Name: image processing protocol for the analysis of the diffusion and cluster size of membrane receptors by fluorescence microscopy
Uploaded: 2019-04-09T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Image Processing Protocol for the Analysis of the Diffusion and Cluster Size of Membrane Receptors by Fluorescence Microscopy at JoVE.com

Vi er takknemlige til Carlo Manzo og Maria García Parajo for deres hjelp og kilde koden av diffusjon koeffisienten analyse. Dette arbeidet var støttes delvis av stipend fra det spanske departementet for vitenskap og innovasjon universiteter (SAF 2017-82940-R) og RETICS programmet i Instituto de salud Carlos III (RD12/0009/009 og RD16/0012/0006; RIER). LMM og JV støttes av programmet COMFUTURO av Fundación generelt CSIC.

1. forberedelse av biologiske prøver
<ol><li>Vokse Jurkat celler i RPMI 1640 medium med 10% FCS, NaPyr og L-glutamin (fullstendig RPMI). Electroporate Jurkat celler (20 x 106 celler/400 µL av RPMI 1640 med 10% FCS) med en monomerisk GFP-merket chemokine reseptor vektor (CXCR4-AcGFP, 20 μg) å tillate oppdagelsen bruke fluorescens mikroskopi. Merk: Det er mulig å bruke andre monomerisk fluorescerende proteiner som mCherry, mScarlet, etc.</li>
	<li>24 timer etter transfection analysere ...

<ol>
	<li>Yu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+studies+in+live+cells.">Single-molecule studies in live cells.</a> Annual Review of Pysical Chemistry. 67 (565-585), (2016).</li><li>Mattheyses, A. L., Simon, S. M., Rappoport, J. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+with+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy+for+the+cell+biologist.">Imaging with total internal reflection fluorescence microscopy for the cell biologist.</a> Journal of Cell Science. 123 (Pt 21), 3621-3628 (2010).</li><li>Jaqaman, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+single-particle+tracking+in+live-cell+time-lapse+sequences.">Robust single-particle tracking in live-cell time-lapse sequences.</a> Nature Methods. 5 (8), 695-702 (2008).</li><li>Bakker, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lateral+mobility+of+individual+integrin+nanoclusters+orchestrates+the+onset+for+leukocyte+adhesion.">Lateral mobility of individual integrin nanoclusters orchestrates the onset for leukocyte adhesion.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 109 (13), 4869-4874 (2012).</li><li>Kusumi, A., Sako, Y., Yamamoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confined+lateral+diffusion+of+membrane+receptors+as+studied+by+single+particle+tracking+(nanovid+microscopy).+Effects+of+calcium-induced+differentiation+in+cultured+epithelial+cells.">Confined lateral diffusion of membrane receptors as studied by single particle tracking (nanovid microscopy). Effects of calcium-induced differentiation in cultured epithelial cells.</a> Biophysical Journal. 65 (5), 2021-2040 (1993).</li><li>Ferrari, R. M., Manfroi, A. J., Young, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strongly+and+weakly+self-similar+diffusion.">Strongly and weakly self-similar diffusion.</a> Physica D. 154, 111-137 (2001).</li><li>Sbalzarini, I. F., Koumoutsakos, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feature+point+tracking+and+trajectory+analysis+for+video+imaging+in+cell+biology.">Feature point tracking and trajectory analysis for video imaging in cell biology.</a> Journal of Structural Biology. 151 (2), 182-195 (2005).</li><li>Ewers, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-particle+tracking+of+murine+polyoma+virus-like+particles+on+live+cells+and+artificial+membranes.">Single-particle tracking of murine polyoma virus-like particles on live cells and artificial membranes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 102 (42), 15110-15115 (2005).</li><li>Manzo, C., Garcia-Parajo, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+progress+in+single+particle+tracking:+from+methods+to+biophysical+insights.">A review of progress in single particle tracking: from methods to biophysical insights.</a> Report on Progress in Physics. 78 (12), 124601 (2015).</li><li>Calebiro, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+analysis+of+fluorescently+labeled+G-protein-coupled+receptors+reveals+complexes+with+distinct+dynamics+and+organization.">Single-molecule analysis of fluorescently labeled G-protein-coupled receptors reveals complexes with distinct dynamics and organization.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 110 (2), 743-748 (2013).</li><li>Digman, M. A., Dalal, R., Horwitz, A. F., Gratton, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+the+number+of+molecules+and+brightness+in+the+laser+scanning+microscope.">Mapping the number of molecules and brightness in the laser scanning microscope.</a> Biophysical Journal. 94 (6), 2320-2332 (2008).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Martinez-Munoz, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separating+Actin-Dependent+Chemokine+Receptor+Nanoclustering+from+Dimerization+Indicates+a+Role+for+Clustering+in+CXCR4+Signaling+and+Function.">Separating Actin-Dependent Chemokine Receptor Nanoclustering from Dimerization Indicates a Role for Clustering in CXCR4 Signaling and Function.</a> Molecular Cell. 70 (1), 106-119 (2018).</li><li>Destainville, N., Salome, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+and+correction+of+systematic+errors+due+to+detector+time-averaging+in+single-molecule+tracking+experiments.">Quantification and correction of systematic errors due to detector time-averaging in single-molecule tracking experiments.</a> Biophysical Journal. 90 (2), L17-L19 (2006).</li></ol>

Metoden beskrevet er enkel å utføre selv uten noen tidligere erfaring med Matlab. Matlab rutiner krever imidlertid svært nøyaktighet med nomenklaturen av ulike kommandoer og lokalisering av de forskjellige mappene ansatt av programmet. I sporing analyse rutine (trinn 3), flere parametere kan endres. Vinduet "Innstillingen Gaussian-blanding modell passende" (trinn 3.8) styrer hvordan U-spor vil oppdage enkelt partikler på videoen. Dette gjøres ved å montere en Gaussian blanding modell som beskrevet i<sup class="xre...

Membran proteiner i lipid bilayer er i kontinuerlig bevegelse grunnet termiske spredning. Deres dynamics er avgjørende for å regulere celle svar, intermolekylære interaksjoner at komplekser som varierer i størrelse fra monomerer til oligomers og påvirke stabiliteten signalnettverk komplekser. Klargjørende mekanismer som styrer protein dynamics er dermed en ny utfordring i cell biology, å forstå signaltransduksjon trasé og uventede celle funksjonene.
Noen optiske metoder har blitt utviklet til å studere disse interaksjoner i levende celler1. Blant disse kan totalt interne refleksjon fluorescens (TIRF) mikroskopi, utviklet i 1980, studiet av molekylære interaksjoner på eller svært nær cellemembranen2. For å studere dynamiske parametre av membran protein baner fra TIRF data i levende celler, er en enkelt partikkel oppfølgingsmetode (SPT) nødvendig. Selv om flere algoritmer er tilgjengelig, bruker vi som utgis av Jaqaman et al.3 som partikkel bevegelse heterogene i et tett partikkel ved å koble partikler mellom påfølgende koble den resulterende banen segmenter i fullstendige baner (midlertidig partikkel forsvinningen). Programvaren registrerer partikkel slå sammen og dele resultatet fra aggregering og dissosiasjon hendelser3. En av utdata av denne programvaren er deteksjon av partikler langs hele banen ved å definere sine X og Y posisjoner i hver ramme.
Når partiklene er oppdaget, bruker vi forskjellige algoritmer for å fastslå den korte timelag diffusjon koeffisient (D-1-4)4,5. Bruk av øyeblikk skalering spektrum (MSS)6,7,8 analyse eller montering 'alfa' verdien av justering av Mean Square forskyvning (MSD) til kurven9, klassifisere vi også partikler i henhold til typen bane.
Analyse av spot intensiteten i fluorescens bilder er en felles målsetting for forskere i feltet10,11. Den vanligste algoritmen som brukes er såkalte antall og lysstyrke. Denne metoden likevel tillater ikke riktig frame-by-frame intensitet oppdagelsen i partikler i mobile fraksjonen. Vi har, dermed generert en ny algoritme til å vurdere disse partikkel intensiteter ramme-for-bilde og bestemme deres aggregering tilstand. Når koordinatene for hver partikkel oppdages ved hjelp av U-Track2 programvare3, definerer vi intensiteten i hver ramme over hele banen, også tar hensyn cellebakgrunnen i hver ramme. Denne programvaren tilbyr ulike muligheter for å finne stedet intensiteten og cellebakgrunnen og bruke kjent monomerisk og dimeric proteiner som referanser, beregner antall proteiner i partikkel oppdaget (cluster størrelse).
I denne artikkelen beskriver vi en forsiktig guide for å gjennomføre disse tre trinnene: 1) oppdage og sporing enkelt partikler sammen en video av fluorescens mikroskopi med U-spor; 2) analysere øyeblikkelig diffusjon koeffisient (D-1-4) av disse partikler og typen bevegelse (begrenset, gratis eller regissert) partikler med lange baner av MSS; 3) måling spot intensiteten langs videoen korrigert av den estimerte bakgrunn fluorescensen for hver spot. Dette gjør at klyngen størrelse estimering og identifisering av photobleaching trinnene.
Bruk av denne protokollen krever ikke spesialisert kompetanse og kan utføres i et laboratorium med cellekultur, flow cytometri og mikroskopi. Protokollen bruker ImageJ eller Fiji (en distribusjon ImageJ12), U-spor3og noen ad hoc gjort rutiner (http://i2pc.es/coss/Programs/protocolScripts.zip). U-spor og adhoc kjøre over Matlab som kan installeres på alle kompatible datamaskiner.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:797px;" width="797">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">Human Jurkat cells</td>
			<td style="width:203px;">ATCC</td>
			<td style="width:203px;">CRL-10915</td>
			<td style="width:171px;">Human T cell line. Any other cell type can be analyzed with this software</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:221px;">pAcGFPm-N1 (PT3719-5)DNA3GFP</td>
			<td style="width:203px;">Clontech</td>
			<td style="width:203px;">632469</td>
			<td>Different fluorescent proteins can be followed and analyzed with this routine</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:221px;">Gene Pulse X Cell electroporator&#160;</td>
			<td>BioRad&#160;</td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td>We use 280V, 975 mF, for Jurkat cells.&#160; Use the transfection method best working in your hands.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cytomics FC 500 flow cytometer&#160;</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MoFlo Astrios Cell Sorter&#160;</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td>Depending on the level of transfection, cell sorting may not be required.&#160; You can also employ cells with stable expression of adequate levels of the receptor of interest.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">Dako Qifikit</td>
			<td style="width:203px;">DakoCytomation</td>
			<td style="width:203px;">K0078</td>
			<td>Used for quantification the number of receptors in the cell surface.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">Glass bottom microwell dishes</td>
			<td style="width:203px;">MatTek corporation</td>
			<td style="width:203px;">P35G-1.5-10-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:221px;">Human Fibronectin from plasma</td>
			<td style="width:203px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:203px;">F0895</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">Recombinant human CXCL12</td>
			<td style="width:203px;">PeproTech</td>
			<td style="width:203px;">300928A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">Inverted Leica AM TIRF</td>
			<td style="width:203px;">Leica</td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">EM-CCD camera</td>
			<td style="width:203px;">Andor&#160;</td>
			<td style="width:203px;">DU 885-CSO-#10-VP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">MATLAB</td>
			<td style="width:203px;">The MathWorks, Natick, MA</td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">U-Track2 software</td>
			<td style="width:203px;">Danuser Laboratory</td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">ImageJ</td>
			<td style="width:203px;">NIH</td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td>https://imagej.nih.gov/ij/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">FiJi</td>
			<td style="width:203px;">FiJI</td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td>https://imagej.net/Fiji)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">u-Track2 software</td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td>Matlab tool.&#160; For installing, download .zip file from the web page (http://lccb.hms.harvard.edu/software.html) and uncompress the file in a directory of your choice</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">GraphPad Prism</td>
			<td style="width:203px;">GraphPad software</td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

image processing protocol for the analysis of the diffusion and cluster size of membrane receptors by fluorescence microscopy

Partikkel sporing på en videosekvens og bakre analyse av sine baner er i dag en vanlig operasjon i mange biologiske studier. Analyse for celle membran reseptor klynger som modell, presenterer vi en detaljert protokoll for dette bildet analyse ved Fiji (ImageJ) og Matlab rutiner å: 1) definere områder av interesse og design masker tilpasset disse regioner. 2) spore partikler i fluorescens mikroskopi videoer; 3) analysere diffusjon og intensitet karakteristikkene av utvalgte spor. Kvantitativ analyse av diffusjon koeffisientene, bevegelse og klyngestørrelse oppnås ved fluorescens mikroskopi og bildebehandling gir et verdifullt verktøy for å finne objektivt partikkel dynamikk og konsekvensene av å endre miljøforhold. I denne artikkelen presenterer vi detaljerte protokoller for analyse av disse funksjonene. Metoden beskrevet her ikke bare tillater én-molekylet sporing oppdagelsen, men også automatiserer estimering av lateral diffusjon parametere på cellemembranen, klassifiserer hvilken bane og tillater fullstendig analyse dermed overvinne den vanskeligheter med å kvantifisere størrelsen over sin hele bane på cellemembranen.

Bruk av denne protokollen tillater automatisk sporing av partikler i fluorescens mikroskopi filmer og analyse av deres dynamiske egenskaper. I utgangspunktet celler er transfekterte med fluorescently-kombinert protein spores. Riktig nivå av reseptorer presenterer på cellens overflate som lar SPT oppnås ved celle sortering (figur 1). Celleinnhold analyseres av TIRF mikroskopi som genererer videoer i et format som kan studeres med verktøyene som beskrives i...

Watch this Scientific Journal Video about Image Processing Protocol for the Analysis of the Diffusion and Cluster Size of Membrane Receptors by Fluorescence Microscopy at JoVE.com

Image Processing Protocol for the Analysis of the Diffusion and Cluster Size of Membrane Receptors by Fluorescence Microscopy

Bildebehandling protokollen for analyse av spredningen og størrelse membran reseptorer av fluorescens mikroskopi

Her presenterer vi en protokoll for enkelt partikkel sporing bildeanalyser der kvantitativ vurdering av diffusjon koeffisienter, typer bevegelse og cluster størrelse enkelt partikler oppdaget av fluorescens mikroskopi.

Particle tracking on a video sequence and the posterior analysis of their trajectories is nowadays a common operation in many biological studies. Using ...

Nye mikroskopiteknikker krever utvikling av tilstrekkelige verktøy for riktig forståelse av de biologiske prosessene som studeres. Denne protokollen beskriver bildebehandlingstrinnene som kreves for sporing av enkeltmolekyler, inkludert estimering av laterale diffusjonsparametere og kvantifisering av spotstørrelse over hele banen ved cellemembranen. Denne protokollen kombinerer bruk av flere programvarestykker, inkludert ImageJ, MATLAB og uTrack, samt noen proteiner som er utviklet spesielt for denne protokollen.Denne metoden er illustrert med sporing av membranreseptorer under lett mikroskopi, men den kan påføres en hvilken som helst partikkellignende struktur hvis baner kan spores over tid i en videosekvens. Denne teknikken er relatert til grunnleggende forskning og har ingen direkte anvendelse i en klinisk setting. Det kan imidlertid brukes til å hjelpe til med karakterisering av biologiske hendelser både i forskjellige sykdommer og derfor i identifisering av nye terapeutiske mål.Denne protokollen er relevant for sporing av partikler i cellulære membraner, som vist i denne videoen, men den kan også brukes til sporing av fulle celler, bakterier, nanopartikler i en væske, eller hva som helst annet objekt hvis senter kan bestemmes godt. Denne protokollen er brukervennlig og krever bare kunnskap om cellekultur og mikroskopiteknikker. De ulike teknikkene og informatikkverktøyene som brukes i denne protokollen, kan skremme en ny bruker.Den visuelle demonstrasjonen hjelper en å bruke denne teknikken med selvtillit. Til å begynne med, vokse Jurkat celler, transfect dem med en monomerisk GFP-merket chemokin reseptor vektor, og velg celler med lave uttrykksnivåer av merket vektor, som beskrevet i den medfølgende tekstprotokollen. Legg til medier som inneholder CXCL12 ligand eller kontrollmedier til hver fibronectin-belagt 35-millimeter glassbunns mikrobrønnretter som er belagt med fibronectin, og inkuber i en time ved 37 grader Celsius.Deretter legger du til sorterte celler i hver tallerken, og inkuberer i 20 minutter før de avbilde cellene. Etter inkubasjon, overfør den første parabolen av celler til et TIRF mikroskop stadium og slå til 100x olje nedsenking mål. Finn og fokuser på cellene ved hjelp av lysfelt for å minimere fotobleaching effekter.Bytt deretter til TIRF-modus og utfør en finjusteringsjustering ved hjelp av lav laserintensitet. Hent filmer på ca. 50 sekunder i lengde, noe som minimerer tidsintervallet mellom rammer. For hver eksperimentelle tilstandsvideofil oppretter du en ny mappe ved å følge filstrukturinstruksjonene som er beskrevet i denne videoens tekstprotokoll.Åpne videoen med Fiji eller ImageJ ved å dra og slippe filen på Fiji-menylinjen, og klikk på OK for å importere LIF-filen ved hjelp av bioformater. For å utforme en maske, importer du også det tilsvarende flerkanalsbildet. Deretter oppretter du en maske ved først å opprette ett enkelt bilde med kanalene som er nyttige for utformingen av masken.Velg Bilde i stolpemenyen, og klikk Farge etterfulgt av Delte kanaler for å vise de ulike kanalene som separate bilder. Slå sammen de tre kanalene på nytt i ett enkelt bilde ved å velge Bilde i stolpemenyen, gå til Farge og velge Slå sammen kanaler. Pass på at du velger de riktige kanalene, og trykk deretter på OK for å generere et nytt ikke-stablet bilde.Synkroniser de to vinduene ved å gå til stolpemenyen, velge Analyser og deretter gå til Verktøy og velge Synkroniser Windows. Et nytt vindu med synkroniserte bildemuligheter vises. Nå, med de to vinduene synkronisert, kan det samme området i begge vinduene beskjæres.Gå til Bilde i stolpemenyen, og velg Beskjær. Med det rektangulære markeringsverktøyet tegner du interesseområdet. De to beskårne bildene vises individuelt.Deretter avsette du begge vinduene. Hvis ingen maske er opprettet, tegner du interesseområdet med markeringsverktøyet og beskjæringen. Deretter lagrer du videoen som en bildesekvens i katalogen Videosec.Velg deretter flerkanalsbildet, gå til Plugins i menyen, og velg Segmenteringsredigering for å åpne segmenteringsredigeringsprogrammet. Velg frihåndsvalgverktøyet, og bruk det til å velge en grønn etikett og designe den ytterste masken. Når den er utformet, trykker du på Pluss-knappen i valgalternativet for komposittvindu, og den valgte masken vises på visningsprogrammet.Gjenta dette trinnet for alle etiketter. Når alle maskene er utformet, lagrer du masken med samme filnavn som videoen, med navnet:maske.tif. Åpne MATLAB og legg til uTrack-katalogen i banen ved å gå til Angi bane og velge Legg til med.Deretter endrer du arbeidskatalogen til katalogen som inneholder serien som skal analyseres. Start uTrack ved å skrive inn Filmvelger GUI i konsollen og trykke Enter. Dette fører til at filmvalgvinduet åpnes.Trykk på Ny film-knappen, og vent til vinduet Filmtillegg vises. Trykk på Legg til kanal for å velge katalogen med videoen og fylle ut filminformasjonsparametrene. Angi utdatakatalogen for resultatene av uTrack til Resultater, trykk deretter på avanserte kanalinnstillinger, fyll parameterne knyttet til anskaffelsen og lagre.Når du har opprettet filmen, trykker du på Fortsett i vinduet for filmvalg. Her spør uTrack om hvilken type objekt som skal analyseres. Velg Enkeltpartikler, og deretter vises kontrollpanelvinduet.Deretter velger du det første trinnet, Trinn 1: Deteksjon, og klikker på Innstilling. Vinduet Innstilling gaussisk blandingsmodellmontering vises. Angi innstillingene som vist her, og trykk deretter Påfør.I kontrollpanelet klikker du på Kjør for å kjøre gjenkjenningstrinnet. Etter noen minutter kontrollerer du resultatene ved å trykke på Resultat-knappen. Filmen viser røde sirkler på de oppdagede partiklene.Hvis ingen rød sirkel vises, har dette trinnet ikke fungert riktig, og du bør prøve på nytt. Nå kan du slå sammen partiklene som nettopp ble oppdaget i spor som strekker seg over flere rammer ved først å sette opp parametrene som vist her. Trykk deretter kjør i kontrollpanelet.Deretter utfører du sporanalyse. Definer innstillingene, som vist her, og trykk deretter Bruk og kjør. Kontroller resultatene ved først å trykke på Resultat-knappen, klikk deretter på Vis spornummer for filmalternativer vinduet og sjekk ramme for bilde at hvert spor er riktig identifisert, manuelt merking partikler som ikke er sanne partikler.I MATLAB skriver du inn kommandoen som vist her. Denne kommandoen vil føre til at programmet leser alle banene og beregner diffusjonskoeffisientene. Deretter ekskluderer du baner som tilsvarer feil identifiserte flekker eller baner ved å gi listen over flekker å ekskludere.Beregn de øyeblikkelige diffusjonskoeffisientene for hver av sporene i denne cellen ved å følge med i den medfølgende tekstprotokollen. I dette tilfellet beregner du diffusjonskoeffisienten for et tidsforsinkelsesspetter tilsvarer 4 kalt D1 til 4. Når du er ferdig, dekomponere banene i korte og lange baner.Hvis du vil analysere lange baner, skriver du inn kommandoen som vist her for å klassifisere bevegelsestypen gjennom deres øyeblikkskaleringsspektrum. Analyser intensiteten av hver partikkel langs banen. Konfigurer denne grunnleggende virkemåten på mange forskjellige måter ved å følge med i den medfølgende tekstprotokollen.Deretter samler du diffusjons- og intensitetsinformasjonen for alle banene. Samle bare diffusjon og intensitet informasjon for korte baner. Til slutt samler du inn momentspektrumskalering og intensitetsinformasjonen ved å skrive inn følgende, hvor lenge er suffikset som brukes tidligere.Bruken av teknikkene som er beskrevet i denne protokollen, gjør det mulig å automatisk sporing av partikler som oppdages i fluorescensmikroskopifilmer og analyse av deres dynamiske egenskaper. Fra denne analysen kan man oppnå forskjellige egenskaper basert på variasjoner i stimuli. Dette inkluderer prosentandelen av immobile flekker basert på fire forskjellige stimuli, prosentandelen av lange baner på større enn 50 rammer, og de typer bevegelse langs banene som brutt opp av rettet, fri eller begrensede bevegelser.I tillegg kan diffusjonskoeffisienten, gjennomsnittlig spotintensitet og antall reseptorer per partikkel bestemmes. Dette viser fordelingen av de korte diffusjonskoeffisientverdiene for hvert sted som svar på ulike stimuli. Den røde linjen representerer medianverdien, denne lignende grafen viser gjennomsnittlig spotintensitet for hvert sted langs sine første 20 rammer som svar på de samme stimuli.Igjen representerer den røde linjen gjennomsnittsintensitetsverdien. Som et steds gjennomsnittlige korrigerte intensitet er relatert til antall fluorescerende proteiner tilstede på dette stedet, kan man direkte beregne antall reseptorer per partikkel, som vist her. MATLAB er et programmeringsspråk som skiller mellom store og små bokstaver.Du kan variere variabelnavnene med hensyn til de som er beskrevet i denne protokollen, men sørg for å være konsekvent i navngivningen. Navnene på funksjonene kan ikke endres, og komma, kolon og semikolon er viktige for en riktig syntaks. Enkeltmolekylmikroskopi muliggjør visualisering av individuelle membranproteiner med enestående spatio-temporal oppløsning og gir unike muligheter til å avsløre uventede aspekter ved cellebiologi.Disse protokollene åpner nye dører for kvantitativ analyse av mikroskopivideoer i celler og molekylærbiologi.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Intravital Microscopy of the Spleen: Quantitative Analysis of Parasite Mobility and Blood Flow

Intravital Mikroskopi av Spleen: Kvantitativ analyse av Parasite Mobilitet og Blood Flow

The advent of intravital microscopy in experimental rodent malaria models has allowed major advances to the knowledge of parasite-host interactions 1,2. ...

Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

Single-celle Analyse av Bacillus subtilis Biofilm Bruke fluorescensmikroskopi og flowcytometrisystemer

Biofilm formation is a general attribute to almost all bacteria 1-6. When bacteria form biofilms, cells are encased in extracellular matrix that is mostly ...

Antigens Protected Functional Red Blood Cells By The Membrane Grafting Of Compact Hyperbranched Polyglycerols

Antigener Beskyttet Funksjonell røde blodceller av membranen Pode av kompakt hyperforgrenede Polyglycerols

Red blood cell (RBC) transfusion is vital for the treatment of a number of acute and chronic medical problems such as thalassemia major and sickle cell ...

Fluorescence Microscopy Methods for Determining the Viability of Bacteria in Association with Mammalian Cells

Fluorescensmikroskopi metoder for å bestemme levedyktigheten til bakterier i foreningen med pattedyrceller

Central to the field of bacterial pathogenesis is the ability to define if and how microbes survive after exposure to eukaryotic cells. Current protocols ...

Analysis of the Epithelial Damage Produced by Entamoeba histolytica Infection

Analysis of the Epithelial Damage Produced by Entamoeba histolytica Infection

Analyse av epitelisk skade produsert av<em&gt; Entamoeba histolytica</em&gt; Infeksjon

Entamoeba histolytica is the causative agent of human amoebiasis, a major cause of diarrhea and hepatic abscess in tropical countries. Infection is ...

Measuring Phagosome pH by Ratiometric Fluorescence Microscopy

Måling Phagosome pH ved Proporsjonellekspansjon Fluorescensmikroskopi

Phagocytosis is a fundamental process through which innate immune cells engulf bacteria, apoptotic cells or other foreign particles in order to kill or ...

Cortical Actin Flow in T Cells Quantified by Spatio-temporal Image Correlation Spectroscopy of Structured Illumination Microscopy Data

Kortikal Actin Flow i T-celler kvantifisert ved Spatio-temp Bilde korrelasjon spektroskopi av Strukturert Illumination Mikros data

Filamentous-actin plays a crucial role in a majority of cell processes including motility and, in immune cells, the formation of a key cell-cell ...

Preparation of CD4+ T Cells for Analysis of GD3 and GD2 Ganglioside Membrane Expression by Microscopy

Preparation of CD4+ T Cells for Analysis of GD3 and GD2 Ganglioside Membrane Expression by Microscopy

Utarbeidelse av CD4<sup&gt; +</sup&gt; T celler for analyse av GD3 og GD2 Gangliosid Membran Expression ved mikroskopi

The methods described herein for activation of na&#239;ve CD4+ T cells in suspension and their adherence in coverslips for confocal microscopy analysis ...

Molecular Diffusion in Plasma Membranes of Primary Lymphocytes Measured by Fluorescence Correlation Spectroscopy

Molekylær diffusjon i plasmamembraner Primære lymfocytter målt ved fluorescens korrelasjon spektroskopi

Fluorescence correlation spectroscopy (FCS) is a powerful technique for studying the diffusion of molecules within biological membranes with high spatial ...