Name: image processing protocol for the analysis of the diffusion and cluster size of membrane receptors by fluorescence microscopy
Uploaded: 2019-04-09T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Image Processing Protocol for the Analysis of the Diffusion and Cluster Size of Membrane Receptors by Fluorescence Microscopy at JoVE.com

우리는 카를로 Manzo와 마리아 가르시아 Parajo 확산 계수 분석의 그들의 도움과 소스 코드에 대 한 감사입니다. 이 작품은 과학 스페인 교육부, 혁신 및 대학 (SAF 2017-82940-R)에서 교부 금에 의해 부분적으로 지원 및 기관 드 건배 카를로스 3 세 (RD12/0009/009와 RD16/0012/0006;의 RETICS 프로그램 RIER)입니다. LMM 및 JV Fundación 일반 CSIC의 COMFUTURO 프로그램에 의해 지원 됩니다.

1입니다. 생물 샘플의 준비
<ol><li>10 %fcs 보충 RPMI 1640 매체에 Jurkat 세포 성장 NaPyr 및 L-글루타민 (완전 한 RPMI). Electroporate Jurkat 세포 (20 x 106 셀/400 µ L 10% fcs RPMI 1640의) 단위체 GFP 표시 chemokine 수용 체 벡터 (CXCR4-AcGFP, 20 μ g) 형광 현미경 검사 법을 사용 하 여 그것의 탐지를 허용 하도록. 참고: 그것은 mCherry, mScarlet, 등 등과 같은 다른 단위체 형광 단백질을 사용 하 여 수 있습니...

<ol>
	<li>Yu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+studies+in+live+cells.">Single-molecule studies in live cells.</a> Annual Review of Pysical Chemistry. 67 (565-585), (2016).</li><li>Mattheyses, A. L., Simon, S. M., Rappoport, J. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+with+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy+for+the+cell+biologist.">Imaging with total internal reflection fluorescence microscopy for the cell biologist.</a> Journal of Cell Science. 123 (Pt 21), 3621-3628 (2010).</li><li>Jaqaman, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+single-particle+tracking+in+live-cell+time-lapse+sequences.">Robust single-particle tracking in live-cell time-lapse sequences.</a> Nature Methods. 5 (8), 695-702 (2008).</li><li>Bakker, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lateral+mobility+of+individual+integrin+nanoclusters+orchestrates+the+onset+for+leukocyte+adhesion.">Lateral mobility of individual integrin nanoclusters orchestrates the onset for leukocyte adhesion.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 109 (13), 4869-4874 (2012).</li><li>Kusumi, A., Sako, Y., Yamamoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confined+lateral+diffusion+of+membrane+receptors+as+studied+by+single+particle+tracking+(nanovid+microscopy).+Effects+of+calcium-induced+differentiation+in+cultured+epithelial+cells.">Confined lateral diffusion of membrane receptors as studied by single particle tracking (nanovid microscopy). Effects of calcium-induced differentiation in cultured epithelial cells.</a> Biophysical Journal. 65 (5), 2021-2040 (1993).</li><li>Ferrari, R. M., Manfroi, A. J., Young, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strongly+and+weakly+self-similar+diffusion.">Strongly and weakly self-similar diffusion.</a> Physica D. 154, 111-137 (2001).</li><li>Sbalzarini, I. F., Koumoutsakos, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feature+point+tracking+and+trajectory+analysis+for+video+imaging+in+cell+biology.">Feature point tracking and trajectory analysis for video imaging in cell biology.</a> Journal of Structural Biology. 151 (2), 182-195 (2005).</li><li>Ewers, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-particle+tracking+of+murine+polyoma+virus-like+particles+on+live+cells+and+artificial+membranes.">Single-particle tracking of murine polyoma virus-like particles on live cells and artificial membranes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 102 (42), 15110-15115 (2005).</li><li>Manzo, C., Garcia-Parajo, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+progress+in+single+particle+tracking:+from+methods+to+biophysical+insights.">A review of progress in single particle tracking: from methods to biophysical insights.</a> Report on Progress in Physics. 78 (12), 124601 (2015).</li><li>Calebiro, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+analysis+of+fluorescently+labeled+G-protein-coupled+receptors+reveals+complexes+with+distinct+dynamics+and+organization.">Single-molecule analysis of fluorescently labeled G-protein-coupled receptors reveals complexes with distinct dynamics and organization.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 110 (2), 743-748 (2013).</li><li>Digman, M. A., Dalal, R., Horwitz, A. F., Gratton, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+the+number+of+molecules+and+brightness+in+the+laser+scanning+microscope.">Mapping the number of molecules and brightness in the laser scanning microscope.</a> Biophysical Journal. 94 (6), 2320-2332 (2008).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Martinez-Munoz, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separating+Actin-Dependent+Chemokine+Receptor+Nanoclustering+from+Dimerization+Indicates+a+Role+for+Clustering+in+CXCR4+Signaling+and+Function.">Separating Actin-Dependent Chemokine Receptor Nanoclustering from Dimerization Indicates a Role for Clustering in CXCR4 Signaling and Function.</a> Molecular Cell. 70 (1), 106-119 (2018).</li><li>Destainville, N., Salome, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+and+correction+of+systematic+errors+due+to+detector+time-averaging+in+single-molecule+tracking+experiments.">Quantification and correction of systematic errors due to detector time-averaging in single-molecule tracking experiments.</a> Biophysical Journal. 90 (2), L17-L19 (2006).</li></ol>

설명된 방법을 Matlab 함께 어떤 이전 경험을 필요 없이 수행 하기 쉽습니다. 그러나, Matlab 루틴 매우 다른 명령의 명칭 및 프로그램에 의해 고용 된 다른 폴더의 지역화와 정확성이 필요 합니다. 추적에서 분석 루틴 (3 단계), 여러 개의 매개 변수를 수정할 수 있습니다. "설정 가우스 혼합 모델 피팅" 창 (단계 3.8) U-트랙 비디오에 단일 입자 감지 방법을 제어 합니다. 이 피팅 가우스 혼합 모델<sup class=...

막 단백질 지질 bilayer에 포함 된 열 확산으로 지속적인 운동에 있습니다. Intermolecular 상호 작용 올리고 단위체에서 크기에서 변화 하 고 신호 복합물의 안정성에 영향을 단지의 형성으로 그들의 역학 세포 응답 통제에 필수적입니다. 단백질 역학을 제어 하는 메커니즘을 elucidating 따라서 세포 생물학, 신호 전달 경로 이해 하 고 예기치 않은 셀 기능을 식별 하는 데 필요한 새로운 도전 이다.
일부 광 방법은 개발 되었다1셀 생활에 이러한 상호 작용을 공부 하. 이러한 가운데, 총 내부 반사 형광 (TIRF) 현미경 검사 법, 1980 년대 초에 개발 또는 세포 막2근처 매우 분자 상호 작용의 연구를 수 있습니다. 공부 하 고 살아있는 세포에 TIRF 데이터에서 가져온 막 단백질 궤적의 동적 매개 변수, 단일 입자 추적 방법 (SPT)가 필요 합니다. 여러 알고리즘이 사용할 수 있습니다, 있지만 우리 현재 Jaqaman 외.3 는 입자 결과 트랙을 연결 하려면 연속 프레임 사이 연결 하 여 입자 모션이 조밀한 입자 필드에 의해 그 사용 완전 한 궤도 (임시 입자 실종)에 세그먼트. 소프트웨어를 병합 하 고 그 결과 집계 및 분리 이벤트3에서 분할 입자를 캡처합니다. 이 소프트웨어의 출력 데이터 중 하나는 각 프레임에서 그들의 X 및 Y 위치를 정의 하 여 전체 궤적에 따라 입자의 탐지 이다.
일단 입자 감지, 우리 짧은 timelag 확산 계수 (D1-4),45를 확인 하려면 다른 알고리즘을 적용 합니다. 순간 확장 스펙트럼 (MSS)6,,78 분석을 적용 하거나 조정 곡선9제곱 변위 (MSD)의 '알파' 값을 피팅, 우리도에 따라 입자 분류 궤도의 유형입니다.
형광 이미지 자리 강도 분석 필드10,11에 과학자에 대 한 공유 목표 이다. 사용 되는 가장 일반적인 알고리즘은 소위 수와 밝기. 이 메서드는 그럼에도 불구 하 고 모바일 분수에서 입자에 올바른 프레임으로 프레임 강도 감지를 허용 하지 않습니다. 따라서, 이러한 입자 농도-의해-프레임을 평가 하 고 그들의 집계 상태를 결정 하는 새로운 알고리즘을 생성, 되었습니다. 각 입자의 좌표 U-Track2 소프트웨어3를 사용 하 여 감지, 일단 정의 강도 각 프레임에 완전 한 궤도 통해 각 프레임에서 셀 배경은 고려도 합니다. 이 소프트웨어 자리 강도 및 셀 배경 결정 하는 다른 가능성을 제공 하 고, 입자 감지 (클러스터 크기)에 있는 단백질의 대략적인 수를 계산 합니다 참조로 알려진된 단위체와 dimeric 단백질을 사용 하 여.
이 문서에서는 이러한 세 단계를 수행 하는 주의 가이드 설명: 1) 검색 및 U-트랙;를 사용 하 여 형광 현미경의 비디오에 따라 단일 입자 추적 2) MSS; 여 긴 궤적을 가진 입자의 움직임 (밀폐, 무료, 또는 감독)의 유형과 그 입자의 즉석 확산 계수 (D1-4) 분석 3) 각 장소에 대 한 예상된 배경 형광에 의해 수정 비디오 따라 자리 강도 측정 하는. 클러스터 크기 추정 및 photobleaching 단계 식별 수 있습니다.
이 프로토콜을 사용 하는 전문된 기술을 요구 하지 않는다 세포 배양으로 어떤 실험실에서 수행할 수 있습니다, 그리고 flow cytometry 및 현미경 검사 법. 프로토콜은 ImageJ 또는 피지 (ImageJ12배포), U-트랙3및 일부 ad hoc 만든 루틴 (http://i2pc.es/coss/Programs/protocolScripts.zip)를 사용합니다. U-트랙 및 ad hoc 루틴 모든 호환 컴퓨터에 설치할 수 있는 Matlab을 통해 실행 합니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:797px;" width="797">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">Human Jurkat cells</td>
			<td style="width:203px;">ATCC</td>
			<td style="width:203px;">CRL-10915</td>
			<td style="width:171px;">Human T cell line. Any other cell type can be analyzed with this software</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:221px;">pAcGFPm-N1 (PT3719-5)DNA3GFP</td>
			<td style="width:203px;">Clontech</td>
			<td style="width:203px;">632469</td>
			<td>Different fluorescent proteins can be followed and analyzed with this routine</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:221px;">Gene Pulse X Cell electroporator&#160;</td>
			<td>BioRad&#160;</td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td>We use 280V, 975 mF, for Jurkat cells.&#160; Use the transfection method best working in your hands.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cytomics FC 500 flow cytometer&#160;</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MoFlo Astrios Cell Sorter&#160;</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td>Depending on the level of transfection, cell sorting may not be required.&#160; You can also employ cells with stable expression of adequate levels of the receptor of interest.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">Dako Qifikit</td>
			<td style="width:203px;">DakoCytomation</td>
			<td style="width:203px;">K0078</td>
			<td>Used for quantification the number of receptors in the cell surface.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">Glass bottom microwell dishes</td>
			<td style="width:203px;">MatTek corporation</td>
			<td style="width:203px;">P35G-1.5-10-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:221px;">Human Fibronectin from plasma</td>
			<td style="width:203px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:203px;">F0895</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">Recombinant human CXCL12</td>
			<td style="width:203px;">PeproTech</td>
			<td style="width:203px;">300928A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">Inverted Leica AM TIRF</td>
			<td style="width:203px;">Leica</td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">EM-CCD camera</td>
			<td style="width:203px;">Andor&#160;</td>
			<td style="width:203px;">DU 885-CSO-#10-VP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">MATLAB</td>
			<td style="width:203px;">The MathWorks, Natick, MA</td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">U-Track2 software</td>
			<td style="width:203px;">Danuser Laboratory</td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">ImageJ</td>
			<td style="width:203px;">NIH</td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td>https://imagej.nih.gov/ij/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">FiJi</td>
			<td style="width:203px;">FiJI</td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td>https://imagej.net/Fiji)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">u-Track2 software</td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td>Matlab tool.&#160; For installing, download .zip file from the web page (http://lccb.hms.harvard.edu/software.html) and uncompress the file in a directory of your choice</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">GraphPad Prism</td>
			<td style="width:203px;">GraphPad software</td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

image processing protocol for the analysis of the diffusion and cluster size of membrane receptors by fluorescence microscopy

비디오 시퀀스에 그들의 궤도의 후부 분석 추적 입자 요즘 많은 생물학 연구에서 일반적인 작업입니다. 모델 클러스터 세포 막 수용 체의 분석을 사용 하 여, 피지 (ImageJ) 및 Matlab 루틴을 사용 하 여이 이미지 분석 작업에 대 한 자세한 프로토콜 소개: 1) 관심 영역을 정의 하 고 마스크;이 지역에 맞게 디자인 2) 형광 현미경 동영상; 입자 추적 3) 선택 된 트랙의 확산 및 강도 특성 분석. 확산 계수의 정량 분석, 모션, 및 클러스터 크기의 유형 형광 현미경으로 얻은 이미지 처리 하며 객관적으로 입자 역학과 수정 결과 확인 하는 유용한 도구 환경 조건입니다. 이 문서에서는 이러한 기능 분석에 대 한 상세한 프로토콜 선물이. 설명 하는 방법을 여기 뿐만 아니라 단일 분자 추적 탐지를 허용 하지만 측면 확산 세포 막에서 매개 변수 추정 자동화, 궤적의 유형을 분류 하 고 따라서 극복 하는 완전 한 분석을 수는 세포 막에서 그것의 전체 궤도에 자리 크기 측정에 어려움

이 프로토콜을 사용 하는 형광 현미경 영화와 그들의 동적 특성의 분석에서 발견 하는 입자의 자동화 된 추적을 허용 한다. 처음, 셀 추적 붙일 결합 단백질으로 페는. SPT 셀 (그림 1)을 정렬 하 여 얻을 수 있는 세포 표면에 수용 체의 적절 한 수준을 제공 합니다. 선택한 셀이이 프로토콜 (보충 비디오 1)에 설명 된 도구로 공부 될 수 있는 ...

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Image Processing Protocol for the Analysis of the Diffusion and Cluster Size of Membrane Receptors by Fluorescence Microscopy

확산의 분석 및 형광 현미경 검사 법에 의해 수용 체 막의 클러스터 크기에 대 한 프로토콜을 처리 하는 이미지

여기, 우리는 확산 계수, 형광 현미경 검사 법에 의해 감지 하는 단일 입자의 모션 및 클러스터 크기의 종류의 정량적 인 평가 허용 하는 이미지 분석을 추적 하는 단일 입자에 대 한 프로토콜을 제시.

Particle tracking on a video sequence and the posterior analysis of their trajectories is nowadays a common operation in many biological studies. Using ...

새로운 현미경 기술은 연구되는 생물학 프로세스의 정확한 이해를 위한 적당한 공구의 발달을 요구합니다. 이 프로토콜은 측량 확산 파라미터의 추정과 세포막의 전체 궤적을 통해 스팟 크기의 정량화를 포함하여 단일 분자 추적에 필요한 이미지 처리 단계를 설명합니다. 이 프로토콜은 ImageJ, MATLAB 및 uTrack을 포함한 여러 소프트웨어 조각의 사용뿐만 아니라 이 프로토콜을 위해 특별히 개발된 일부 단백질을 결합합니다.이 방법은 빛 현미경 검사의 밑에 막 수용체의 추적으로 기술됩니다, 그러나 그 궤적을 비디오 순서에서 시간이 지남에 따라 추적될 수 있는 어떤 입자 같이 구조물든지에 적용될 수 있습니다. 이 기술은 기본적인 연구와 관련이 있으며 임상 환경에서 직접 적용할 수 없습니다. 그러나, 그것은 다른 질병에서 따라서 새로운 치료 표적의 식별에 있는 생물학 사건의 특성화에 원조하기 위하여 이용될 수 있습니다.이 프로토콜은 이 비디오에 도시된 바와 같이 세포막내입자의 추적과 관련이 있지만, 전체 세포, 박테리아, 유체의 나노입자 또는 그 중심이 잘 결정될 수 있는 다른 물체의 추적에도 적용될 수 있다. 이 프로토콜은 사용자 친화적이며 세포 배양 및 현미경 기술만 필요합니다. 이 프로토콜에 사용되는 다양한 기술과 정보 도구는 새 사용자를 위협할 수 있습니다.시각적 데모는 이 기술을 자신있게 사용하는 데 도움이 됩니다. 우선, Jurkat 세포를 성장시키고, 일조GFP 표지된 chemokine 수용체 벡터로 이식하고, 첨부된 텍스트 프로토콜에 설명된 바와 같이 표지된 벡터의 낮은 발현 수준을 가진 세포를 선택한다. CXCL12 리간드 또는 제어 매체를 함유한 미디어를 각 섬유네틴 코팅 된 35mm 유리 바닥 마이크로웰 접시에 추가하고 섭씨 37도에서 1 시간 동안 배양하십시오.다음으로, 각 접시에 정렬된 세포를 추가하고 세포를 이미징하기 전에 20 분 동안 배양합니다. 인큐베이션에 따라, 세포의 첫 번째 접시를 TIRF 현미경 단계로 옮기고 100x 오일 침지 목표로 전환한다. 밝은 필드를 사용하여 셀을 찾아 집중하여 광표백 효과를 최소화합니다.그런 다음 TIRF 모드로 전환하고 낮은 레이저 강도를 사용하여 미세 초점 조정을 수행합니다. 약 50초 길이의 동영상을 획득하여 프레임 사이의 시간 간격을 최소화합니다. 각 실험 조건 비디오 파일에 대해 이 비디오의 텍스트 프로토콜에 설명된 파일 구조 방향에 따라 새 폴더를 만듭니다.피지 또는 ImageJ와 비디오를 드래그 하 고 피지 메뉴 표시 줄에 파일을 삭제 하 여 비디오를 열고, bioformats를 사용 하 여 LIF 파일을 가져오기 위해 확인을 클릭 합니다. 마스크를 설계하기 위해 해당 다중 채널 이미지도 가져옵니다. 다음으로 먼저 마스크 디자인에 유용한 채널로 단일 이미지를 만들어 마스크를 만듭니다.막대 메뉴에서 이미지를 선택하고 색상다음 분할 채널을 클릭하여 서로 다른 채널을 별도의 이미지로 표시합니다. 막대 메뉴에서 이미지를 선택하고 색상으로 이동하며 채널 병합을 선택하여 단일 이미지로 세 채널을 다시 병합합니다. 적절한 채널을 선택한 다음 확인을 눌러 새 누적되지 않은 이미지를 생성해야 합니다.막대 메뉴로 이동하여 두 창을 동기화한 다음 분석을 선택한 다음 도구로 이동하여 Windows 동기화를 선택합니다. 동기화된 이미지 가능성이 있는 새 창이 표시됩니다. 이제 두 창이 동기화되면 두 창모두에서 동일한 영역을 잘라내수 있습니다.막대 메뉴에서 이미지로 이동하여 자르기를 선택합니다. 직사각형 선택 도구를 사용하여 관심 영역을 그립니다. 두 개의 자른 이미지가 개별적으로 표시됩니다.다음으로 두 창의 동기화를 해제합니다. 마스크가 만들어지지 않은 경우 선택 도구 및 자르기로 관심 영역을 그립니다. 그런 다음 비디오를 디렉터리 Videosec에서 이미지 시퀀스로 저장합니다.그런 다음 멀티 채널 이미지를 선택하고 메뉴의 플러그인으로 이동한 다음 세분화 편집기를 선택하여 세분화 편집기 플러그인을 엽니다. 프리핸드 선택 도구를 선택하고 녹색 레이블을 선택하고 가장 바깥쪽 마스크를 디자인하는 데 사용합니다. 디자인이 완료되면 복합 창선택 옵션에서 Plus 버튼을 누르면 선택한 마스크가 뷰어에 표시됩니다.모든 레이블에 대해 이 단계를 반복합니다. 모든 마스크가 디자인되면 이름과 동일한 파일 이름으로 마스크를 저장합니다.tif MATLAB을 열고 경로 설정으로 이동하여 경로에 uTrack 디렉터리를 추가하고 추가 를 선택합니다.그런 다음 작업 디렉터리를 분석할 계열을 포함하는 디렉토리로 변경합니다. 콘솔에서 동영상 셀렉터 GUI를 입력하고 Enter를 눌러 uTrack을 호출합니다. 이렇게 하면 동영상 선택 창이 열립니다.새 동영상 버튼을 누르고 동영상 추가 창이 나타날 때까지 기다립니다. 채널 추가를 눌러 비디오로 디렉토리를 선택하고 동영상 정보 매개 변수를 작성합니다. uTrack 결과를 결과에 대한 출력 디렉토리를 결과로 설정한 다음 고급 채널 설정을 누르고 획득과 관련된 매개 변수를 채우고 저장합니다.동영상을 만든 후 동영상 선택 창에서 계속을 누릅니다. 여기서 uTrack은 분석할 개체 유형에 대해 묻습니다. 단일 파티클을 선택한 다음 제어판 창이 나타납니다.다음으로 첫 번째 단계인 1단계:감지를 선택하고 설정을 클릭합니다. 설정 가우시안 혼합 모델 피팅 창이 나타납니다. 여기에 표시된 대로 설정을 입력한 다음 적용을 누릅니다.제어판에서 실행을 클릭하여 검색 단계를 실행합니다. 몇 분 후 결과 버튼을 눌러 결과를 확인합니다. 동영상에는 감지된 파티클에 빨간색 원이 표시됩니다.빨간색 원이 표시되지 않으면 이 단계가 제대로 작동하지 않았으며 다시 시도해야 합니다. 이제 방금 감지된 파티클을 여러 프레임에 걸쳐 있는 트랙으로 병합하여 여기에 표시된 대로 매개 변수를 먼저 설정합니다. 그런 다음 제어판에서 실행을 누릅니다.다음으로 트랙 분석을 수행합니다. 여기에 표시된 대로 설정을 정의한 다음 적용 및 실행을 누릅니다. 결과 버튼을 먼저 눌러 결과를 확인한 다음 동영상 옵션 창의 트랙 추적 번호를 클릭하고 각 트랙이 올바르게 식별되었는지 프레임별 프레임을 확인하여 실제 파티클이 아닌 파티클을 수동으로 표시합니다.MATLAB에서 여기에 표시된 대로 명령을 입력합니다. 이 명령은 프로그램이 모든 궤적을 읽고 확산 계수를 계산하게 합니다. 다음으로, 제외할 반점 목록을 제공하여 잘못 식별된 반점 이나 궤적에 해당하는 궤적을 제외합니다.함께 제공되는 텍스트 프로토콜을 따라 이 셀의 각 트랙에 대한 즉각적인 확산 계수를 계산합니다. 이 경우, 시간 지연에 대한 확산 계수를 D1에서 4까지 4라고 하는 4와 같게 계산한다. 완료되면 궤적을 짧고 긴 궤도로 분해합니다.긴 궤적을 분석하려면 여기에 표시된 대로 명령을 입력하여 모멘트 배율 스펙트럼을 통해 모션 유형을 분류합니다. 궤적을 따라 각 입자의 강도를 분석합니다. 함께 제공되는 텍스트 프로토콜을 따라 다릅니다.그런 다음 모든 궤적에 대한 확산 및 강도 정보를 수집합니다. 짧은 궤적을 위한 확산 및 강도 정보만 수집합니다. 마지막으로, 이전에 사용 했던 접미사는 긴 다음을 입력 하 여 순간 스펙트럼 스케일링 및 강도 정보를 수집 합니다.이 프로토콜에 설명된 기술의 사용은 형광 현미경 영화에서 검출된 입자의 자동 추적및 그들의 동적 특성의 분석을 허용합니다. 이 분석에서 자극의 변화에 따라 다른 특성을 얻을 수 있습니다. 여기에는 4개의 서로 다른 자극을 기반으로 한 움직이지 않는 반점의 비율, 50프레임 이상의 긴 궤적의 백분율, 지시, 자유 또는 제한된 움직임에 의해 부서진 궤적을 따라 이동하는 유형이 포함됩니다.또한, 확산 계수, 평균 스팟 강도, 및 입자당 수용체 수를 결정할 수 있다. 이는 서로 다른 자극에 반응하여 각 지점에 대한 짧은 확산 계수 값의 분포를 나타낸다. 빨간색 선은 중앙값의 값을 나타내며, 이 유사한 그래프는 동일한 자극에 대한 응답으로 처음 20 프레임을 따라 각 스팟의 평균 스팟 강도를 보여줍니다.다시 빨간색 선은 평균 강도 값을 나타냅니다. 스팟의 평균 보정 강도는 이 지점에 존재하는 형광 단백질의 수와 관련이 있기 때문에, 여기에 도시된 바와 같이 입자당 수용체 수를 직접 계산할 수 있다. MATLAB은 사례에 민감한 프로그래밍 언어입니다.이 프로토콜에 설명된 이름과 관련하여 변수 이름이 다를 수 있지만 이름 지정에 일관성을 유지해야 합니다. 함수의 이름은 변경할 수 없으며 쉼표, 콜론 및 반 콜론은 올바른 구문에 중요합니다. 단일 분자 현미경 검사는 전례없는 주걱 - 측두해상도로 개별 막 단백질의 시각화를 허용하고 세포 생물학의 예기치 않은 측면을 공개 할 수있는 독특한 기회를 제공합니다.이 프로토콜은 세포 및 분자 생물학에 있는 현미경 비디오의 정량분석을 위한 새로운 문을 엽니다.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Intravital Microscopy of the Spleen: Quantitative Analysis of Parasite Mobility and Blood Flow

비장의 Intravital 현미경 : 기생충 이동성 및 혈류의 정량 분석

The advent of intravital microscopy in experimental rodent malaria models has allowed major advances to the knowledge of parasite-host interactions 1,2. ...

연구

면역학 및 감염병학

Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

의 단일 세포 분석 바실러스 subtilis</em형광 현미경 및 유동세포계측법 사용> Biofilms

Biofilm formation is a general attribute to almost all bacteria 1-6. When bacteria form biofilms, cells are encased in extracellular matrix that is mostly ...

Antigens Protected Functional Red Blood Cells By The Membrane Grafting Of Compact Hyperbranched Polyglycerols

항원은 컴팩트 Hyperbranched Polyglycerols 중 이식 막으로 기능 적혈구를 보호

Red blood cell (RBC) transfusion is vital for the treatment of a number of acute and chronic medical problems such as thalassemia major and sickle cell ...

Fluorescence Microscopy Methods for Determining the Viability of Bacteria in Association with Mammalian Cells

포유 동물 세포와 관련있는 박테리아의 생존을 확인하는 방법에 대한 형광 현미경 방법

Central to the field of bacterial pathogenesis is the ability to define if and how microbes survive after exposure to eukaryotic cells. Current protocols ...

Analysis of the Epithelial Damage Produced by Entamoeba histolytica Infection

Analysis of the Epithelial Damage Produced by Entamoeba histolytica Infection

에 의해 제작 상피 손상의 분석<em&gt; Entamoeba 아메바</em&gt; 감염

Entamoeba histolytica is the causative agent of human amoebiasis, a major cause of diarrhea and hepatic abscess in tropical countries. Infection is ...

Measuring Phagosome pH by Ratiometric Fluorescence Microscopy

비례 형광 현미경으로 Phagosome 산도 측정

Phagocytosis is a fundamental process through which innate immune cells engulf bacteria, apoptotic cells or other foreign particles in order to kill or ...

Cortical Actin Flow in T Cells Quantified by Spatio-temporal Image Correlation Spectroscopy of Structured Illumination Microscopy Data

구조화 조명 현미경 데이터의 시공간적 이미지 상관 분광학에 의해 정량화 T 세포에서 대뇌 피질 굴지 흐름

Filamentous-actin plays a crucial role in a majority of cell processes including motility and, in immune cells, the formation of a key cell-cell ...

Preparation of CD4+ T Cells for Analysis of GD3 and GD2 Ganglioside Membrane Expression by Microscopy

Preparation of CD4+ T Cells for Analysis of GD3 and GD2 Ganglioside Membrane Expression by Microscopy

CD4의 준비<sup&gt; +</sup&gt; 현미경으로 GD3 및 GD2 강글 리오 시드 멤브레인 식의 분석을위한 T 세포

The methods described herein for activation of na&#239;ve CD4+ T cells in suspension and their adherence in coverslips for confocal microscopy analysis ...

Molecular Diffusion in Plasma Membranes of Primary Lymphocytes Measured by Fluorescence Correlation Spectroscopy

형광 상관 분광학에 의해 측정 된 차 림프구의 플라즈마 막 분자 확산

Fluorescence correlation spectroscopy (FCS) is a powerful technique for studying the diffusion of molecules within biological membranes with high spatial ...