ולאחר מכן הקש Apply.בלוח הבקרה, לחץ על הפעל כדי להפעיל את שלב הזיהוי. לאחר מספר דקות, בדוק את התוצאות על-ידי לחיצה על לחצן תוצאה. הסרט מראה עיגולים אדומים על החלקיקים שזוהו.אם לא מוצג עיגול אדום, שלב זה לא פעל כראוי ועליך לנסות שוב. עכשיו, למזג את החלקיקים שהיו רק זוהו לרצועות המשתרעות על פני מסגרות מרובות על ידי הגדרת תחילה את הפרמטרים כפי שמוצג כאן. לאחר מכן הקש על הפעל בלוח הבקרה.לאחר מכן, בצע ניתוח מסלול. הגדר את ההגדרות, כפי שמוצג כאן ולאחר מכן הקש על החל ו הפעל. אמת את התוצאות על-ידי לחיצה תחילה על לחצן תוצאה ולאחר מכן לחץ על הצג מספר רצועה של חלון אפשרויות הסרט ובדוק מסגרת אחר מסגרת שכל רצועה זוהתה כראוי, תוך סימון ידני של חלקיקים שאינם חלקיקים אמיתיים.ב- MATLAB, הזן את הפקודה כפי שמוצג כאן. פקודה זו תגרום לתוכנית לקרוא את כל המסלולים ול לחשב את מקדמי ההתפזרות. לאחר מכן, אל תכלול מסלולים המתאימים לנקודות או מסלולים שזוהו באופן שגוי על-ידי מתן רשימת הנקודות שלא ייכללו.חשב את מקדמי ההתפזרות המידיים עבור כל אחד מהרצועות של תא זה על-ידי ביצוע יחד בפרוטוקול הטקסט הנלווה. במקרה זה, לחשב את מקדם דיפוזיה עבור זמן-השהיה שווה 4 הנקרא D1 עד 4. בסיום, פרקו את המסלולים למסלולים קצרים וא long.כדי לנתח מסלולים ארוכים, הקלד את הפקודה כפי שמוצג כאן כדי לסווג את סוג התנועה דרך ספקטרום קנה המידה של הרגע שלהם. לנתח את העוצמה של כל חלקיק לאורך המסלול שלהם. קבע את התצורה של אופן פעולה בסיסי זה בדרכים רבות ושונות על-ידי ביצוע פעולה בפרוטוקול הטקסט הנלווה.לאחר מכן, לאסוף את המידע דיפוזיה ועוצמה עבור כל המסלולים. לאסוף רק את המידע דיפוזיה ועוצמה עבור מסלולים קצרים. לבסוף, אסוף את קנה המידה של ספקטרום הרגעים ואת מידע העוצמה על-ידי הקלדת הטקסט הבא, כאשר ארוכה הסיומת ששימשה קודם לכן.השימוש בטכניקות המתוארות בפרוטוקול זה מאפשר מעקב אוטומטי אחר חלקיקים שזוהו בסרטי מיקרוסקופיה פלואורסצנטיים וניתוח המאפיינים הדינמיים שלהם. מניתוח זה ניתן לקבל מאפיינים שונים המבוססים על וריאציות בגירויים. זה כולל, את אחוז כתמים immobile מבוסס על ארבעה גירויים שונים, אחוז מסלולים ארוכים של יותר מ 50 מסגרות, ואת סוגי התנועה לאורך המסלולים כפי מחולק על ידי תנועות מכוונות, חופשיות או מוגבלות.בנוסף, ניתן לקבוע את מקדם ההתפזרות, את התעצמות הנקודה הממוצעת ואת מספר הקולטנים לכל חלקיק. פעולה זו מציגה את התפלגות ערכי מקדם הדיפוזיה הקצרים עבור כל נקודה בתגובה לגירויים שונים. הקו האדום מייצג את הערך החציוני, גרף דומה זה מציג את התעצמות הנקודה הממוצעת עבור כל נקודה לאורך 20 המסגרות הראשונות שלה בתגובה לאותם גירויים.שוב, הקו האדום מייצג את ערך העוצמה הממוצע. כמו עוצמת תיקון ממוצע של נקודה קשורה עם מספר חלבונים פלואורסצנטיים נוכח במקום זה, אפשר לחשב ישירות את מספר הקולטנים לכל חלקיק, כפי שמוצג כאן. MATLAB היא שפת תכנות תלויית רישיות.באפשרותך לשנות את שמות המשתנים ביחס לשמות המתוארים בפרוטוקול זה, אך הקפד להיות עקבי במתן השמות שלך. אין אפשרות לשנות את שמות הפונקציות, ופסיקים, נקודתיים ונקודתיים למחצה חשובים לתחביר נכון. מיקרוסקופיה של מולקולה אחת מאפשרת הדמיה של חלבוני קרום בודדים ברזולוציה מרחבית-זמנית חסרת תקדים ומספקת הזדמנויות ייחודיות לחשוף היבטים בלתי צפויים של ביולוגיה של התא.פרוטוקולים אלה פותחים דלתות חדשות לניתוח כמותי של סרטוני מיקרוסקופיה בתאים וביולוגיה מולקולרית.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Intravital Microscopy of the Spleen: Quantitative Analysis of Parasite Mobility and Blood Flow

מיקרוסקופית Intravital של הטחול: ניתוח כמותי של ניידות טפיל ואת זרימת הדם

The advent of intravital microscopy in experimental rodent malaria models has allowed major advances to the knowledge of parasite-host interactions 1,2. ...

Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

מתא בודד ניתוח בצילוס subtilis Biofilms באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי ו cytometry זרימה

Biofilm formation is a general attribute to almost all bacteria 1-6. When bacteria form biofilms, cells are encased in extracellular matrix that is mostly ...

Antigens Protected Functional Red Blood Cells By The Membrane Grafting Of Compact Hyperbranched Polyglycerols

אנטיגנים מוגנים תאי דם אדומים פונקציונליים על ידי ההשתלה של ממברנה Polyglycerols Hyperbranched הקומפקטי

Red blood cell (RBC) transfusion is vital for the treatment of a number of acute and chronic medical problems such as thalassemia major and sickle cell ...

Fluorescence Microscopy Methods for Determining the Viability of Bacteria in Association with Mammalian Cells

שיטות מיקרוסקופית הקרינה לקביעת הכדאיות של חיידקים באיגוד עם תאי יונקים

Central to the field of bacterial pathogenesis is the ability to define if and how microbes survive after exposure to eukaryotic cells. Current protocols ...

Analysis of the Epithelial Damage Produced by Entamoeba histolytica Infection

Analysis of the Epithelial Damage Produced by Entamoeba histolytica Infection

ניתוח של נזק אפיתל הופק על ידי<em&gt; Histolytica Entamoeba</em&gt; זיהום

Entamoeba histolytica is the causative agent of human amoebiasis, a major cause of diarrhea and hepatic abscess in tropical countries. Infection is ...

Measuring Phagosome pH by Ratiometric Fluorescence Microscopy

מדידת pH Phagosome ידי ratiometric מיקרוסקופ פלואורסצנטי

Phagocytosis is a fundamental process through which innate immune cells engulf bacteria, apoptotic cells or other foreign particles in order to kill or ...

Cortical Actin Flow in T Cells Quantified by Spatio-temporal Image Correlation Spectroscopy of Structured Illumination Microscopy Data

קליפת המוח אקטין זרימה בתאי T לכמת ידי מתאם תמונת ספקטרוסקופיה מרחב ובזמן של תאורה מיקרוסקופית נתונים מובנים

Filamentous-actin plays a crucial role in a majority of cell processes including motility and, in immune cells, the formation of a key cell-cell ...

Preparation of CD4+ T Cells for Analysis of GD3 and GD2 Ganglioside Membrane Expression by Microscopy

Preparation of CD4+ T Cells for Analysis of GD3 and GD2 Ganglioside Membrane Expression by Microscopy

הכנת CD4<sup&gt; +</sup&gt; T תאים עבור ניתוח של ביטוי GD3 ו GD2 ganglioside ממברנה ידי מיקרוסקופית

The methods described herein for activation of na&#239;ve CD4+ T cells in suspension and their adherence in coverslips for confocal microscopy analysis ...

Molecular Diffusion in Plasma Membranes of Primary Lymphocytes Measured by Fluorescence Correlation Spectroscopy

דיפוזיה מולקולרית פלזמה ממברנות יסודי לימפוציטים נמדד באמצעות מתאם ספקטרוסקופיה פלואורסצנטי

Fluorescence correlation spectroscopy (FCS) is a powerful technique for studying the diffusion of molecules within biological membranes with high spatial ...