Name: image processing protocol for the analysis of the diffusion and cluster size of membrane receptors by fluorescence microscopy
Uploaded: 2019-04-09T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Image Processing Protocol for the Analysis of the Diffusion and Cluster Size of Membrane Receptors by Fluorescence Microscopy at JoVE.com

Мы благодарны Карло Manzo и Мария Гарсия Parajo за их помощь и исходный код анализа коэффициент диффузии. Эта работа частично поддержали грантов от испанского министерства науки, инноваций и университетов (SAF 2017-82940-R) и программа RETICS Instituto de salud Карлоса III (RD12/0009/009 и RD16/0012/0006; МОЛО). COMFUTURO программы Фонд Генеральной CSIC поддерживаются LMM и СП.

1. Подготовка биологических образцов
<ol><li>Расти Jurkat клеток в среде RPMI 1640 с 10% FCS, NaPyr и L-глютамин (полная RPMI). Electroporate Jurkat клетки (20 x 106 клеток/400 мкл RPMI 1640 с 10% FCS) с вектором мономерных GFP-помечены хемокиновых рецепторов (CXCR4-AcGFP, 20 мкг) чтобы разрешить ее обнаружения, с помощью микроскопии ...

<ol>
	<li>Yu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+studies+in+live+cells.">Single-molecule studies in live cells.</a> Annual Review of Pysical Chemistry. 67 (565-585), (2016).</li><li>Mattheyses, A. L., Simon, S. M., Rappoport, J. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+with+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy+for+the+cell+biologist.">Imaging with total internal reflection fluorescence microscopy for the cell biologist.</a> Journal of Cell Science. 123 (Pt 21), 3621-3628 (2010).</li><li>Jaqaman, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+single-particle+tracking+in+live-cell+time-lapse+sequences.">Robust single-particle tracking in live-cell time-lapse sequences.</a> Nature Methods. 5 (8), 695-702 (2008).</li><li>Bakker, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lateral+mobility+of+individual+integrin+nanoclusters+orchestrates+the+onset+for+leukocyte+adhesion.">Lateral mobility of individual integrin nanoclusters orchestrates the onset for leukocyte adhesion.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 109 (13), 4869-4874 (2012).</li><li>Kusumi, A., Sako, Y., Yamamoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confined+lateral+diffusion+of+membrane+receptors+as+studied+by+single+particle+tracking+(nanovid+microscopy).+Effects+of+calcium-induced+differentiation+in+cultured+epithelial+cells.">Confined lateral diffusion of membrane receptors as studied by single particle tracking (nanovid microscopy). Effects of calcium-induced differentiation in cultured epithelial cells.</a> Biophysical Journal. 65 (5), 2021-2040 (1993).</li><li>Ferrari, R. M., Manfroi, A. J., Young, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strongly+and+weakly+self-similar+diffusion.">Strongly and weakly self-similar diffusion.</a> Physica D. 154, 111-137 (2001).</li><li>Sbalzarini, I. F., Koumoutsakos, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feature+point+tracking+and+trajectory+analysis+for+video+imaging+in+cell+biology.">Feature point tracking and trajectory analysis for video imaging in cell biology.</a> Journal of Structural Biology. 151 (2), 182-195 (2005).</li><li>Ewers, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-particle+tracking+of+murine+polyoma+virus-like+particles+on+live+cells+and+artificial+membranes.">Single-particle tracking of murine polyoma virus-like particles on live cells and artificial membranes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 102 (42), 15110-15115 (2005).</li><li>Manzo, C., Garcia-Parajo, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+progress+in+single+particle+tracking:+from+methods+to+biophysical+insights.">A review of progress in single particle tracking: from methods to biophysical insights.</a> Report on Progress in Physics. 78 (12), 124601 (2015).</li><li>Calebiro, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+analysis+of+fluorescently+labeled+G-protein-coupled+receptors+reveals+complexes+with+distinct+dynamics+and+organization.">Single-molecule analysis of fluorescently labeled G-protein-coupled receptors reveals complexes with distinct dynamics and organization.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 110 (2), 743-748 (2013).</li><li>Digman, M. A., Dalal, R., Horwitz, A. F., Gratton, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+the+number+of+molecules+and+brightness+in+the+laser+scanning+microscope.">Mapping the number of molecules and brightness in the laser scanning microscope.</a> Biophysical Journal. 94 (6), 2320-2332 (2008).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Martinez-Munoz, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separating+Actin-Dependent+Chemokine+Receptor+Nanoclustering+from+Dimerization+Indicates+a+Role+for+Clustering+in+CXCR4+Signaling+and+Function.">Separating Actin-Dependent Chemokine Receptor Nanoclustering from Dimerization Indicates a Role for Clustering in CXCR4 Signaling and Function.</a> Molecular Cell. 70 (1), 106-119 (2018).</li><li>Destainville, N., Salome, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+and+correction+of+systematic+errors+due+to+detector+time-averaging+in+single-molecule+tracking+experiments.">Quantification and correction of systematic errors due to detector time-averaging in single-molecule tracking experiments.</a> Biophysical Journal. 90 (2), L17-L19 (2006).</li></ol>

Описан метод легко выполнять даже без каких-либо предыдущий опыт работы с Matlab. Однако Matlab процедуры требуют чрезвычайно точность с номенклатуры различных команд и локализация различных папок, используемых программой. В деле отслеживания процедура анализа (шаг 3), несколько параметров ?...

Мембранных белков, встроенных в липидный бислой находятся в постоянном движении, за счет диффузии тепловой. Их динамика необходимо регулировать клеток ответов, как межмолекулярные взаимодействия позволяют образование комплексов, которые варьируются в размерах от мономеров олигомеров и повлиять на стабильность сигнализации комплексов. Таким образом, изучение механизмов контроля динамики белков является новый вызов в клеточной биологии, необходимо понять сигнальных путей и определить функции непредвиденные клеток.
Были разработаны некоторые оптические методы для изучения этих взаимодействий в живых клетках1. Среди них полное внутреннее отражение микроскопии флуоресцирования (TIRF), разработанная в начале 1980-х годов, позволяет изучения молекулярных взаимодействий на или вблизи мембраны клетки2. Для изучения динамических параметров мембранных белков траекторий полученных данных TIRF в живых клетках, требуется одна частица отслеживания метод (SPT). Хотя некоторые алгоритмы доступны для этого, мы в настоящее время использовать тех, опубликованной3 Jaqaman et al., что адрес неоднородности движения частиц в поле плотные частицы, связывая частицы между последовательными кадрами для подключения в результате трек сегменты в полной траектории (временные частиц исчезновение). Программное обеспечение захватывает частицы, объединение и разбиение что результат агрегации и диссоциации события3. Один из выходных данных этого программного обеспечения является обнаружение частиц по всей траектории, определяя их X и Y позиции в каждом кадре.
После обнаружения частиц, мы применяем различные алгоритмы для определения короткий слаборазвитость диффузии коэффициент (D1-4)4,5. Применяя анализ8 момент расширения спектра (MSS)6,7,или путем установки значения «альфа» регулировка среднеквадратичной перемещения (MSD) на кривой9мы также классифицировать частицы согласно Тип траектории.
Анализ пятно интенсивности флуоресценции изображения является общей целью для ученых в области10,11. Наиболее распространенными алгоритм, используемый является так называемый номер и яркость. Этот метод тем не менее не позволяет правильно по кадрам интенсивности обнаружения частиц в мобильных фракции. Таким образом, мы породили новый алгоритм для оценки этих частиц света--кадра и определить состояние их агрегирования. Как только координаты каждой частицы определяются с помощью программного обеспечения U-Track23, мы определяем его интенсивность в каждом фрейме над полным траектории, принимая также во внимание фона ячейки в каждом кадре. Это программное обеспечение предлагает различные возможности для определения интенсивности пятно и фона ячейки и, используя известные мономерные и димерной белков в качестве ссылки, вычисляет приблизительное количество белков в обнаруженных частиц (размер кластера).
В этой статье мы опишем тщательное руководство выполнение этих трех шагов: 1) обнаружения и отслеживания одной частицы вдоль видео микроскопии флуоресцирования, с помощью U-трек; 2) анализ коэффициент мгновенной диффузии (D1-4) из этих частиц и типа движения (замкнутых, бесплатно или режиссер) частиц с длиной траекторий по УВО; 3) измерения интенсивность пятно вдоль видео исправить предполагаемое фон флуоресценции для каждого пятна. Это позволяет Оценка размера кластера и определение Фотообесцвечивание шагов.
Использование этого протокола не требует специальных навыков и может быть выполнена в любой лаборатории с клеточной культуры, поток цитометрии и микроскопии. Протокол использует ImageJ или Фиджи (распределение ImageJ12), U-track3и некоторые ad hoc сделал процедуры (http://i2pc.es/coss/Programs/protocolScripts.zip). U-трек и специальных процедур пробегают Matlab, который может быть установлен в любой совместимый компьютер.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:797px;" width="797">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">Human Jurkat cells</td>
			<td style="width:203px;">ATCC</td>
			<td style="width:203px;">CRL-10915</td>
			<td style="width:171px;">Human T cell line. Any other cell type can be analyzed with this software</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:221px;">pAcGFPm-N1 (PT3719-5)DNA3GFP</td>
			<td style="width:203px;">Clontech</td>
			<td style="width:203px;">632469</td>
			<td>Different fluorescent proteins can be followed and analyzed with this routine</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:221px;">Gene Pulse X Cell electroporator&#160;</td>
			<td>BioRad&#160;</td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td>We use 280V, 975 mF, for Jurkat cells.&#160; Use the transfection method best working in your hands.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cytomics FC 500 flow cytometer&#160;</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MoFlo Astrios Cell Sorter&#160;</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td>Depending on the level of transfection, cell sorting may not be required.&#160; You can also employ cells with stable expression of adequate levels of the receptor of interest.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">Dako Qifikit</td>
			<td style="width:203px;">DakoCytomation</td>
			<td style="width:203px;">K0078</td>
			<td>Used for quantification the number of receptors in the cell surface.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">Glass bottom microwell dishes</td>
			<td style="width:203px;">MatTek corporation</td>
			<td style="width:203px;">P35G-1.5-10-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:221px;">Human Fibronectin from plasma</td>
			<td style="width:203px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:203px;">F0895</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">Recombinant human CXCL12</td>
			<td style="width:203px;">PeproTech</td>
			<td style="width:203px;">300928A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">Inverted Leica AM TIRF</td>
			<td style="width:203px;">Leica</td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">EM-CCD camera</td>
			<td style="width:203px;">Andor&#160;</td>
			<td style="width:203px;">DU 885-CSO-#10-VP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">MATLAB</td>
			<td style="width:203px;">The MathWorks, Natick, MA</td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">U-Track2 software</td>
			<td style="width:203px;">Danuser Laboratory</td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">ImageJ</td>
			<td style="width:203px;">NIH</td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td>https://imagej.nih.gov/ij/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">FiJi</td>
			<td style="width:203px;">FiJI</td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td>https://imagej.net/Fiji)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">u-Track2 software</td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td>Matlab tool.&#160; For installing, download .zip file from the web page (http://lccb.hms.harvard.edu/software.html) and uncompress the file in a directory of your choice</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">GraphPad Prism</td>
			<td style="width:203px;">GraphPad software</td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

image processing protocol for the analysis of the diffusion and cluster size of membrane receptors by fluorescence microscopy

Отслеживание на видео последовательности и задняя анализ их траекторий частиц в настоящее время является общей операцией во многих биологических исследованиях. С помощью анализа рецептор клеточной мембраны кластеры как модель, мы представляем подробный протокол для этой задачи анализа изображений, с помощью Matlab процедуры и Фиджи (ImageJ): 1) определить регионы интереса и дизайн масок, адаптированных для этих регионов; 2) отслеживать частицы в видео микроскопии флуоресцирования; 3) проанализируйте характеристики распространения и интенсивности выбранных треков. Количественный анализ коэффициентов диффузии, типы движения и размер кластера получены микроскопии флуоресцирования и обработки изображений обеспечивает ценный инструмент для объективно определить динамику частиц и последствия изменения условия окружающей среды. В этой статье мы представляем подробные протоколы для анализа этих функций. Метод, описанный здесь не только позволяет одной молекулы отслеживания обнаружения, но также автоматизирует Оценка параметров поперечной диффузии на клеточные мембраны, классифицирует тип траектории и позволяет полный анализ таким образом преодолеть трудности в количественном определении размера пятна по всей траектории в клеточной мембраны.

Использование этого протокола позволяет автоматизированного отслеживания частиц, обнаруженной в микроскопии флуоресцирования фильмы и анализ их динамических характеристик. Первоначально клетки являются transfected с белком дневно в сочетании отслеживаться. Соответств...

Watch this Scientific Journal Video about Image Processing Protocol for the Analysis of the Diffusion and Cluster Size of Membrane Receptors by Fluorescence Microscopy at JoVE.com

Image Processing Protocol for the Analysis of the Diffusion and Cluster Size of Membrane Receptors by Fluorescence Microscopy

Изображений, обработки протокол для анализа распространения и размер кластера мембранных рецепторов по микроскопии флуоресцирования

Здесь мы представляем собой протокол для одной частицы, отслеживания анализа изображений, что позволяет дать количественную оценку коэффициентов диффузии, типы движения и кластер размеров одной частицы, обнаруженных микроскопии флуоресцирования.

Particle tracking on a video sequence and the posterior analysis of their trajectories is nowadays a common operation in many biological studies. Using ...

Новые методы микроскопии требуют разработки адекватных инструментов для правильного понимания изучаемых биологических процессов. Этот протокол описывает шаги обработки изображений, необходимые для одноямекулярного слежения, включая оценку параметров боковой диффузии и количественную оценку размера пятна по всей его траектории на клеточной мембране. Этот протокол сочетает в себе использование нескольких программных частей, в том числе ImageJ, MATLAB и uTrack, а также некоторые белки, которые были разработаны специально для этого протокола.Этот метод иллюстрируется с отслеживанием мембранных рецепторов под световой микроскопией, но он может быть применен к любой структуре, похожей на частицы, траектории которой можно отслеживать с течением времени в видеоряде. Этот метод относится к фундаментальным исследованиям и не имеет прямого применения в клинических условиях. Тем не менее, он может быть использован для оказания помощи в характеристике биологических событий как при различных заболеваниях, так и, следовательно, в выявлении новых терапевтических целей.Этот протокол актуален для отслеживания частиц в клеточных мембранах, как показано на этом видео, но он также может быть применен для отслеживания полных клеток, бактерий, наночастиц в жидкости, или какой бы другой объект, центр которого может быть хорошо определен. Этот протокол является удобным для пользователя и требует только знания клеточной культуры и методов микроскопии. Различные методы и средства информатики, используемые в этом протоколе, могут запугать нового пользователя.Визуальная демонстрация помогает использовать эту технику с уверенностью. Для начала выращивайте клетки юрката, трансфицировать их мономерным вектором рецепторов хемокина с маркировкой GFP, и отбирайте клетки с низким уровнем экспрессии обозначенного вектора, как описано в сопроводительном текстовом протоколе. Добавить средства массовой информации, содержащие CXCL12 лиганд или средства управления для каждого фибронектина покрытием 35-миллиметровый стеклянный дно микроуровн блюда, которые были покрыты фибронектином, и инкубировать в течение одного часа при 37 градусов по Цельсию.Затем добавьте отсортированные клетки к каждому блюду и инкубировать в течение 20 минут до визуализации клеток. После инкубации перенесите первое блюдо клеток на стадию микроскопа TIRF и поверните к цели 100-х нефтяного погружения. Найдите и сосредоточьтесь на клетках, используя яркое поле, чтобы свести к минимуму эффекты фотоотвечивания.Затем переключитесь в режим TIRF и выполните корректировку тонкой фокусировки с использованием низкой интенсивности лазера. Приобретайте фильмы длиной около 50 секунд, минимизируя интервал времени между кадрами. Для каждого экспериментального видео файла состояния создайте новую папку в соответствии с указаниями структуры файлов, описанными в текстовом протоколе этого видео.Откройте видео с Фиджи или ImageJ, перетащив и сбросив файл на бар меню Фиджи, и нажмите на OK для импорта файла LIF с использованием биоформатов. Для того, чтобы спроектировать маску, также импортируют соответствующее многоканайное изображение. Далее создайте маску, сначала создав единое изображение с каналами, полезными для дизайна маски.Выберите изображение в меню бара и щелкните Color, а затем разделите каналы, чтобы показать различные каналы в качестве отдельных изображений. Сливать снова три канала в одном изображении, выбрав изображение в меню бара, переходя к цвету, и выбрав каналы слияния. Убедитесь в том, чтобы выбрать соответствующие каналы, а затем нажмите OK для создания нового не-сложенного изображения.Синхронизируйте два окна, заехав в меню бара, выбрав Анализ, а затем переехав в Tools и выбрав Sync Windows. Будет показано новое окно с возможностями синхронного изображения. Теперь, когда два окна синхронизированы, один и тот же регион в обоих окнах может быть обрезан.Перейдите к изображению в меню бара и выберите Crop. С помощью прямоугольного инструмента отбора нарисуйте область интереса. Два обрезанных изображения будут показаны индивидуально.Далее, раздвоить оба окна. Если маска не была создана, нарисуйте область интереса инструментом отбора и урожаем. После этого сохраните видео в качестве последовательности изображений в каталоге Videosec.Затем выберите многоканальную изображение, перейдите в Plugins в меню и выберите редактор сегментации, чтобы открыть плагин редактора сегментации. Выберите инструмент выбора от руки, и использовать его, чтобы выбрать зеленую этикетку и дизайн внешней маски. После его запуска нажмите кнопку Plus в опции выбора композитного окна, а выбранная маска будет отображаться на зрителе.Повторите этот шаг для всех меток. После того, как все маски разработаны, сохранить маску с тем же именем файла, как видео, с именем:mask.tif. Откройте MATLAB и добавьте каталог uTrack на путь, отоберите Путь и выбрав Add With.Затем измените Рабочий каталог на каталог, содержащий серию, которая будет проанализирована. Вызовите uTrack, введя графический интерфейс movie Selector в консоли и нажав на Enter. Это приведет к тому, что окно выбора фильма будет открыто.Нажмите на кнопку «Новый фильм» и подождите, пока появится окно Movie Addition. Нажмите на Add Channel, чтобы выбрать каталог с видео и заполнить параметры информации о фильме. Установите каталог вывода для результатов uTrack к результатам, затем нажмите на Расширенные настройки канала, заполните параметры, связанные с приобретением, и сохраните.После создания фильма, нажмите на Продолжить в окне выбора фильма. Здесь uTrack спросит о типе объекта, который будет проанализирован. Выберите одиночные частицы, и тогда появится окно панели управления.Далее выберите первый шаг, шаг 1: Обнаружение, и нажмите на настройки. Появится окно установки гауссийской модели mixture Fitting. Введите настройки, как показано здесь, а затем нажмите Применить.В панели управления нажмите на Run, чтобы выйти на шаг обнаружения. Через несколько минут проверьте результаты, нажав кнопку Результат. В фильме показаны красные круги на обнаруженных частицах.Если красный круг не отображается, то этот шаг не сработал правильно, и вы должны попробовать еще раз. Теперь, объединить частицы, которые были только что обнаружены в треки, которые охватывают несколько кадров, сначала настройка параметров, как показано здесь. Затем нажмите Run в панели управления.Далее выполните трек-анализ. Определите настройки, как показано здесь, а затем нажмите Применить и запустить. Проверьте результаты, сначала нажав на кнопку Результат, а затем нажмите на Show Track Номер окна вариантов фильма и проверить кадр за кадром, что каждый трек был правильно идентифицирован, вручную маркировки частиц, которые не являются истинными частицами.В MATLAB введите команду, как показано здесь. Эта команда приведет к тому, что программа прочитает все траектории и вычислит коэффициенты диффузии. Далее исключите траектории, соответствующие неправильно идентифицированным пятнам или траекториям, давая список пятен для исключения.Рассчитайте коэффициенты мгновенной диффузии для каждого из треков этой ячейки, следуя вместе в сопроводительном текстовом протоколе. В этом случае вычислить коэффициент диффузии для времени-лаг равен 4 называется D1 до 4. После завершения разложите траектории на короткие и длинные траектории.Чтобы проанализировать длинные траектории, ввемите команду, показанную здесь, чтобы классифицировать тип движения через их спектр масштабирования момента. Проанализируйте интенсивность каждой частицы по их траектории. Настройте это базовое поведение по-разному, следуя в сопроводительном текстовом протоколе.Затем соберите информацию о диффузии и интенсивности для всех траекторий. Соберите только информацию о диффузии и интенсивности для коротких траекторий. Наконец, соберите момент масштабирования спектра и интенсивность информации, введя следующее, где долго суффикс используется ранее.Использование методов, описанных в этом протоколе, позволяет осуществлять автоматизированное отслеживание частиц, обнаруженных в флуоресцентных микроскопических фильмах, и анализ их динамических характеристик. Из этого анализа можно получить различные характеристики, основанные на вариациях стимулов. Это включает в себя процент неподвижных пятен на основе четырех различных стимулов, процент длинных траекторий более 50 кадров, а также типы движения по траекториям, разбитым направленными, свободными или ограниченными движениями.Кроме того, можно определить коэффициент диффузии, средние интенсивности пятна и количество рецепторов на частицу. Это показывает распределение значений короткого коэффициента диффузии для каждого места в ответ на различные стимулы. Красная линия представляет среднее значение, этот аналогичный график показывает средние интенсивности пятна для каждого пятна вдоль его первых 20 кадров в ответ на те же стимулы.Опять же, красная линия представляет среднее значение интенсивности. Поскольку средняя скорректированная интенсивность пятна связана с количеством флуоресцентных белков, присутствующих в этом месте, можно непосредственно рассчитать количество рецепторов на частицу, как показано здесь. MATLAB — это чувствительный к делу язык программирования.Вы можете изменять переменные имена по отношению к тем, которые описаны в этом протоколе, но не забудьте быть последовательными в своем названии. Названия функций не могут быть изменены, и запятые, толстой кишки, и полу-колонов имеют важное значение для правильного синтаксиса. Одномолекулярная микроскопия позволяет визуализировать отдельные мембранные белки с беспрецедентным пространственно-временным разрешением и предоставляет уникальные возможности для выявить непредвиденные аспекты клеточной биологии.Эти протоколы открывают новые двери для количественного анализа видео микроскопии в клетках и молекулярной биологии.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Intravital Microscopy of the Spleen: Quantitative Analysis of Parasite Mobility and Blood Flow

Прижизненное микроскопия Селезенка: Количественный анализ паразитов Мобильность и кровотока

The advent of intravital microscopy in experimental rodent malaria models has allowed major advances to the knowledge of parasite-host interactions 1,2. ...

Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

Одноклеточный анализ Сенная Bacillus Биопленки с помощью флуоресцентной микроскопии и проточной цитометрии

Biofilm formation is a general attribute to almost all bacteria 1-6. When bacteria form biofilms, cells are encased in extracellular matrix that is mostly ...

Antigens Protected Functional Red Blood Cells By The Membrane Grafting Of Compact Hyperbranched Polyglycerols

Антигены охраняемых Функциональные эритроциты Мембрана прививки Компактный сверхразветвленных полиглицерины

Red blood cell (RBC) transfusion is vital for the treatment of a number of acute and chronic medical problems such as thalassemia major and sickle cell ...

Fluorescence Microscopy Methods for Determining the Viability of Bacteria in Association with Mammalian Cells

Флуоресцентной микроскопии Методы определения жизнеспособности бактерий в ассоциации с клетках млекопитающих

Central to the field of bacterial pathogenesis is the ability to define if and how microbes survive after exposure to eukaryotic cells. Current protocols ...

Analysis of the Epithelial Damage Produced by Entamoeba histolytica Infection

Analysis of the Epithelial Damage Produced by Entamoeba histolytica Infection

Анализ ущерба эпителиальных Продюсеры<em&gt; Entamoeba гистолитика</em&gt; Инфекция

Entamoeba histolytica is the causative agent of human amoebiasis, a major cause of diarrhea and hepatic abscess in tropical countries. Infection is ...

Measuring Phagosome pH by Ratiometric Fluorescence Microscopy

Измерение рН фагосомы по Логометрический флуоресцентной микроскопии

Phagocytosis is a fundamental process through which innate immune cells engulf bacteria, apoptotic cells or other foreign particles in order to kill or ...

Cortical Actin Flow in T Cells Quantified by Spatio-temporal Image Correlation Spectroscopy of Structured Illumination Microscopy Data

Корковая актин расхода в Т-клетках количественно пространственно-временной корреляционной спектроскопии Изображение структурированных данных микроскопии Освещение

Filamentous-actin plays a crucial role in a majority of cell processes including motility and, in immune cells, the formation of a key cell-cell ...

Preparation of CD4+ T Cells for Analysis of GD3 and GD2 Ganglioside Membrane Expression by Microscopy

Preparation of CD4+ T Cells for Analysis of GD3 and GD2 Ganglioside Membrane Expression by Microscopy

Получение CD4<sup&gt; +</sup&gt; Т-клеток для анализа GD3 и GD2 Ганглиозид Мембранная Expression микроскопией

The methods described herein for activation of na&#239;ve CD4+ T cells in suspension and their adherence in coverslips for confocal microscopy analysis ...

Molecular Diffusion in Plasma Membranes of Primary Lymphocytes Measured by Fluorescence Correlation Spectroscopy

Молекулярная диффузия в плазматических мембранах первичных лимфоцитах Измеренные с помощью флуоресцентной корреляционной спектроскопии

Fluorescence correlation spectroscopy (FCS) is a powerful technique for studying the diffusion of molecules within biological membranes with high spatial ...