Name: image processing protocol for the analysis of the diffusion and cluster size of membrane receptors by fluorescence microscopy
Uploaded: 2019-04-09T14:30:00
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Siamo grati a Carlo Manzo e Maria García Parajo per la loro guida e il codice sorgente dell'analisi del coefficiente di diffusione. Questo lavoro è stato sostenuto in parte da sovvenzioni dal Ministero spagnolo della scienza, innovazione e Università (SAF 2017-82940-R) e il programma RETICS dell'Instituto de salud Carlos III (RD12/0009/009 e RD16/0012/0006; RIER). LMM e JV sono supportati dal programma COMFUTURO del CSIC Fondazione generale.

1. preparazione dei campioni biologici
<ol><li>Crescere le cellule Jurkat in RPMI 1640 supplementato con 10% FCS, NaPyr e L-Glutammina (RPMI completo). Cellule di Electroporate Jurkat (20 x 106 cellule/400 µ l di RPMI 1640 con 10% FCS) con un vettore di ricevitore di chemokine GFP-etichettata monomerico (CXCR4-AcGFP, 20 μg) per consentire il rilevamento utilizzando la microscopia a fluorescenza. Nota: È possibile utilizzare altre proteine fluorescenti monomerici come mCherry, mScarlet,...

<ol>
	<li>Yu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+studies+in+live+cells.">Single-molecule studies in live cells.</a> Annual Review of Pysical Chemistry. 67 (565-585), (2016).</li><li>Mattheyses, A. L., Simon, S. M., Rappoport, J. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+with+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy+for+the+cell+biologist.">Imaging with total internal reflection fluorescence microscopy for the cell biologist.</a> Journal of Cell Science. 123 (Pt 21), 3621-3628 (2010).</li><li>Jaqaman, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+single-particle+tracking+in+live-cell+time-lapse+sequences.">Robust single-particle tracking in live-cell time-lapse sequences.</a> Nature Methods. 5 (8), 695-702 (2008).</li><li>Bakker, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lateral+mobility+of+individual+integrin+nanoclusters+orchestrates+the+onset+for+leukocyte+adhesion.">Lateral mobility of individual integrin nanoclusters orchestrates the onset for leukocyte adhesion.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 109 (13), 4869-4874 (2012).</li><li>Kusumi, A., Sako, Y., Yamamoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confined+lateral+diffusion+of+membrane+receptors+as+studied+by+single+particle+tracking+(nanovid+microscopy).+Effects+of+calcium-induced+differentiation+in+cultured+epithelial+cells.">Confined lateral diffusion of membrane receptors as studied by single particle tracking (nanovid microscopy). Effects of calcium-induced differentiation in cultured epithelial cells.</a> Biophysical Journal. 65 (5), 2021-2040 (1993).</li><li>Ferrari, R. M., Manfroi, A. J., Young, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strongly+and+weakly+self-similar+diffusion.">Strongly and weakly self-similar diffusion.</a> Physica D. 154, 111-137 (2001).</li><li>Sbalzarini, I. F., Koumoutsakos, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feature+point+tracking+and+trajectory+analysis+for+video+imaging+in+cell+biology.">Feature point tracking and trajectory analysis for video imaging in cell biology.</a> Journal of Structural Biology. 151 (2), 182-195 (2005).</li><li>Ewers, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-particle+tracking+of+murine+polyoma+virus-like+particles+on+live+cells+and+artificial+membranes.">Single-particle tracking of murine polyoma virus-like particles on live cells and artificial membranes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 102 (42), 15110-15115 (2005).</li><li>Manzo, C., Garcia-Parajo, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+progress+in+single+particle+tracking:+from+methods+to+biophysical+insights.">A review of progress in single particle tracking: from methods to biophysical insights.</a> Report on Progress in Physics. 78 (12), 124601 (2015).</li><li>Calebiro, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+analysis+of+fluorescently+labeled+G-protein-coupled+receptors+reveals+complexes+with+distinct+dynamics+and+organization.">Single-molecule analysis of fluorescently labeled G-protein-coupled receptors reveals complexes with distinct dynamics and organization.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 110 (2), 743-748 (2013).</li><li>Digman, M. A., Dalal, R., Horwitz, A. F., Gratton, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+the+number+of+molecules+and+brightness+in+the+laser+scanning+microscope.">Mapping the number of molecules and brightness in the laser scanning microscope.</a> Biophysical Journal. 94 (6), 2320-2332 (2008).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Martinez-Munoz, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separating+Actin-Dependent+Chemokine+Receptor+Nanoclustering+from+Dimerization+Indicates+a+Role+for+Clustering+in+CXCR4+Signaling+and+Function.">Separating Actin-Dependent Chemokine Receptor Nanoclustering from Dimerization Indicates a Role for Clustering in CXCR4 Signaling and Function.</a> Molecular Cell. 70 (1), 106-119 (2018).</li><li>Destainville, N., Salome, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+and+correction+of+systematic+errors+due+to+detector+time-averaging+in+single-molecule+tracking+experiments.">Quantification and correction of systematic errors due to detector time-averaging in single-molecule tracking experiments.</a> Biophysical Journal. 90 (2), L17-L19 (2006).</li></ol>

Il metodo descritto è facile da eseguire anche senza avere alcuna precedente esperienza di lavoro con Matlab. Tuttavia, la routine di Matlab estremamente richiedono precisione con la nomenclatura dei comandi diversi e la localizzazione delle diverse cartelle impiegato dal programma. Di rilevamento routine di analisi (passaggio 3), più parametri possono essere modificati. La finestra "Impostazione gaussiana-miscela modello raccordo" (punto 3.8) controlla come U-traccia rileverà singole particelle sul video. Questo vien...

Proteine di membrana incorporati nel bilayer del lipido sono in continuo movimento a causa di diffusione termica. Le dinamiche sono essenziali per regolare le risposte cellulari, come interazioni intermolecolari permettono la formazione di complessi che variano nel formato da monomeri di oligomeri e influenzare la stabilità di complessi di segnalazione. Chiarire i meccanismi che controllano la dinamica della proteina è dunque una nuova sfida in biologia cellulare, necessaria per comprendere le vie di trasduzione del segnale e per identificare le funzioni delle cellule imprevisti.
Alcuni metodi ottici sono stati sviluppati per lo studio di queste interazioni in vivo le cellule1. Tra questi, microscopia a fluorescenza (TIRF) riflessione interna totale, sviluppata nei primi anni 1980, permette lo studio delle interazioni molecolari o molto vicino alla membrana cellulare2. Per studiare i parametri dinamici di traiettorie di proteine di membrana ottenuti dai dati di TIRF in cellule viventi, una singola particella inseguimento del metodo (SPT) è richiesta. Anche se diversi algoritmi sono disponibili per questo, utilizziamo attualmente quelli pubblicati da Jaqaman et al.3 che indirizzo eterogeneità di movimento delle particelle in un campo di particelle dense collegando particelle tra fotogrammi consecutivi per collegare la traccia risultante segmenti in traiettorie complete (scomparsa temporanea delle particelle). Il software acquisisce la particella Unione e divisione di quel risultato da aggregazione e dissociazione eventi3. Uno dei dati di output di questo software è rilevamento delle particelle lungo l'intera traiettoria definendo le posizioni X e Y in ogni fotogramma.
Una volta che le particelle vengono rilevate, applichiamo diversi algoritmi per determinare l'intervallo breve diffusione coefficiente (D1-4)4,5. Applicando l'analisi di8 7,6,momento Scaling spettro (MSS) o inserendo il valore di 'alpha' di regolazione della cilindrata di Mean Square (MSD) alla curva9, classifichiamo anche le particelle secondo il tipo di traiettoria.
Analisi di spot intensità nelle immagini di fluorescenza sono un obiettivo condiviso per gli scienziati nel campo10,11. L'algoritmo più comune utilizzato è il cosiddetto numero e luminosità. Questo metodo tuttavia non consente rilevamento corretto frame-by-frame intensità in particelle nella frazione del mobile. Abbiamo, quindi, generato un nuovo algoritmo per valutare queste particelle intensità frame-by-frame e per determinare il loro stato di aggregazione. Una volta le coordinate di ogni particella vengono rilevate utilizzando U-Track2 software3, definiamo la sua intensità in ogni fotogramma sopra la traiettoria completa, tenendo conto anche lo sfondo della cella in ogni fotogramma. Questo software offre diverse possibilità per determinare l'intensità di spot e lo sfondo della cella e, utilizzando proteine note monomeriche e dimeriche come riferimenti, calcola il numero approssimativo delle proteine della particella rilevato (dimensione del cluster).
In questo articolo, descriviamo una guida attenta per eseguire questi tre passi: 1) rilevazione e monitoraggio delle singole particelle lungo un video di microscopia di fluorescenza usando U-traccia; 2) analizzare il coefficente di diffusione istantanea (D1-4) di quelle particelle e al tipo di movimento (confinato, gratuito o diretto) di particelle con lunghe traiettorie di MSS; 3) misurando l'intensità posto lungo il video rettificato da fluorescenza di fondo stimato per ogni spot. Questo consente di stima delle dimensioni cluster e identificazione dei passaggi photobleaching.
L'utilizzo di questo protocollo non richiede competenze specialistiche e può essere eseguita in qualsiasi laboratorio con coltura cellulare, strutture di microscopia e citometria di flusso. Il protocollo utilizza ImageJ o Fiji (una distribuzione di ImageJ12), U-traccia3e alcune routine di hoc fatta di annuncio (http://i2pc.es/coss/Programs/protocolScripts.zip). U-traccia e ad hoc routine eseguite su Matlab che può essere installato in qualsiasi computer compatibile.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:797px;" width="797">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">Human Jurkat cells</td>
			<td style="width:203px;">ATCC</td>
			<td style="width:203px;">CRL-10915</td>
			<td style="width:171px;">Human T cell line. Any other cell type can be analyzed with this software</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:221px;">pAcGFPm-N1 (PT3719-5)DNA3GFP</td>
			<td style="width:203px;">Clontech</td>
			<td style="width:203px;">632469</td>
			<td>Different fluorescent proteins can be followed and analyzed with this routine</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:221px;">Gene Pulse X Cell electroporator&#160;</td>
			<td>BioRad&#160;</td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td>We use 280V, 975 mF, for Jurkat cells.&#160; Use the transfection method best working in your hands.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cytomics FC 500 flow cytometer&#160;</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MoFlo Astrios Cell Sorter&#160;</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td>Depending on the level of transfection, cell sorting may not be required.&#160; You can also employ cells with stable expression of adequate levels of the receptor of interest.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">Dako Qifikit</td>
			<td style="width:203px;">DakoCytomation</td>
			<td style="width:203px;">K0078</td>
			<td>Used for quantification the number of receptors in the cell surface.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">Glass bottom microwell dishes</td>
			<td style="width:203px;">MatTek corporation</td>
			<td style="width:203px;">P35G-1.5-10-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:221px;">Human Fibronectin from plasma</td>
			<td style="width:203px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:203px;">F0895</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">Recombinant human CXCL12</td>
			<td style="width:203px;">PeproTech</td>
			<td style="width:203px;">300928A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">Inverted Leica AM TIRF</td>
			<td style="width:203px;">Leica</td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">EM-CCD camera</td>
			<td style="width:203px;">Andor&#160;</td>
			<td style="width:203px;">DU 885-CSO-#10-VP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">MATLAB</td>
			<td style="width:203px;">The MathWorks, Natick, MA</td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">U-Track2 software</td>
			<td style="width:203px;">Danuser Laboratory</td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">ImageJ</td>
			<td style="width:203px;">NIH</td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td>https://imagej.nih.gov/ij/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">FiJi</td>
			<td style="width:203px;">FiJI</td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td>https://imagej.net/Fiji)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">u-Track2 software</td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td>Matlab tool.&#160; For installing, download .zip file from the web page (http://lccb.hms.harvard.edu/software.html) and uncompress the file in a directory of your choice</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">GraphPad Prism</td>
			<td style="width:203px;">GraphPad software</td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

image processing protocol for the analysis of the diffusion and cluster size of membrane receptors by fluorescence microscopy

Monitoraggio su una sequenza video e l'analisi posteriore dei loro traiettorie delle particelle al giorno d'oggi sono un'operazione comune a molti studi biologici. Utilizzando l'analisi del ricevitore della membrana cellulare cluster come un modello, vi presentiamo un protocollo dettagliato per questa attività di analisi di immagine utilizzando Fiji (ImageJ) e routine di Matlab per: 1) definire le aree di interesse e progettare maschere adattate a queste regioni; 2) traccia le particelle in video microscopia di fluorescenza; 3) analizzare le caratteristiche di diffusione e l'intensità dei brani selezionati. I tipi di movimento e la dimensione dei cluster, analisi quantitativa dei coefficienti di diffusione ottenuta mediante microscopia a fluorescenza ed elaborazione di immagini fornisce un valido strumento per determinare oggettivamente particelle dinamiche e le conseguenze della modifica condizioni ambientali. In questo articolo presentiamo protocolli dettagliati per l'analisi di queste caratteristiche. Il metodo descritto qui non solo permette la rilevazione di rilevamento di singola molecola, ma consente anche di automatizzare la stima dei parametri di diffusione laterale alla membrana delle cellule, classifica il tipo di traiettoria e consente analisi completa superando così il Difficoltà a quantificare la dimensione dello spot sulla sua intera traiettoria alla membrana delle cellule.

L'utilizzo di questo protocollo consente il rilevamento automatizzato delle particelle rilevato nel film di microscopia di fluorescenza e l'analisi delle loro caratteristiche dinamiche. Inizialmente, le cellule transfected con la proteina fluorescente-accoppiato di cui tenere traccia. Il livello appropriato di recettori presenta sulla superficie delle cellule che permette che SPT è ottenuta dalla cella ordinamento (Figura 1). Celle selezionate vengono analiz...

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Image Processing Protocol for the Analysis of the Diffusion and Cluster Size of Membrane Receptors by Fluorescence Microscopy

Elaborazione di protocollo per l'analisi della diffusione e dimensione dei Cluster di recettori di membrana mediante microscopia a fluorescenza

Qui, presentiamo un protocollo per singola particella monitoraggio analisi delle immagini che permette la valutazione quantitativa dei coefficenti di diffusione, tipi di movimento e cluster di dimensioni delle singole particelle rilevate mediante microscopia a fluorescenza.

Particle tracking on a video sequence and the posterior analysis of their trajectories is nowadays a common operation in many biological studies. Using ...

Le nuove tecniche di microscopia richiedono lo sviluppo di strumenti adeguati per la corretta comprensione dei processi biologici studiati. Questo protocollo descrive le fasi di elaborazione delle immagini necessarie per il tracciamento a singola molecola, inclusa la stima dei parametri di diffusione laterale e la quantificazione delle dimensioni dello spot sull'intera traiettoria nella membrana cellulare. Questo protocollo combina l'uso di diverse parti software, tra cui ImageJ, MATLAB e uTrack, così come alcune proteine che sono state sviluppate specificamente per questo protocollo.Questo metodo è illustrato con il tracciamento dei recettori a membrana sotto microscopia ottica, ma può essere applicato a qualsiasi struttura simile a particelle le cui traiettorie possono essere tracciate nel tempo in una sequenza video. Questa tecnica si riferisce alla ricerca di base e non ha applicazione diretta in un ambiente clinico. Tuttavia, può essere utilizzato per aiutare nella caratterizzazione di eventi biologici sia in diverse malattie che quindi nell'identificazione di nuovi obiettivi terapeutici.Questo protocollo è rilevante per il tracciamento delle particelle nelle membrane cellulari, come mostrato in questo video, ma può anche essere applicato per il tracciamento di cellule complete, batteri, nanoparticelle in un fluido o qualsiasi altro oggetto il cui centro può essere ben determinato. Questo protocollo è intuitivo e richiede solo la conoscenza della coltura cellulare e delle tecniche di microscopia. Le diverse tecniche e strumenti informatici utilizzati in questo protocollo possono intimidire un nuovo utente.La dimostrazione visiva aiuta a utilizzare questa tecnica con sicurezza. Per iniziare, far crescere le cellule di Jurkat, trasfetterle con un vettore recettore della chemiochina etichettato GFP monomerico e selezionare le cellule con bassi livelli di espressione del vettore etichettato, come descritto nel protocollo di testo di accompagnamento. Aggiungere i supporti contenenti il ligando CXCL12 o il supporto di controllo a ciascuna stoviglie microwell con fondo di vetro da 35 millimetri rivestite con fibronectina e incubare per un'ora a 37 gradi Celsius.Quindi, aggiungere le cellule ordinate a ogni piatto e incubare per 20 minuti prima di imaging delle cellule. Dopo l'incubazione, trasferire il primo piatto di cellule in uno stadio di microscopio TIRF e passare all'obiettivo di immersione dell'olio 100x. Individuare e mettere a fuoco le celle utilizzando un campo luminoso per ridurre al minimo gli effetti di fotobleaching.Quindi passare alla modalità TIRF ed eseguire una regolazione a fuoco fine utilizzando una bassa intensità laser. Acquisire filmati di circa 50 secondi di lunghezza, riducendo al minimo l'intervallo di tempo tra i fotogrammi. Per ogni file video di condizione sperimentale, creare una nuova cartella seguendo le indicazioni sulla struttura dei file descritte nel protocollo di testo di questo video.Aprire il video con Fiji o ImageJ trascinando e rilasciando il file sulla barra dei menu delle Fiji e fare clic su OK per importare il file LIF utilizzando i bioformati. Per progettare una maschera, importare anche l'immagine multicanale corrispondente. Quindi, crea una maschera creando prima una singola immagine con i canali utili per la progettazione della maschera.Selezionate Immagine (Image) nel menu della barra e fate clic su Colore (Color) seguito da Dividi canali (Split Channels) per visualizzare i diversi canali come immagini separate. Unire nuovamente i tre canali in una singola immagine selezionando Immagine nel menu della barra, andando su Colore e selezionando Unisci canali. Assicurarsi di selezionare i canali appropriati e quindi premere OK per generare una nuova immagine non in pila.Sincronizzare le due finestre andando al menu della barra, selezionando Analizza e quindi andando a Strumenti e selezionando Sincronizza Windows. Verrà visualizzata una nuova finestra con le possibilità di immagine sincronizzate. Ora, con le due finestre sincronizzate, è possibile ritagliare la stessa area in entrambe le finestre.Passare a Immagine nel menu della barra e selezionare Ritaglia. Con lo strumento di selezione rettangolare, disegna la regione di interesse. Le due immagini ritagliate verranno mostrate singolarmente.Quindi, annullare la sincronizzazione di entrambe le finestre. Se non è stata creata alcuna maschera, disegnare l'area di interesse con lo strumento di selezione e il ritaglio. Successivamente, salvate il video come sequenza di immagini nella directory Videosec.Quindi selezionare l'immagine multicanale, passare a Plugin nel menu e selezionare Editor segmentazione per aprire il plug-in dell'editor di segmentazione. Scegliete lo strumento di selezione a mano libera e usatelo per selezionare un'etichetta verde e progettare la maschera più esterna. Una volta progettato, premi il pulsante Più nell'opzione di selezione della finestra composita e la maschera selezionata verrà visualizzata sul visualizzatore.Ripetere questo passaggio per tutte le etichette. Una volta progettate tutte le maschere, salvare la maschera con lo stesso nome di file del video, con il nome:mask.tif. Aprite MATLAB e aggiungete la directory uTrack al percorso andando a Imposta tracciato (Set Path) e selezionando Aggiungi con (Add With).Quindi, modificare la directory di lavoro nella directory contenente la serie da analizzare. Richiamare uTrack digitando l'interfaccia utente grafica del selettore filmato nella console e premendo INVIO. In questo modo verrà aperta la finestra di selezione del filmato.Premere il pulsante Nuovo filmato e attendere la visualizzazione della finestra Aggiunta filmato. Premere Su Aggiungi canale per scegliere la directory con il video e compilare i parametri delle informazioni del filmato. Impostare la directory di output per i risultati di uTrack su Risultati, quindi premere Impostazioni canale avanzate, riempire i parametri relativi all'acquisizione e salvare.Dopo aver creato il filmato, premete Continua nella finestra di selezione del filmato. Qui, uTrack chiederà il tipo di oggetto da analizzare. Selezionate Particelle singole (Single Particles) e quindi apparirà la finestra del pannello di controllo.Selezionare quindi il primo passaggio, Passaggio 1:Rilevamento, quindi fare clic su Impostazione. Verrà visualizzata la finestra Impostazione raccordo modello miscela gaussiana (Setting Gaussian Mixture Model Fitting). Immettere le impostazioni visualizzate qui e quindi premere Applica.Nel Pannello di controllo fare clic su Esegui per eseguire il passaggio di rilevamento. Dopo alcuni minuti, controllare i risultati premendo il pulsante Risultato. Il filmato mostra cerchi rossi sulle particelle rilevate.Se non viene mostrato alcun cerchio rosso, questo passaggio non ha funzionato correttamente e dovresti riprovare. Ora, unisci le particelle che sono state appena rilevate in tracce che si estendono su più fotogrammi impostando prima i parametri come mostrato qui. Quindi premere Esegui nel Pannello di controllo.Eseguire quindi analisi delle tracce. Definire le impostazioni, come illustrato di seguito, quindi premere Applica ed Esegui. Verificare i risultati premendo prima il pulsante Risultato, quindi fare clic su Mostra numero traccia della finestra delle opzioni filmato e controllare fotogramma per fotogramma che ogni traccia è stata identificata correttamente, contrassegnando manualmente particelle che non sono particelle vere.In MATLAB, immettete il comando come mostrato qui. Questo comando farà sì che il programma legga tutte le traiettorie e calcoli i coefficienti di diffusione. Quindi, escludete le traiettorie corrispondenti a punti o traiettorie identificati in modo errato fornendo l'elenco di punti da escludere.Calcolare i coefficienti di diffusione istantanea per ciascuna delle tracce di questa cella seguendo il protocollo di testo che lo accompagna. In questo caso, calcolare il coefficiente di diffusione per un lag di tempo è uguale a 4 chiamato da D1 a 4. Al termine, scomporte le traiettorie in traiettorie brevi e lunghe.Per analizzare traiettorie lunghe, digitate il comando come mostrato qui per classificare il tipo di movimento attraverso il loro spettro di ridimensionamento del momento. Analizza l'intensità di ogni particella lungo la loro traiettoria. Configurare questo comportamento di base in molti modi diversi seguendo il protocollo di testo allegato.Quindi, raccogliere le informazioni sulla diffusione e sull'intensità per tutte le traiettorie. Raccogliere solo le informazioni sulla diffusione e sull'intensità per traiettorie brevi. Infine, raccogli il ridimensionamento dello spettro del momento e le informazioni sull'intensità digitando quanto segue, dove long è il suffisso usato in precedenza.L'utilizzo delle tecniche descritte in questo protocollo consente il tracciamento automatizzato delle particelle rilevate nei filmati di microscopia a fluorescenza e l'analisi delle loro caratteristiche dinamiche. Da questa analisi, si possono ottenere caratteristiche diverse in base alle variazioni negli stimoli. Ciò include la percentuale di macchie immobili basate su quattro diversi stimoli, la percentuale di traiettorie lunghe superiori a 50 fotogrammi e i tipi di movimento lungo le traiettorie come spezzati da movimenti diretti, liberi o confinati.Inoltre, è possibile determinare il coefficiente di diffusione, le intensità media spot e il numero di recettori per particella. Questo mostra la distribuzione dei valori del coefficiente di diffusione breve per ogni punto in risposta a diversi stimoli. La linea rossa rappresenta il valore mediano, questo grafico simile mostra le intensità del punto medio per ogni punto lungo i suoi primi 20 fotogrammi in risposta agli stessi stimoli.Ancora una volta, la linea rossa rappresenta il valore di intensità media. Poiché l'intensità corretta media di un punto è correlata al numero di proteine fluorescenti presenti in questo punto, si può calcolare direttamente il numero di recettori per particella, come mostrato qui. MATLAB è un linguaggio di programmazione con la fascienza di maiuscole e minuscole.È possibile variare i nomi delle variabili rispetto a quelli descritti in questo protocollo, ma assicurarsi di essere coerenti nella denominazione. I nomi delle funzioni non possono essere modificati e virgole, due punti e punti e punti e virgola sono importanti per una sintassi corretta. La microscopia a singola molecola consente la visualizzazione di singole proteine di membrana con una risoluzione spazio-temporale senza precedenti e offre opportunità uniche per rivelare aspetti imprevisti della biologia cellulare.Questi protocolli aprono nuove porte per l'analisi quantitativa dei video di microscopia nelle cellule e nella biologia molecolare.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Intravital Microscopy of the Spleen: Quantitative Analysis of Parasite Mobility and Blood Flow

Microscopia intravitale della Milza: analisi quantitativa della mobilità Parasite e del flusso sanguigno

The advent of intravital microscopy in experimental rodent malaria models has allowed major advances to the knowledge of parasite-host interactions 1,2. ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

Singola cella Analisi Bacillus subtilis I biofilm usando la microscopia a fluorescenza e citometria a flusso

Biofilm formation is a general attribute to almost all bacteria 1-6. When bacteria form biofilms, cells are encased in extracellular matrix that is mostly ...

Antigens Protected Functional Red Blood Cells By The Membrane Grafting Of Compact Hyperbranched Polyglycerols

Gli antigeni Protetto funzionali globuli rossi dalla membrana innesto di Compact Poligliceroli Hyperbranched

Red blood cell (RBC) transfusion is vital for the treatment of a number of acute and chronic medical problems such as thalassemia major and sickle cell ...

Fluorescence Microscopy Methods for Determining the Viability of Bacteria in Association with Mammalian Cells

Microscopia a fluorescenza metodi per determinare la vitalità di batteri in associazione con cellule di mammifero

Central to the field of bacterial pathogenesis is the ability to define if and how microbes survive after exposure to eukaryotic cells. Current protocols ...

Analysis of the Epithelial Damage Produced by Entamoeba histolytica Infection

Analysis of the Epithelial Damage Produced by Entamoeba histolytica Infection

Analisi del danno epiteliale Prodotto da<em&gt; Entamoeba histolytica</em&gt; Infezione

Entamoeba histolytica is the causative agent of human amoebiasis, a major cause of diarrhea and hepatic abscess in tropical countries. Infection is ...

Measuring Phagosome pH by Ratiometric Fluorescence Microscopy

Misurare phagosome pH Raziometrico microscopia a fluorescenza

Phagocytosis is a fundamental process through which innate immune cells engulf bacteria, apoptotic cells or other foreign particles in order to kill or ...

Cortical Actin Flow in T Cells Quantified by Spatio-temporal Image Correlation Spectroscopy of Structured Illumination Microscopy Data

Corticale actina di flusso in cellule T quantificati da spazio-temporale Correlazione Immagine Spettroscopia di Structured Illuminazione Microscopia dati

Filamentous-actin plays a crucial role in a majority of cell processes including motility and, in immune cells, the formation of a key cell-cell ...

Preparation of CD4+ T Cells for Analysis of GD3 and GD2 Ganglioside Membrane Expression by Microscopy

Preparation of CD4+ T Cells for Analysis of GD3 and GD2 Ganglioside Membrane Expression by Microscopy

Preparazione di CD4<sup&gt; +</sup&gt; Le cellule T per l&#39;analisi di GD3 e GD2 Gangliosidi membrana Expression al microscopio

The methods described herein for activation of na&#239;ve CD4+ T cells in suspension and their adherence in coverslips for confocal microscopy analysis ...

Molecular Diffusion in Plasma Membranes of Primary Lymphocytes Measured by Fluorescence Correlation Spectroscopy

Diffusione molecolare nel plasma membrane dei linfociti primari misurati da Fluorescence Correlation Spectroscopy

Fluorescence correlation spectroscopy (FCS) is a powerful technique for studying the diffusion of molecules within biological membranes with high spatial ...