Name: image processing protocol for the analysis of the diffusion and cluster size of membrane receptors by fluorescence microscopy
Uploaded: 2019-04-09T14:30:00
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Estamos agradecidos a Carlo Manzo y Maria García Parajo por su ayuda y código fuente de los análisis de coeficiente de difusión. Este trabajo fue apoyado en parte por subvenciones del Ministerio de ciencia, innovación y universidades (SAF 2017-82940-R) y el programa RETICS del Instituto de salud Carlos III (RD12/0009/009 y RD16/0012/0006; RIER). LMM y JV son apoyadas por el programa COMFUTURO de la Fundación General CSIC.

1. preparación de muestras biológicas
<ol><li>Cultivar células de Jurkat en Medio RPMI 1640 suplementado con 10% FCS, NaPyr y L-glutamina (RPMI completo). Células de Electroporate Jurkat (20 x 106 células/400 μL de RPMI 1640 con 10% FCS) con un vector del receptor del chemokine etiquetados GFP monomérico (CXCR4-AcGFP, 20 μg) para permitir su detección mediante microscopía de fluorescencia. Nota: Es posible utilizar otras monoméricas fluorescentes como mCherry, mScarlet, etceter...

<ol>
	<li>Yu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+studies+in+live+cells.">Single-molecule studies in live cells.</a> Annual Review of Pysical Chemistry. 67 (565-585), (2016).</li><li>Mattheyses, A. L., Simon, S. M., Rappoport, J. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+with+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy+for+the+cell+biologist.">Imaging with total internal reflection fluorescence microscopy for the cell biologist.</a> Journal of Cell Science. 123 (Pt 21), 3621-3628 (2010).</li><li>Jaqaman, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+single-particle+tracking+in+live-cell+time-lapse+sequences.">Robust single-particle tracking in live-cell time-lapse sequences.</a> Nature Methods. 5 (8), 695-702 (2008).</li><li>Bakker, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lateral+mobility+of+individual+integrin+nanoclusters+orchestrates+the+onset+for+leukocyte+adhesion.">Lateral mobility of individual integrin nanoclusters orchestrates the onset for leukocyte adhesion.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 109 (13), 4869-4874 (2012).</li><li>Kusumi, A., Sako, Y., Yamamoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confined+lateral+diffusion+of+membrane+receptors+as+studied+by+single+particle+tracking+(nanovid+microscopy).+Effects+of+calcium-induced+differentiation+in+cultured+epithelial+cells.">Confined lateral diffusion of membrane receptors as studied by single particle tracking (nanovid microscopy). Effects of calcium-induced differentiation in cultured epithelial cells.</a> Biophysical Journal. 65 (5), 2021-2040 (1993).</li><li>Ferrari, R. M., Manfroi, A. J., Young, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strongly+and+weakly+self-similar+diffusion.">Strongly and weakly self-similar diffusion.</a> Physica D. 154, 111-137 (2001).</li><li>Sbalzarini, I. F., Koumoutsakos, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feature+point+tracking+and+trajectory+analysis+for+video+imaging+in+cell+biology.">Feature point tracking and trajectory analysis for video imaging in cell biology.</a> Journal of Structural Biology. 151 (2), 182-195 (2005).</li><li>Ewers, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-particle+tracking+of+murine+polyoma+virus-like+particles+on+live+cells+and+artificial+membranes.">Single-particle tracking of murine polyoma virus-like particles on live cells and artificial membranes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 102 (42), 15110-15115 (2005).</li><li>Manzo, C., Garcia-Parajo, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+progress+in+single+particle+tracking:+from+methods+to+biophysical+insights.">A review of progress in single particle tracking: from methods to biophysical insights.</a> Report on Progress in Physics. 78 (12), 124601 (2015).</li><li>Calebiro, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+analysis+of+fluorescently+labeled+G-protein-coupled+receptors+reveals+complexes+with+distinct+dynamics+and+organization.">Single-molecule analysis of fluorescently labeled G-protein-coupled receptors reveals complexes with distinct dynamics and organization.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 110 (2), 743-748 (2013).</li><li>Digman, M. A., Dalal, R., Horwitz, A. F., Gratton, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+the+number+of+molecules+and+brightness+in+the+laser+scanning+microscope.">Mapping the number of molecules and brightness in the laser scanning microscope.</a> Biophysical Journal. 94 (6), 2320-2332 (2008).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Martinez-Munoz, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separating+Actin-Dependent+Chemokine+Receptor+Nanoclustering+from+Dimerization+Indicates+a+Role+for+Clustering+in+CXCR4+Signaling+and+Function.">Separating Actin-Dependent Chemokine Receptor Nanoclustering from Dimerization Indicates a Role for Clustering in CXCR4 Signaling and Function.</a> Molecular Cell. 70 (1), 106-119 (2018).</li><li>Destainville, N., Salome, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+and+correction+of+systematic+errors+due+to+detector+time-averaging+in+single-molecule+tracking+experiments.">Quantification and correction of systematic errors due to detector time-averaging in single-molecule tracking experiments.</a> Biophysical Journal. 90 (2), L17-L19 (2006).</li></ol>

El método descrito es fácil de realizar incluso sin tener experiencia previa trabajando con Matlab. Sin embargo, las rutinas de Matlab extremadamente requieren exactitud con la nomenclatura de los diferentes comandos y la localización de las diferentes carpetas empleados por el programa. En el seguimiento de rutina de análisis (paso 3), pueden modificarse varios parámetros. La ventana de "Configuración gaussiana-mezcla modelo montaje" (paso 3.8) controla cómo U-track detecta partículas individuales en el video. E...

Proteínas de la membrana incrustadas en la bicapa lipídica están en continuo movimiento debido a la difusión térmica. Sus dinámicas son esenciales para regular las respuestas celular, Interacciones intermoleculares permiten la formación de complejos que varían en tamaño desde monómeros oligómeros e influir en la estabilidad de complejos de señalización. Elucidar los mecanismos que controlan la dinámica de la proteína es así un nuevo reto en la biología de la célula, necesario para entender las vías de transducción de señal y para identificar funciones imprevistas.
Se han desarrollado algunos métodos ópticos para el estudio de estas interacciones en la vida de las células1. Entre estos, microscopía de fluorescencia (TIRF) de reflexión interna total, desarrollado en la década de 1980, permite el estudio de las interacciones moleculares en o muy cerca de la membrana de la célula2. Para estudiar los parámetros dinámicos de las trayectorias de la proteína de membrana obtenidas de TIRF datos en células vivas, se requiere una sola partícula (SPT) del método de seguimiento. Aunque para esto existen varios algoritmos, utilizamos actualmente las publicadas por Jaqaman et al.3 dirección heterogeneidad del movimiento de partículas en un campo de partículas densas uniendo partículas entre fotogramas consecutivos para conectar la pista resultante segmentos en trayectorias completadas (desaparición de partículas temporales). El software captura la partícula combinar y dividir ese resultado de agregación y disociación de eventos3. Uno de los datos de salida de este software es la detección de las partículas a lo largo de la trayectoria entera definiendo sus posiciones X e Y en cada fotograma.
Una vez que las partículas se detectan, se aplican diferentes algoritmos para determinar el intervalo corto difusión coeficiente (D1-4)4,5. Aplicando el análisis de espectro de escalamiento de momento (MSS)6,7,8 o ajustando el valor de 'alpha' por ajuste de desplazamiento cuadrático medio (MSD) a la curva9, también clasificar las partículas según el tipo de trayectoria.
Análisis de intensidad de la mancha en imágenes de fluorescencia es un objetivo compartido por los científicos en el campo10,11. El algoritmo más común utilizado es el número llamado y el brillo. Este método, sin embargo, no permite detección de correcta intensidad del cuadro a cuadro en las partículas en la fracción móvil. Así, hemos generado un nuevo algoritmo para evaluar estas partículas intensidades fotograma por fotograma y para determinar su estado de agregación. Una vez que las coordenadas de cada partícula se detectan utilizando U-Track2 software3, definimos su intensidad en cada fotograma sobre la trayectoria completa, teniendo en cuenta también el fondo de la celda en cada fotograma. Este software ofrece diferentes posibilidades para determinar la intensidad de la mancha y el fondo de la célula y utilizando proteínas monoméricas y dimérica conocidas como referencias, calcula el número aproximado de proteínas en la partícula detectada (tamaño del clúster).
En este artículo, describimos una guía cuidadosa para realizar estos tres pasos: 1) detección y seguimiento de las partículas individuales a lo largo de un vídeo de la microscopia de fluorescencia utilizando U-; 2) analizando el coeficiente de difusión instantánea (D1-4) de las partículas y el tipo de movimiento (confinado, libre o dirigido) de partículas con trayectorias largas por SMS; 3) medición de la intensidad de la mancha a lo largo del video corregido por la fluorescencia de fondo estimado para cada punto. Esto permite la estimación del tamaño de racimo y la identificación de los pasos de fotoblanqueo.
El uso de este Protocolo no requiere habilidades especializadas y se puede realizar en cualquier laboratorio con cultivo celular, servicios de microscopia y citometría de flujo. El protocolo utiliza ImageJ o Fiji (una distribución de ImageJ12), U-track3y algunas rutinas de hoc hecho ad (http://i2pc.es/coss/Programs/protocolScripts.zip). Rutinas U-track y ad hoc funcionan sobre Matlab que puede instalarse en cualquier computadora compatible.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:797px;" width="797">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">Human Jurkat cells</td>
			<td style="width:203px;">ATCC</td>
			<td style="width:203px;">CRL-10915</td>
			<td style="width:171px;">Human T cell line. Any other cell type can be analyzed with this software</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:221px;">pAcGFPm-N1 (PT3719-5)DNA3GFP</td>
			<td style="width:203px;">Clontech</td>
			<td style="width:203px;">632469</td>
			<td>Different fluorescent proteins can be followed and analyzed with this routine</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:221px;">Gene Pulse X Cell electroporator&#160;</td>
			<td>BioRad&#160;</td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td>We use 280V, 975 mF, for Jurkat cells.&#160; Use the transfection method best working in your hands.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cytomics FC 500 flow cytometer&#160;</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MoFlo Astrios Cell Sorter&#160;</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td>Depending on the level of transfection, cell sorting may not be required.&#160; You can also employ cells with stable expression of adequate levels of the receptor of interest.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">Dako Qifikit</td>
			<td style="width:203px;">DakoCytomation</td>
			<td style="width:203px;">K0078</td>
			<td>Used for quantification the number of receptors in the cell surface.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">Glass bottom microwell dishes</td>
			<td style="width:203px;">MatTek corporation</td>
			<td style="width:203px;">P35G-1.5-10-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:221px;">Human Fibronectin from plasma</td>
			<td style="width:203px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:203px;">F0895</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">Recombinant human CXCL12</td>
			<td style="width:203px;">PeproTech</td>
			<td style="width:203px;">300928A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">Inverted Leica AM TIRF</td>
			<td style="width:203px;">Leica</td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">EM-CCD camera</td>
			<td style="width:203px;">Andor&#160;</td>
			<td style="width:203px;">DU 885-CSO-#10-VP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">MATLAB</td>
			<td style="width:203px;">The MathWorks, Natick, MA</td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">U-Track2 software</td>
			<td style="width:203px;">Danuser Laboratory</td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">ImageJ</td>
			<td style="width:203px;">NIH</td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td>https://imagej.nih.gov/ij/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">FiJi</td>
			<td style="width:203px;">FiJI</td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td>https://imagej.net/Fiji)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">u-Track2 software</td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td>Matlab tool.&#160; For installing, download .zip file from the web page (http://lccb.hms.harvard.edu/software.html) and uncompress the file in a directory of your choice</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">GraphPad Prism</td>
			<td style="width:203px;">GraphPad software</td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

image processing protocol for the analysis of the diffusion and cluster size of membrane receptors by fluorescence microscopy

Rastreo en una secuencia de vídeo y el posterior análisis de sus trayectorias de partículas hoy en día es una operación común en muchos estudios biológicos. Usando el análisis del receptor de membrana de la célula de clusters como un modelo, presentamos un protocolo detallado para esta tarea de análisis de imagen con Fiji (ImageJ) y rutinas Matlab para: 1) definir regiones de interés y diseñar máscaras adaptadas a estas regiones; 2) rastrear las partículas en los videos de la microscopia de fluorescencia; 3) analizar las características de difusión y la intensidad de las pistas. El análisis cuantitativo de los coeficientes de difusión, tipos de movimiento y el tamaño de cluster obtenida por microscopía de fluorescencia y procesamiento de imágenes proporciona una herramienta valiosa para determinar objetivamente la dinámica de la partícula y las consecuencias de la modificación de condiciones ambientales. En este artículo presentamos protocolos detallados para el análisis de estas características. El método descrito aquí no sólo permite la detección de una sola molécula de seguimiento, pero también automatiza la estimación de los parámetros de difusión lateral en la membrana celular, clasifica el tipo de trayectoria y permite análisis completo superando así la dificultades para cuantificar el tamaño de punto durante su trayectoria entera en la membrana celular.

El uso de este protocolo permite el seguimiento automatizado de las partículas detectadas en películas de microscopía de fluorescencia y el análisis de sus características dinámicas. Inicialmente, las células son transfectadas con la proteína fluorescente junto a ser rastreados. El nivel apropiado de receptores se presenta en la superficie celular que permite que SPT se obtiene por célula clasificación (figura 1). Las células son analizadas por mic...

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Image Processing Protocol for the Analysis of the Diffusion and Cluster Size of Membrane Receptors by Fluorescence Microscopy

Procesamiento de imagen protocolo para el análisis de la difusión y del tamaño del clúster de receptores de membrana por microscopía de fluorescencia

Aquí, presentamos un protocolo para la sola partícula seguimiento análisis de imagen que permite la evaluación cuantitativa de los coeficientes de difusión, tipos de movimiento y racimo de tamaños de partículas solo detectados por microscopía de fluorescencia.

Particle tracking on a video sequence and the posterior analysis of their trajectories is nowadays a common operation in many biological studies. Using ...

Las nuevas técnicas de microscopía requieren el desarrollo de herramientas adecuadas para la correcta comprensión de los procesos biológicos que se estudian. Este protocolo describe los pasos de procesamiento de imágenes necesarios para el seguimiento de una sola molécula, incluida la estimación de los parámetros de difusión lateral y la cuantificación del tamaño del punto sobre toda su trayectoria en la membrana celular. Este protocolo combina el uso de varias piezas de software, incluyendo ImageJ, MATLAB y uTrack, así como algunas proteínas que han sido desarrolladas específicamente para este protocolo.Este método se ilustra con el seguimiento de los receptores de membrana bajo microscopía de luz, pero se puede aplicar a cualquier estructura similar a partículas cuyas trayectorias se pueden rastrear a lo largo del tiempo en una secuencia de vídeo. Esta técnica se relaciona con la investigación básica y no tiene aplicación directa en un entorno clínico. Sin embargo, se puede utilizar para ayudar en la caracterización de eventos biológicos tanto en diferentes enfermedades como, por lo tanto, en la identificación de nuevas dianas terapéuticas.Este protocolo es relevante para el seguimiento de partículas en membranas celulares, como se muestra en este video, pero también se puede aplicar para el seguimiento de células completas, bacterias, nanopartículas en un fluido, o cualquier otro objeto cuyo centro pueda estar bien determinado. Este protocolo es fácil de usar y sólo requiere conocimientos de cultivo celular y técnicas de microscopía. Las diferentes técnicas y herramientas informáticas empleadas en este protocolo pueden intimidar a un nuevo usuario.La demostración visual ayuda a utilizar esta técnica con confianza. Para empezar, las células de Jurkat, transfectándolas con un vector receptor de chemokina monomérico con etiqueta GFP, y seleccione las células con niveles de expresión bajos del vector etiquetado, como se describe en el protocolo de texto que lo acompaña. Agregue medios que contengan el ligando CXCL12 o medios de control a cada microposobro recubierto de fibronectina de 35 milímetros que hayan sido recubiertos con fibronectina, e incubar durante una hora a 37 grados centígrados.A continuación, agregue las células ordenadas a cada plato e incubar durante 20 minutos antes de tomar imágenes de las células. Después de la incubación, transfiera el primer plato de células a una etapa del microscopio TIRF y déjese pasar al objetivo de inmersión de aceite 100x. Localice y concéntrese en las celdas utilizando el campo brillante para minimizar los efectos de fotoblancha.A continuación, cambie al modo TIRF y realice un ajuste de enfoque fino utilizando una intensidad láser baja. Adquiere películas de aproximadamente 50 segundos de duración, minimizando el intervalo de tiempo entre fotogramas. Para cada archivo de vídeo de condición experimental, cree una nueva carpeta siguiendo las instrucciones de la estructura de archivos descritas en el protocolo de texto de este vídeo.Abra el vídeo con Fiji o ImageJ arrastrando y soltando el archivo en la barra de menús de Fiji, y haga clic en Aceptar para importar el archivo LIF utilizando bioformatos. Para diseñar una máscara, también importe la imagen multicanal correspondiente. A continuación, cree una máscara creando primero una sola imagen con los canales útiles para el diseño de la máscara.Seleccione Imagen en el menú de la barra y haga clic en Color seguido de Canales divididos para mostrar los diferentes canales como imágenes independientes. Combina de nuevo los tres canales de una sola imagen seleccionando Imagen en el menú de la barra, yendo a Color y seleccionando Combinar canales. Asegúrese de seleccionar los canales adecuados y, a continuación, pulse OK para generar una nueva imagen no apilada.Sincronice las dos ventanas yendo al menú de la barra, seleccionando Analizar y, a continuación, vaya a Herramientas y seleccionando Sincronizar Windows. Se mostrará una nueva ventana con las posibilidades de imagen sincronizada. Ahora, con las dos ventanas sincronizadas, se puede recortar la misma región en ambas ventanas.Vaya a Imagen en el menú de la barra y seleccione Recortar. Con la herramienta de selección rectangular, dibuje la región de interés. Las dos imágenes recortadas se mostrarán individualmente.A continuación, desincronice ambas ventanas. Si no se ha creado ninguna máscara, dibuje la región de interés con la herramienta de selección y el recorte. Después de eso, guarde el vídeo como una secuencia de imágenes en el directorio Videosec.A continuación, seleccione la imagen multicanal, vaya a Plugins en el menú y seleccione Editor de segmentación para abrir el plugin del editor de segmentación. Elija la herramienta de selección a mano alzada y utilícela para seleccionar una etiqueta verde y diseñar la máscara más externa. Una vez diseñado, pulse el botón Plus en la opción de selección de la ventana compuesta, y la máscara seleccionada se mostrará en el visor.Repita este paso para todas las etiquetas. Una vez que todas las máscaras están diseñadas, guarde la máscara con el mismo nombre de archivo que el video, con el nombre:mask.tif. Abra MATLAB y agregue el directorio uTrack a la ruta de acceso yendo a Establecer ruta y seleccionando Agregar con.A continuación, cambie el Directorio de trabajo al directorio que contiene la serie que se va a analizar. Invoque uTrack escribiendo Movie Selector GUI en la consola y presionando Intro. Esto hará que se abra la ventana de selección de película.Pulse el botón Nueva película y espere a que aparezca la ventana Adición de película. Pulse en Añadir canal para elegir el directorio con el vídeo y rellenar los parámetros de información de la película. Establezca el directorio de salida para los resultados de uTrack en Results y, a continuación, pulse en Configuración avanzada de canal, rellene los parámetros relacionados con la adquisición y guárdelos.Después de crear la película, pulse en Continuar en la ventana de selección de película. Aquí, uTrack preguntará sobre el tipo de objeto a analizar. Elija Partículas únicas y, a continuación, aparecerá la ventana del panel de control.A continuación, seleccione el primer paso, Paso 1: Detección, y haga clic en Configuración. Aparecerá la ventana Configuración de la aplicación del modelo de mezcla gaussiana. Ingrese los ajustes como se muestra aquí, y después presione aplicar.En el panel de control, haga clic en Ejecutar para ejecutar el paso de detección. Después de unos minutos, compruebe los resultados pulsando el botón Resultado. La película muestra círculos rojos en las partículas detectadas.Si no se muestra ningún círculo rojo, este paso no ha funcionado correctamente y debe intentarlo de nuevo. Ahora, combine las partículas que se acaban de detectar en pistas que abarcan varios fotogramas configurando primero los parámetros como se muestra aquí. A continuación, pulse Ejecutar en el panel de control.A continuación, realice análisis de pista. Defina la configuración, como se muestra aquí, y luego presione Aplicar y ejecutar. Verifique los resultados pulsando primero en el botón Resultado y, a continuación, haga clic en Mostrar número de pista de la ventana de opciones de película y compruebe fotograma a fotograma que cada pista se ha identificado correctamente, marcando manualmente partículas que no son partículas verdaderas.En MATLAB, ingrese el comando como se muestra aquí. Este comando hará que el programa lea todas las trayectorias y calcule los coeficientes de difusión. A continuación, excluya las trayectorias correspondientes a puntos o trayectorias identificados incorrectamente dando la lista de puntos a excluir.Calcule los coeficientes de difusión instantáneos para cada una de las pistas de esta celda siguiendo el protocolo de texto adjunto. En este caso, calcular el coeficiente de difusión para un time-lag es igual a 4 llamado D1 a 4. Cuando haya terminado, descomponga las trayectorias en trayectorias cortas y largas.Para analizar trayectorias largas, escriba el comando como se muestra aquí para clasificar el tipo de movimiento a través de su espectro de escala de momento. Analizar la intensidad de cada partícula a lo largo de su trayectoria. Configure este comportamiento básico de muchas maneras diferentes siguiendo el protocolo de texto que lo acompaña.A continuación, recopile la información de difusión e intensidad para todas las trayectorias. Reunir sólo la información de difusión e intensidad para trayectorias cortas. Por último, recopile el momento de escalado del espectro y la información de intensidad escribiendo lo siguiente, donde long es el sufijo utilizado anteriormente.El uso de las técnicas descritas en este protocolo permite el seguimiento automatizado de partículas detectadas en películas de microscopía de fluorescencia y el análisis de sus características dinámicas. A partir de este análisis, se pueden obtener diferentes características basadas en variaciones en los estímulos. Esto incluye, el porcentaje de puntos inmóviles basados en cuatro estímulos diferentes, el porcentaje de trayectorias largas de más de 50 fotogramas y los tipos de movimiento a lo largo de las trayectorias según lo descomodado por movimientos dirigidos, libres o confinados.Además, se puede determinar el coeficiente de difusión, las intensidades medias del punto y el número de receptores por partícula. Esto muestra la distribución de los valores de coeficiente de difusión cortos para cada punto en respuesta a diferentes estímulos. La línea roja representa el valor medio, este gráfico similar muestra las intensidades de punto media para cada punto a lo largo de sus primeros 20 fotogramas en respuesta a los mismos estímulos.Una vez más, la línea roja representa el valor de intensidad media. Como la intensidad corregida media de un punto está relacionada con el número de proteínas fluorescentes presentes en este punto, se puede calcular directamente el número de receptores por partícula, como se muestra aquí. MATLAB es un lenguaje de programación que distingue mayúsculas de minúsculas.Puede variar los nombres de las variables con respecto a los descritos en este protocolo, pero asegúrese de ser coherente en su nomenclatura. Los nombres de las funciones no se pueden cambiar y las comas, los dos puntos y los punto y coma son importantes para una sintaxis correcta. La microscopía de una sola molécula permite la visualización de proteínas de membrana individuales con una resolución espacio-temporal sin precedentes y proporciona oportunidades únicas para revelar aspectos imprevistos de la biología celular.Estos protocolos abren nuevas puertas para el análisis cuantitativo de videos de microscopía en células y biología molecular.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Intravital Microscopy of the Spleen: Quantitative Analysis of Parasite Mobility and Blood Flow

Microscopia intravital del bazo: Análisis cuantitativo de la movilidad del parásito y el flujo sanguíneo

The advent of intravital microscopy in experimental rodent malaria models has allowed major advances to the knowledge of parasite-host interactions 1,2. ...

Investigación

Inmunología e Infección

Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

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Sola célula de análisis de Bacillus subtilis Las biopelículas mediante microscopía de fluorescencia y citometría de flujo

Biofilm formation is a general attribute to almost all bacteria 1-6. When bacteria form biofilms, cells are encased in extracellular matrix that is mostly ...

Antigens Protected Functional Red Blood Cells By The Membrane Grafting Of Compact Hyperbranched Polyglycerols

Antígenos funcional protegido glóbulos rojos por la membrana injerto de compactos Poligliceroles hiperramificados

Red blood cell (RBC) transfusion is vital for the treatment of a number of acute and chronic medical problems such as thalassemia major and sickle cell ...

Fluorescence Microscopy Methods for Determining the Viability of Bacteria in Association with Mammalian Cells

Fluorescencia métodos de microscopía para determinar la viabilidad de las bacterias en asociación con las células de mamíferos

Central to the field of bacterial pathogenesis is the ability to define if and how microbes survive after exposure to eukaryotic cells. Current protocols ...

Analysis of the Epithelial Damage Produced by Entamoeba histolytica Infection

Analysis of the Epithelial Damage Produced by Entamoeba histolytica Infection

Análisis del daño epitelial Producido por<em&gt; Entamoeba histolytica</em&gt; Infección

Entamoeba histolytica is the causative agent of human amoebiasis, a major cause of diarrhea and hepatic abscess in tropical countries. Infection is ...

Measuring Phagosome pH by Ratiometric Fluorescence Microscopy

Medición de pH Fagosoma por Ratiometric microscopía de fluorescencia

Phagocytosis is a fundamental process through which innate immune cells engulf bacteria, apoptotic cells or other foreign particles in order to kill or ...

Cortical Actin Flow in T Cells Quantified by Spatio-temporal Image Correlation Spectroscopy of Structured Illumination Microscopy Data

Cortical de actina de flujo en células T cuantificados por espacio-temporal de correlación Imagen Espectroscopia de Estructurado Iluminación Microscopía de datos

Filamentous-actin plays a crucial role in a majority of cell processes including motility and, in immune cells, the formation of a key cell-cell ...

Preparation of CD4+ T Cells for Analysis of GD3 and GD2 Ganglioside Membrane Expression by Microscopy

Preparation of CD4+ T Cells for Analysis of GD3 and GD2 Ganglioside Membrane Expression by Microscopy

Preparación de CD4<sup&gt; +</sup&gt; Las células T para el Análisis de GD3 y GD2 gangliósidos membrana Expresión mediante microscopía

The methods described herein for activation of na&#239;ve CD4+ T cells in suspension and their adherence in coverslips for confocal microscopy analysis ...

Molecular Diffusion in Plasma Membranes of Primary Lymphocytes Measured by Fluorescence Correlation Spectroscopy

Difusión molecular en el plasma membranas de linfocitos primarios medidos por espectroscopia de correlación de fluorescencia

Fluorescence correlation spectroscopy (FCS) is a powerful technique for studying the diffusion of molecules within biological membranes with high spatial ...