Name: image processing protocol for the analysis of the diffusion and cluster size of membrane receptors by fluorescence microscopy
Uploaded: 2019-04-09T14:30:00
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Nós somos gratos a Carlo Manzo e Maria García Parajo para sua ajuda e código-fonte da análise do coeficiente de difusão. Este trabalho foi financiado em parte por subvenções do Ministério espanhol de ciência, inovação e universidades (SAF 2017-82940-R) e o programa de RETICS do Instituto de salud Carlos III (RD12/0009/009 e RD16/0012/0006; CARRIER). LMM e JV são suportados pelo programa COMFUTURO do CSIC a Fundación General.

1. preparação de amostras biológicas
<ol><li>Desenvolvem-se células Jurkat em RPMI 1640 suplementado com 10% de FCS, NaPyr e L-glutamina (RPMI completa). Células Electroporate Jurkat (20 x 106 células/400 µ l de RPMI 1640 com 10% de FCS) com um vetor de receptor do chemokine monomérica com rótulo GFP (CXCR4-AcGFP, 20 μg) para permitir que sua detecção usando microscopia de fluorescência. Nota: É possível usar outras proteínas monoméricas fluorescentes como mCherry, mScarl...

<ol>
	<li>Yu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+studies+in+live+cells.">Single-molecule studies in live cells.</a> Annual Review of Pysical Chemistry. 67 (565-585), (2016).</li><li>Mattheyses, A. L., Simon, S. M., Rappoport, J. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+with+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy+for+the+cell+biologist.">Imaging with total internal reflection fluorescence microscopy for the cell biologist.</a> Journal of Cell Science. 123 (Pt 21), 3621-3628 (2010).</li><li>Jaqaman, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+single-particle+tracking+in+live-cell+time-lapse+sequences.">Robust single-particle tracking in live-cell time-lapse sequences.</a> Nature Methods. 5 (8), 695-702 (2008).</li><li>Bakker, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lateral+mobility+of+individual+integrin+nanoclusters+orchestrates+the+onset+for+leukocyte+adhesion.">Lateral mobility of individual integrin nanoclusters orchestrates the onset for leukocyte adhesion.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 109 (13), 4869-4874 (2012).</li><li>Kusumi, A., Sako, Y., Yamamoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confined+lateral+diffusion+of+membrane+receptors+as+studied+by+single+particle+tracking+(nanovid+microscopy).+Effects+of+calcium-induced+differentiation+in+cultured+epithelial+cells.">Confined lateral diffusion of membrane receptors as studied by single particle tracking (nanovid microscopy). Effects of calcium-induced differentiation in cultured epithelial cells.</a> Biophysical Journal. 65 (5), 2021-2040 (1993).</li><li>Ferrari, R. M., Manfroi, A. J., Young, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strongly+and+weakly+self-similar+diffusion.">Strongly and weakly self-similar diffusion.</a> Physica D. 154, 111-137 (2001).</li><li>Sbalzarini, I. F., Koumoutsakos, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feature+point+tracking+and+trajectory+analysis+for+video+imaging+in+cell+biology.">Feature point tracking and trajectory analysis for video imaging in cell biology.</a> Journal of Structural Biology. 151 (2), 182-195 (2005).</li><li>Ewers, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-particle+tracking+of+murine+polyoma+virus-like+particles+on+live+cells+and+artificial+membranes.">Single-particle tracking of murine polyoma virus-like particles on live cells and artificial membranes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 102 (42), 15110-15115 (2005).</li><li>Manzo, C., Garcia-Parajo, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+progress+in+single+particle+tracking:+from+methods+to+biophysical+insights.">A review of progress in single particle tracking: from methods to biophysical insights.</a> Report on Progress in Physics. 78 (12), 124601 (2015).</li><li>Calebiro, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+analysis+of+fluorescently+labeled+G-protein-coupled+receptors+reveals+complexes+with+distinct+dynamics+and+organization.">Single-molecule analysis of fluorescently labeled G-protein-coupled receptors reveals complexes with distinct dynamics and organization.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 110 (2), 743-748 (2013).</li><li>Digman, M. A., Dalal, R., Horwitz, A. F., Gratton, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+the+number+of+molecules+and+brightness+in+the+laser+scanning+microscope.">Mapping the number of molecules and brightness in the laser scanning microscope.</a> Biophysical Journal. 94 (6), 2320-2332 (2008).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Martinez-Munoz, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separating+Actin-Dependent+Chemokine+Receptor+Nanoclustering+from+Dimerization+Indicates+a+Role+for+Clustering+in+CXCR4+Signaling+and+Function.">Separating Actin-Dependent Chemokine Receptor Nanoclustering from Dimerization Indicates a Role for Clustering in CXCR4 Signaling and Function.</a> Molecular Cell. 70 (1), 106-119 (2018).</li><li>Destainville, N., Salome, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+and+correction+of+systematic+errors+due+to+detector+time-averaging+in+single-molecule+tracking+experiments.">Quantification and correction of systematic errors due to detector time-averaging in single-molecule tracking experiments.</a> Biophysical Journal. 90 (2), L17-L19 (2006).</li></ol>

O método descrito é fácil de executar mesmo sem ter qualquer experiência anterior com Matlab. No entanto, rotinas Matlab extremamente exigem precisão com a nomenclatura dos diferentes comandos e a localização das diferentes pastas utilizadas pelo programa. No acompanhamento de rotina de análise (etapa 3), vários parâmetros podem ser modificados. A janela "Configuração Gaussian-mistura modelo encaixe" (passo 3.8) controla como U-faixa irá detectar partículas única no vídeo. Isso é feito colocando-se um mo...

Proteínas de membrana incorporadas a bicamada lipídica estão em contínuo movimento devido à difusão térmica. Sua dinâmica é essencial para regular as respostas celulares, como interações intermoleculares permitem a formação de complexos que variam em tamanho de monômeros de oligômeros e influenciam a estabilidade de complexos de sinalização. Elucidar os mecanismos para controlar a dinâmica da proteína é, portanto, um novo desafio em biologia celular, necessária para compreender as vias de transdução de sinal e para identificar as funções da célula imprevistos.
Foram desenvolvidos alguns métodos ópticos para estudar essas interações na vida, as células1. Entre estes, microscopia de fluorescência (TIRF) de reflexão interna total, desenvolvida na década de 1980, permite o estudo de interações moleculares ou muito próximo da membrana celular2. Para estudar parâmetros dinâmicos de trajetórias de proteína de membrana obtidos de dados TIRF em células vivas, uma única partícula rastreamento método (SPT) é necessária. Embora vários algoritmos estão disponíveis para isto, atualmente usamos aqueles publicados por Jaqaman et al.3 que abordam a heterogeneidade de movimento das partículas em um campo de partículas densas, vinculando as partículas entre quadros consecutivos para se conectar a faixa resultante segmentos em trajetórias completas (desaparecimento temporário das partículas). O software capta a partícula mesclando e dividindo esse resultado de agregação e dissociação de eventos3. Um dos dados de saída deste software é a detecção das partículas ao longo da trajetória inteira definindo suas posições X e Y em cada quadro.
Uma vez que as partículas são detectadas, aplicamos diferentes algoritmos para determinar o curto lapso difusão coeficiente (D1-4)4,5. Aplicando-se o espectro de dimensionamento do momento (MSS)6,7,8 análise ou por encaixe o valor 'alpha' pelo ajuste de deslocamento o quadrado médio (MSD) para a curva9, podemos também classificar as partículas de acordo com o tipo de trajetória.
Análise de intensidade local em imagens de fluorescência é um objectivo comum para os cientistas no campo10,11. O algoritmo mais comum usado é o número de chamados e brilho. Este método, no entanto, não permitir a detecção de intensidade correta do frame-por-frame em partículas na fração móvel. Temos, assim, geramos um novo algoritmo para avaliar estas partículas intensidades quadro-a-quadro e determinar o seu estado de agregação. Uma vez que as coordenadas de cada partícula são detectadas usando U-Track2 software3, definimos a sua intensidade em cada quadro sobre a trajetória completa, tendo também em conta o plano de fundo de célula em cada quadro. Este software oferece diferentes possibilidades para determinar a intensidade do ponto e o plano de fundo da célula e, usando proteínas monoméricas e dimérica conhecidas como referências, calcula o número aproximado de proteínas na partícula detectada (tamanho do cluster).
Neste artigo, descrevemos um cuidado guia para executar estas três etapas: 1) detecção e rastreamento única partículas ao longo de um vídeo de microscopia de fluorescência usando U-faixa; 2) analisando o coeficiente de difusão instantânea (D1-4) de tais partículas e o tipo de movimento (confinado, livre ou dirigido) de partículas com longa trajetória por MSS; 3) medindo a intensidade local ao longo do vídeo corrigido por fluorescência fundo estimado para cada ponto. Isso permite que a estimativa de tamanho de cluster e identificação das etapas fotobranqueamento.
O uso do presente protocolo não requer habilidades especializadas e pode ser executado em qualquer laboratório com cultura celular, instalações de microscopia e citometria de fluxo. O protocolo usa ImageJ ou Fiji (uma distribuição do ImageJ12), U-faixa3e algumas rotinas de hoc feita anúncio (http://i2pc.es/coss/Programs/protocolScripts.zip). U-track e ad-hoc rotinas atropelar Matlab que pode ser instalado em qualquer computador compatível.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:797px;" width="797">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">Human Jurkat cells</td>
			<td style="width:203px;">ATCC</td>
			<td style="width:203px;">CRL-10915</td>
			<td style="width:171px;">Human T cell line. Any other cell type can be analyzed with this software</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:221px;">pAcGFPm-N1 (PT3719-5)DNA3GFP</td>
			<td style="width:203px;">Clontech</td>
			<td style="width:203px;">632469</td>
			<td>Different fluorescent proteins can be followed and analyzed with this routine</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:221px;">Gene Pulse X Cell electroporator&#160;</td>
			<td>BioRad&#160;</td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td>We use 280V, 975 mF, for Jurkat cells.&#160; Use the transfection method best working in your hands.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cytomics FC 500 flow cytometer&#160;</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MoFlo Astrios Cell Sorter&#160;</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td>Depending on the level of transfection, cell sorting may not be required.&#160; You can also employ cells with stable expression of adequate levels of the receptor of interest.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">Dako Qifikit</td>
			<td style="width:203px;">DakoCytomation</td>
			<td style="width:203px;">K0078</td>
			<td>Used for quantification the number of receptors in the cell surface.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">Glass bottom microwell dishes</td>
			<td style="width:203px;">MatTek corporation</td>
			<td style="width:203px;">P35G-1.5-10-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:221px;">Human Fibronectin from plasma</td>
			<td style="width:203px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:203px;">F0895</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">Recombinant human CXCL12</td>
			<td style="width:203px;">PeproTech</td>
			<td style="width:203px;">300928A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">Inverted Leica AM TIRF</td>
			<td style="width:203px;">Leica</td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">EM-CCD camera</td>
			<td style="width:203px;">Andor&#160;</td>
			<td style="width:203px;">DU 885-CSO-#10-VP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">MATLAB</td>
			<td style="width:203px;">The MathWorks, Natick, MA</td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">U-Track2 software</td>
			<td style="width:203px;">Danuser Laboratory</td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">ImageJ</td>
			<td style="width:203px;">NIH</td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td>https://imagej.nih.gov/ij/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">FiJi</td>
			<td style="width:203px;">FiJI</td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td>https://imagej.net/Fiji)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">u-Track2 software</td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td>Matlab tool.&#160; For installing, download .zip file from the web page (http://lccb.hms.harvard.edu/software.html) and uncompress the file in a directory of your choice</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">GraphPad Prism</td>
			<td style="width:203px;">GraphPad software</td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

image processing protocol for the analysis of the diffusion and cluster size of membrane receptors by fluorescence microscopy

Acompanhamento em uma sequência de vídeo e a análise posterior de suas trajetórias de partículas hoje em dia é uma operação comum em muitos estudos biológicos. Usando a análise dos receptores de membrana celular de clusters como modelo, apresentamos um protocolo detalhado para esta tarefa de análise de imagem usando Fiji (ImageJ) e rotinas de Matlab para: 1), definir as regiões de interesse e projetar máscaras adaptadas a estas regiões; 2) acompanhar as partículas em vídeos de microscopia de fluorescência; 3) analise as características de difusão e intensidade de faixas selecionadas. A análise quantitativa dos coeficientes de difusão, tipos de movimento e o tamanho do cluster obtidas por microscopia de fluorescência e processamento de imagem fornece uma ferramenta valiosa para determinar objetivamente a dinâmica da partícula e as consequências de modificar condições ambientais. Neste artigo apresentamos protocolos detalhados para a análise desses recursos. O método descrito aqui não só permite a detecção de rastreamento único-molécula, mas também automatiza a estimativa dos parâmetros de difusão lateral na membrana celular, classifica o tipo de trajetória e permite a análise completa, assim, superar a dificuldades em quantificar o tamanho de ponto ao longo de sua trajetória inteira na membrana celular.

O uso deste protocolo permite o monitoramento automatizado de partículas detectada em filmes de microscopia de fluorescência e a análise de suas características dinâmicas. Inicialmente, as células são transfected com a proteína fluorescente acoplados a serem controladas. O nível adequado de receptores presentes na superfície das células, o que permite que o SPT é obtido por célula de triagem (Figura 1). Células selecionadas são analisadas por m...

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Image Processing Protocol for the Analysis of the Diffusion and Cluster Size of Membrane Receptors by Fluorescence Microscopy

Processamento de imagem protocolo para análise de difusão e o tamanho do Cluster de receptores de membrana por microscopia de fluorescência

Aqui, apresentamos um protocolo para acompanhamento de análise de imagem que permite a avaliação quantitativa dos coeficientes de difusão, tipos de tamanhos de cluster e o movimento de partículas único detectados por microscopia de fluorescência de partícula única.

Particle tracking on a video sequence and the posterior analysis of their trajectories is nowadays a common operation in many biological studies. Using ...

Novas técnicas de microscopia requerem o desenvolvimento de ferramentas adequadas para a compreensão correta dos processos biológicos estudados. Este protocolo descreve as etapas de processamento de imagem necessárias para o rastreamento de molécula única, incluindo estimativa de parâmetros de difusão lateral e quantificação do tamanho da mancha ao longo de toda a sua trajetória na membrana celular. Este protocolo combina o uso de várias peças de software, incluindo ImageJ, MATLAB e uTrack, bem como algumas proteínas que foram desenvolvidas especificamente para este protocolo.Este método é ilustrado com o rastreamento de receptores de membrana sob microscopia leve, mas pode ser aplicado a qualquer estrutura semelhante a partículas cujas trajetórias podem ser rastreadas ao longo do tempo em uma sequência de vídeo. Esta técnica se relaciona com a pesquisa básica e não tem aplicação direta em um ambiente clínico. No entanto, pode ser utilizado para auxiliar na caracterização de eventos biológicos tanto em diferentes doenças quanto, portanto, na identificação de novos alvos terapêuticos.Este protocolo é relevante para o rastreamento de partículas em membranas celulares, como mostrado neste vídeo, mas também pode ser aplicado para o rastreamento de células completas, bactérias, nanopartículas em um fluido, ou qualquer outro objeto cujo centro possa ser bem determinado. Este protocolo é fácil de usar e requer apenas conhecimento de cultura celular e técnicas de microscopia. As diferentes técnicas e ferramentas de informática empregadas neste protocolo podem intimidar um novo usuário.A demonstração visual ajuda a usar essa técnica com confiança. Para começar, cresça células Jurkat, transfem-nas com um vetor receptor de quimioterapia monomérica com células registradas em GFP e selecionem células com baixos níveis de expressão do vetor rotulado, conforme descrito no protocolo de texto que acompanha. Adicione mídia contendo o ligante CXCL12 ou controle de mídia a cada pratos de microwell de 35 milímetros revestidos de fibronectina que foram revestidos com fibronectina, e incubar por uma hora a 37 graus Celsius.Em seguida, adicione células classificadas a cada prato e incubar por 20 minutos antes de fotografar as células. Após a incubação, transfira o primeiro prato de células para um estágio de microscópio TIRF e vire para o objetivo de imersão de óleo de 100x. Localize e foque nas células usando campo brilhante para minimizar os efeitos de fotobleaching.Em seguida, mude para o modo TIRF e realize um ajuste de foco fino usando baixa intensidade de laser. Adquira filmes de aproximadamente 50 segundos de comprimento, minimizando o intervalo de tempo entre os quadros. Para cada arquivo de vídeo de condição experimental, crie uma nova pasta seguindo as instruções da estrutura de arquivos descritas no protocolo de texto deste vídeo.Abra o vídeo com Fiji ou ImageJ arrastando e soltando o arquivo na barra de menu fiji e clique em OK para importar o arquivo LIF usando bioformats. Para projetar uma máscara, também importe a imagem multicanal correspondente. Em seguida, crie uma máscara criando primeiro uma única imagem com os canais úteis para o design da máscara.Selecione Imagem no menu da barra e clique em Cores seguidas de Canais Divididos para mostrar os diferentes canais como imagens separadas. Mescle novamente os três canais em uma única imagem selecionando Imagem no menu da barra, indo para Color e selecionando Canais de Mesclagem. Certifique-se de selecionar os canais apropriados e, em seguida, pressione OK para gerar uma nova imagem não empilhada.Sincronize as duas janelas indo ao menu da barra, selecionando Analisar e, em seguida, indo para Ferramentas e selecionando Sync Windows. Uma nova janela com as possibilidades de imagem sincronizada será mostrada. Agora, com as duas janelas sincronizadas, a mesma região em ambas as janelas pode ser cortada.Vá para Imagem no menu do bar e selecione Crop. Com a ferramenta de seleção retangular, desenhe a região de interesse. As duas imagens cortadas mostrarão individualmente.Em seguida, dessincronizar ambas as janelas. Se nenhuma máscara foi criada, desenhe a região de interesse com a ferramenta de seleção e a cultura. Depois disso, salve o vídeo como uma sequência de imagem no diretório Videosec.Em seguida, selecione a imagem multicanal, vá para Plugins no menu e selecione Editor de Segmentação para abrir o plugin do editor de segmentação. Escolha a ferramenta de seleção à mão livre e use-a para selecionar um rótulo verde e projetar a máscara mais externa. Uma vez projetado, pressione o botão Plus na opção de seleção da janela composta, e a máscara selecionada será exibida no visualizador.Repita este passo para todos os rótulos. Uma vez que todas as máscaras são projetadas, salve a máscara com o mesmo nome do arquivo do vídeo, com o nome:máscara.tif. Abra o MATLAB e adicione o diretório uTrack ao caminho, indo para Definir caminho e selecionando Adicionar Com.Em seguida, mude o Diretório de Trabalho para o diretório contendo a série a ser analisada. Invoque uTrack digitando GUI Seletor de Filme no console e pressionando Enter. Isso fará com que a janela de seleção do filme seja aberta.Pressione o botão Novo Filme e aguarde que a janela de adição de filme apareça. Pressione no Canal Adicionar para escolher o diretório com o vídeo e preencha os parâmetros de informações do filme. Defina o diretório de saída para os resultados do uTrack para Resultados, em seguida, pressione as Configurações avançadas do canal, preencha os parâmetros relacionados à aquisição e salve.Depois de criar o filme, pressione continue na janela de seleção de filmes. Aqui, uTrack perguntará sobre o tipo de objeto a ser analisado. Escolha partículas simples e, em seguida, a janela do painel de controle aparecerá.Em seguida, selecione o primeiro passo, Passo 1:Detecção e clique em Configuração. A janela de encaixe do modelo de mistura gaussiana de configuração aparecerá. Digite as configurações conforme mostrado aqui e pressione Aplicar.No painel de controle, clique em Executar para executar a etapa de detecção. Após alguns minutos, verifique os resultados pressionando o botão Resultado. O filme mostra círculos vermelhos nas partículas detectadas.Se nenhum círculo vermelho for mostrado, então este passo não funcionou corretamente e você deve tentar novamente. Agora, mescle as partículas que foram detectadas em faixas que abrangem vários quadros, configurando os parâmetros como mostrado aqui. Em seguida, pressione Executar no painel de controle.Em seguida, execute a Análise de Faixas. Defina as configurações, como mostrado aqui, e pressione Aplicar e Executar. Verifique os resultados pressionando primeiro o botão Resultado e, em seguida, clique em Mostrar o número da janela de opções de filme e verifique quadro por quadro que cada faixa foi corretamente identificada, marcando manualmente partículas que não são partículas verdadeiras.No MATLAB, digite o comando como mostrado aqui. Este comando fará com que o programa leia todas as trajetórias e calcule os coeficientes de difusão. Em seguida, exclua trajetórias correspondentes a pontos ou trajetórias incorretamente identificados, dando a lista de pontos a serem excluindo.Calcule os coeficientes de difusão instantâneas para cada uma das faixas desta célula seguindo o protocolo de texto que acompanha. Neste caso, calcule o coeficiente de difusão para um tempo de atraso é igual a 4 chamado D1 a 4. Quando terminar, decomponha as trajetórias em trajetórias curtas e longas.Para analisar longas trajetórias, digite o comando como mostrado aqui para classificar o tipo de movimento através de seu espectro de escala de momentos. Analise a intensidade de cada partícula ao longo de sua trajetória. Configure esse comportamento básico de muitas maneiras diferentes seguindo o protocolo de texto que acompanha.Em seguida, reúna as informações de difusão e intensidade para todas as trajetórias. Reúna apenas as informações de difusão e intensidade para trajetórias curtas. Por fim, reúna o dimensionamento do espectro de momentos e as informações de intensidade digitando o seguinte, onde há muito tempo é o sufixo usado anteriormente.O uso das técnicas descritas neste protocolo permite o rastreamento automatizado de partículas detectadas em filmes de microscopia de fluorescência e a análise de suas características dinâmicas. A partir desta análise, pode-se obter características diferentes com base em variações de estímulos. Isso inclui o percentual de manchas imóveis baseadas em quatro estímulos diferentes, a porcentagem de trajetórias longas de mais de 50 quadros e os tipos de movimento ao longo das trajetórias como quebrado por movimentos direcionados, livres ou confinados.Além disso, o coeficiente de difusão, intensidades médias de manchas e número de receptores por partícula podem ser determinados. Isso mostra a distribuição dos valores de coeficiente de difusão curta para cada ponto em resposta a diferentes estímulos. A linha vermelha representa o valor médio, este gráfico semelhante mostra as intensidades médias de pontos para cada ponto ao longo de seus primeiros 20 quadros em resposta aos mesmos estímulos.Novamente, a linha vermelha representa o valor médio de intensidade. Como a intensidade média corrigida de uma mancha está relacionada com o número de proteínas fluorescentes presentes neste local, pode-se calcular diretamente o número de receptores por partícula, como mostrado aqui. MATLAB é uma linguagem de programação sensível a casos.Você pode variar os nomes de variáveis em relação aos descritos neste protocolo, mas certifique-se de ser consistente em sua nomeação. Os nomes das funções não podem ser alterados, e vírgulas, cólons e semi-cólons são importantes para uma sintaxe correta. A microscopia de molécula única permite a visualização de proteínas de membrana individual com resolução espacial-temporal sem precedentes e oferece oportunidades únicas para revelar aspectos não previstos da biologia celular.Este protocolo abre novas portas para a análise quantitativa de vídeos de microscopia em células e biologia molecular.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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Imunologia e Infecção

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Análise de uma única célula de Bacillus subtilis Os biofilmes utilizando microscopia de fluorescência e citometria de fluxo

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Fluorescência métodos de microscopia para determinar a viabilidade de bactérias em associação com células de mamíferos

Central to the field of bacterial pathogenesis is the ability to define if and how microbes survive after exposure to eukaryotic cells. Current protocols ...

Analysis of the Epithelial Damage Produced by Entamoeba histolytica Infection

Analysis of the Epithelial Damage Produced by Entamoeba histolytica Infection

Análise do dano epitelial Produzido pela<em&gt; Entamoeba histolytica</em&gt; Infecção

Entamoeba histolytica is the causative agent of human amoebiasis, a major cause of diarrhea and hepatic abscess in tropical countries. Infection is ...

Measuring Phagosome pH by Ratiometric Fluorescence Microscopy

Medindo phagosome pH Raciometrico por microscopia de fluorescência

Phagocytosis is a fundamental process through which innate immune cells engulf bacteria, apoptotic cells or other foreign particles in order to kill or ...

Cortical Actin Flow in T Cells Quantified by Spatio-temporal Image Correlation Spectroscopy of Structured Illumination Microscopy Data

Cortical actina Fluxo nas células T quantificada pela correlação espacial e temporal Imagem Espectroscopia de iluminação estruturada Microscopia Dados

Filamentous-actin plays a crucial role in a majority of cell processes including motility and, in immune cells, the formation of a key cell-cell ...

Preparation of CD4+ T Cells for Analysis of GD3 and GD2 Ganglioside Membrane Expression by Microscopy

Preparation of CD4+ T Cells for Analysis of GD3 and GD2 Ganglioside Membrane Expression by Microscopy

Preparação de CD4<sup&gt; +</sup&gt; As células T para Análise de GD3 e GD2 gangliï¿½idos Membrane Expressão por microscopia

The methods described herein for activation of na&#239;ve CD4+ T cells in suspension and their adherence in coverslips for confocal microscopy analysis ...

Molecular Diffusion in Plasma Membranes of Primary Lymphocytes Measured by Fluorescence Correlation Spectroscopy

Difusão molecular em membranas plasmáticas de linfócitos primários medida por fluorescência Correlation Spectroscopy

Fluorescence correlation spectroscopy (FCS) is a powerful technique for studying the diffusion of molecules within biological membranes with high spatial ...