Name: image processing protocol for the analysis of the diffusion and cluster size of membrane receptors by fluorescence microscopy
Uploaded: 2019-04-09T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Image Processing Protocol for the Analysis of the Diffusion and Cluster Size of Membrane Receptors by Fluorescence Microscopy at JoVE.com

Biz Carlo Manzo ve Maria García Parajo Difüzyon katsayısı analiz onların yardım ve kaynak kodu için müteşekkiriz. Bu eser kısmen İspanyol bilim Bakanlığı, yenilik ve üniversiteler (SAF 2017-82940-R) gelen hibe tarafından desteklenen ve Instituto de salud Carlos III (RD12/0009/009 ve RD16/0012/0006; RETICS programı RIER). LMM ve JV Fundación genel CSIC COMFUTURO program tarafından desteklenir.

1. biyolojik örnekler hazırlanması
<ol><li>Jurkat hücrelerin % 10 FCS ile desteklenmiş RPMI 1640 ortamda büyümesine NaPyr ve L-glutamin (tam RPMI). Bir monomeric GFP etiketli Kemokin reseptör vektör (CXCR4-onun algılama Floresans mikroskobu kullanarak izin vermek için AcGFP, 20 μg) Electroporate Jurkat hücrelerle (20 x 106 hücreler/400 µL % 10 FCS ile RPMI 1640,). Not: MCherry, mScarlet, vb gibi diğer monomeric floresan proteinler kullanmak mümkündür.</li>
	<li>transfec...

<ol>
	<li>Yu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+studies+in+live+cells.">Single-molecule studies in live cells.</a> Annual Review of Pysical Chemistry. 67 (565-585), (2016).</li><li>Mattheyses, A. L., Simon, S. M., Rappoport, J. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+with+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy+for+the+cell+biologist.">Imaging with total internal reflection fluorescence microscopy for the cell biologist.</a> Journal of Cell Science. 123 (Pt 21), 3621-3628 (2010).</li><li>Jaqaman, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+single-particle+tracking+in+live-cell+time-lapse+sequences.">Robust single-particle tracking in live-cell time-lapse sequences.</a> Nature Methods. 5 (8), 695-702 (2008).</li><li>Bakker, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lateral+mobility+of+individual+integrin+nanoclusters+orchestrates+the+onset+for+leukocyte+adhesion.">Lateral mobility of individual integrin nanoclusters orchestrates the onset for leukocyte adhesion.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 109 (13), 4869-4874 (2012).</li><li>Kusumi, A., Sako, Y., Yamamoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confined+lateral+diffusion+of+membrane+receptors+as+studied+by+single+particle+tracking+(nanovid+microscopy).+Effects+of+calcium-induced+differentiation+in+cultured+epithelial+cells.">Confined lateral diffusion of membrane receptors as studied by single particle tracking (nanovid microscopy). Effects of calcium-induced differentiation in cultured epithelial cells.</a> Biophysical Journal. 65 (5), 2021-2040 (1993).</li><li>Ferrari, R. M., Manfroi, A. J., Young, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strongly+and+weakly+self-similar+diffusion.">Strongly and weakly self-similar diffusion.</a> Physica D. 154, 111-137 (2001).</li><li>Sbalzarini, I. F., Koumoutsakos, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feature+point+tracking+and+trajectory+analysis+for+video+imaging+in+cell+biology.">Feature point tracking and trajectory analysis for video imaging in cell biology.</a> Journal of Structural Biology. 151 (2), 182-195 (2005).</li><li>Ewers, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-particle+tracking+of+murine+polyoma+virus-like+particles+on+live+cells+and+artificial+membranes.">Single-particle tracking of murine polyoma virus-like particles on live cells and artificial membranes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 102 (42), 15110-15115 (2005).</li><li>Manzo, C., Garcia-Parajo, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+progress+in+single+particle+tracking:+from+methods+to+biophysical+insights.">A review of progress in single particle tracking: from methods to biophysical insights.</a> Report on Progress in Physics. 78 (12), 124601 (2015).</li><li>Calebiro, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+analysis+of+fluorescently+labeled+G-protein-coupled+receptors+reveals+complexes+with+distinct+dynamics+and+organization.">Single-molecule analysis of fluorescently labeled G-protein-coupled receptors reveals complexes with distinct dynamics and organization.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 110 (2), 743-748 (2013).</li><li>Digman, M. A., Dalal, R., Horwitz, A. F., Gratton, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+the+number+of+molecules+and+brightness+in+the+laser+scanning+microscope.">Mapping the number of molecules and brightness in the laser scanning microscope.</a> Biophysical Journal. 94 (6), 2320-2332 (2008).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Martinez-Munoz, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separating+Actin-Dependent+Chemokine+Receptor+Nanoclustering+from+Dimerization+Indicates+a+Role+for+Clustering+in+CXCR4+Signaling+and+Function.">Separating Actin-Dependent Chemokine Receptor Nanoclustering from Dimerization Indicates a Role for Clustering in CXCR4 Signaling and Function.</a> Molecular Cell. 70 (1), 106-119 (2018).</li><li>Destainville, N., Salome, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+and+correction+of+systematic+errors+due+to+detector+time-averaging+in+single-molecule+tracking+experiments.">Quantification and correction of systematic errors due to detector time-averaging in single-molecule tracking experiments.</a> Biophysical Journal. 90 (2), L17-L19 (2006).</li></ol>

Açıklanan yöntemi bile Matlab ile çalışan herhangi bir önceki deneyimi kalmadan gerçekleştirmek kolaydır. Ancak, Matlab rutinleri son derece farklı komutlar isimlendirme ve program tarafından istihdam farklı klasörler lokalizasyonu ile doğruluk gerektirir. İzleme çözümlemesi rutin (Adım 3), birden çok parametre değiştirilebilir. "Ayarı Gauss karışım modeli uygun" pencere (Adım 3.8) U-parça videoda tek parçacıkların nasıl algılar denetler. Bu3' te açıklandığı ...

Termal Difüzyon nedeniyle sürekli hareket membran proteinlerinin lipid bilayer gömülü bulunmaktadır. Cins etkileşimleri reaksiyonlar monomerleri boyutu değişir ve kompleksleri sinyal istikrar etkisi kompleksleri oluşumu izin olarak kendi dinamikleri hücre yanıtları, düzenlenmesi için gereklidir. Protein dynamics kontrol mekanizmaları elucidating böylece yeni bir meydan okuma olarak hücre biyolojisi, sinyal iletim yolları anlamaya ve önceden tahmin edilemeyen hücre işlevleri tanımlamak için gerekli olduğunu.
Optik bazı yöntemler geliştirdik bu etkileşimler yaşayan çalışmaya1hücreleri. Bunlar arasında toplam iç yansıma floresan (TIRF) mikroskopi, 1980'lerin başında geliştirilen moleküler etkileşim veya hücre zarı2çok yakınındaki bir çalışma sağlar. Membran protein yörüngeleri yaşayan hücrelerde TIRF veri elde edilen dinamik parametreleri çalışma için tek bir parçacık izleme yöntemini (SPT) gereklidir. Çeşitli algoritmalar bunun için mevcut olmasına rağmen şu anda bu parçacık hareket heterojenite yoğun parçacık alanındaki parçacıklar elde edilen parça bağlanmak için ardışık çerçeveler arasında bağlantı kurarak ele Jaqaman ve ark.3 Yayınevi kullanın kesimleri içine tam yörüngeler (geçici parçacık ortadan kalkması). Belgili tanımlık bilgisayar yazılımı birleştirme ve bölme sonucunda toplama ve ayrışma olayları3parçacık yakalar. Bu yazılımın çıkış veri algılama tüm yörünge boyunca parçacıkların X ve Y konumlarını her çerçevede tanımlayarak biridir.
Bir kez parçacıkları tespit edilir, kısa timelag Difüzyon katsayısı (D1-4)4,5belirlemek için farklı algoritmaları uygulamak. An ölçekleme spektrum (MSS)6,7,8 analizi uygulayabilir veya 'Alfa' değeri ayarlama, ortalama kare deplasman (MSD) eğrisi9tarafından uygun, ayrıca parçacıklar göre sınıflandırmak yörünge türü.
Floresans görüntülerde nokta yoğunluğunu analiz bilim adamları alan10,11' deki yönergeleri için paylaşılan bir hedefidir. Parlaklık ve sözde numarası kullanılan en yaygın algoritmasıdır. Bu yöntem yine de doğru kare kare yoğunluğu algılama mobil kesir parçacıklar içinde izin vermez. Böylece, yeni bir algoritma bu parçacık yoğunluklarda çerçevelemek-yanında-çerçevelemek değerlendirmek için ve onların toplama durumu belirlemek için oluşturmuş. Bir kez her parçacık koordinatlarını U-Track2 yazılım3kullanarak tespit edilir, biz şiddeti her çerçevede tam yörünge üzerinde Ayrıca her çerçeve içinde hücre arka planı dikkate alarak tanımlar. Bu yazılım nokta yoğunluğu ve hücre arka planı belirlemek için farklı seçenek sunuyor ve referans olarak bilinen monomeric ve dimerik proteinleri kullanarak tespit parçacık (küme boyutu) proteinler yaklaşık sayısını hesaplar.
Bu makalede, aşağıdaki üç adımı gerçekleştirmek için dikkatli bir rehber tarif: 1) tespit ve floresan mikroskopi U-parça; kullanarak bir video boyunca tek parçacıklar izleme 2) bu parçacıklar ve MSS tarafından uzun yörüngeleri ile parçacıkların hareketi (sınırlı, ücretsiz veya yönlendirilmiş) tip anlık Difüzyon katsayısı (D1-4) analiz; 3) Çeviri: her yer için tahmini arka plan Floresans video boyunca nokta yoğunluğu ölçme. Bu küme boyutu tahmin ve kimlik photobleaching adımları sağlar.
Bu Protokolü'nün kullanılmasına özel beceri gerektirmez ve hücre kültürü ile herhangi bir laboratuarda gerçekleştirilen, Akış Sitometresi ve mikroskopi İmkanları. ImageJ veya Fiji (ImageJ12dağıtım), U-track3ve bazı reklam hoc yapılan rutinleri (http://i2pc.es/coss/Programs/protocolScripts.zip) iletişim kuralını kullanır. U-track ve geçici yordamları uyumlu herhangi bir bilgisayarda yüklü Matlab üzerinden çalışacak.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:797px;" width="797">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">Human Jurkat cells</td>
			<td style="width:203px;">ATCC</td>
			<td style="width:203px;">CRL-10915</td>
			<td style="width:171px;">Human T cell line. Any other cell type can be analyzed with this software</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:221px;">pAcGFPm-N1 (PT3719-5)DNA3GFP</td>
			<td style="width:203px;">Clontech</td>
			<td style="width:203px;">632469</td>
			<td>Different fluorescent proteins can be followed and analyzed with this routine</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:221px;">Gene Pulse X Cell electroporator&#160;</td>
			<td>BioRad&#160;</td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td>We use 280V, 975 mF, for Jurkat cells.&#160; Use the transfection method best working in your hands.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cytomics FC 500 flow cytometer&#160;</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MoFlo Astrios Cell Sorter&#160;</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td>Depending on the level of transfection, cell sorting may not be required.&#160; You can also employ cells with stable expression of adequate levels of the receptor of interest.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">Dako Qifikit</td>
			<td style="width:203px;">DakoCytomation</td>
			<td style="width:203px;">K0078</td>
			<td>Used for quantification the number of receptors in the cell surface.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">Glass bottom microwell dishes</td>
			<td style="width:203px;">MatTek corporation</td>
			<td style="width:203px;">P35G-1.5-10-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:221px;">Human Fibronectin from plasma</td>
			<td style="width:203px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:203px;">F0895</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">Recombinant human CXCL12</td>
			<td style="width:203px;">PeproTech</td>
			<td style="width:203px;">300928A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">Inverted Leica AM TIRF</td>
			<td style="width:203px;">Leica</td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">EM-CCD camera</td>
			<td style="width:203px;">Andor&#160;</td>
			<td style="width:203px;">DU 885-CSO-#10-VP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">MATLAB</td>
			<td style="width:203px;">The MathWorks, Natick, MA</td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">U-Track2 software</td>
			<td style="width:203px;">Danuser Laboratory</td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">ImageJ</td>
			<td style="width:203px;">NIH</td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td>https://imagej.nih.gov/ij/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">FiJi</td>
			<td style="width:203px;">FiJI</td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td>https://imagej.net/Fiji)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">u-Track2 software</td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td>Matlab tool.&#160; For installing, download .zip file from the web page (http://lccb.hms.harvard.edu/software.html) and uncompress the file in a directory of your choice</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">GraphPad Prism</td>
			<td style="width:203px;">GraphPad software</td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

image processing protocol for the analysis of the diffusion and cluster size of membrane receptors by fluorescence microscopy

Bir video serisi ve onların yörüngeleri posterior analizi üzerinde izleme parçacık günümüzde birçok biyolojik çalışmalarda ortak bir işlemdir. Hücre membran reseptör analizini kullanarak kümeleri bir model olarak, biz bu görüntü analiz görevi, Fiji (ImageJ) ve Matlab rutinleri için kullanarak için detaylı bir iletişim kuralı mevcut: 1) bölgeleri ilgi tanımlamak ve tasarım bu bölgelere; adapte maskeleri 2) parçacıklar Floresans mikroskobu videoları izlemek; 3) seçili parça Difüzyon ve yoğunluk özellikleri analiz. Kantitatif analiz Difüzyon katsayıları, hareket ve küme boyutu Floresans mikroskobu tarafından elde edilen ve görüntü işleme objektif parçacık dinamiği ve bunun sonuçları belirlemek için değerli bir araç sağlar çevre koşulları. Bu makalede biz bu özellikler analizi için detaylı protokolleri mevcut. Açıklanan yöntemi burada sadece tek molekül izleme algılama, ama aynı zamanda hücre zarı, yanal Difüzyon parametrelerinin tahmini otomatikleştirir, yörünge türünü sınıflandırır ve tam analiz böylece üstesinden sağlar Tüm yörüngesini, hücre zarının üzerinde nokta boyutu miktarının zorluklar.

Bu Protokolü'nün kullanılmasına Floresans mikroskobu film ve dinamik özellikleri analiz tespit parçacıklar otomatik izleme sağlar. Başlangıçta, hücreleri izlenmesi gereken fluorescently birleştiğinde protein ile transfected. SPT (şekil 1) sıralama hücre tarafından elde edilir sağlar hücre yüzeyi reseptörleri uygun seviyede sunuyor. Seçili hücrelerin bu Protokolü (tamamlayıcı Video 1) açıklanan araçları ile okudu...

Watch this Scientific Journal Video about Image Processing Protocol for the Analysis of the Diffusion and Cluster Size of Membrane Receptors by Fluorescence Microscopy at JoVE.com

Image Processing Protocol for the Analysis of the Diffusion and Cluster Size of Membrane Receptors by Fluorescence Microscopy

Görüntü membran reseptörleri Floresans mikroskobu tarafından küme boyutunu ve Difüzyon analizi için protokol işleme

Burada, tek parçacık kantitatif değerlendirilmesi Difüzyon katsayıları, Floresans mikroskobu tarafından algılanan tek parçacıkların hareket ve küme boyutları türleri sağlar görüntü analizi izleme için bir iletişim kuralı mevcut.

Particle tracking on a video sequence and the posterior analysis of their trajectories is nowadays a common operation in many biological studies. Using ...

Yeni mikroskopi teknikleri, incelenen biyolojik süreçlerin doğru kavrayışı için yeterli araçların geliştirilmesini gerektirir. Bu protokol, tek moleküllü izleme için gerekli olan görüntü işleme adımlarını açıklar, buna yanal difüzyon parametrelerinin tahmini ve hücre zarındaki tüm yörüngesi üzerinde nokta boyutunun ölçülmesi de dahildir. Bu protokol, ImageJ, MATLAB ve uTrack gibi çeşitli yazılım parçalarının yanı sıra bu protokol için özel olarak geliştirilmiş bazı proteinlerin kullanımını birleştirir.Bu yöntem, ışık mikroskobu altında membran reseptörlerinin takibi ile gösterilmiştir, ancak yörüngeleri zaman içinde bir video dizisinde izlenebilen parçacık benzeri herhangi bir yapıya uygulanabilir. Bu teknik temel araştırmalarla ilgilidir ve klinik ortamda doğrudan bir uygulaması yoktur. Ancak, hem farklı hastalıklarda biyolojik olayların karakterizasyonuna hem de yeni tedavi hedeflerinin belirlenmesinde yardımcı olmak için kullanılabilir.Bu protokol, bu videoda gösterildiği gibi, hücresel membranlarda parçacıkların izlenmesi için ilgilidir, ama aynı zamanda tam hücre, bakteri, bir sıvı nano tanecikleri, ya da merkezi iyi tespit edilebilir başka bir nesnenin izlenmesi için uygulanabilir. Bu protokol kullanıcı dostudur ve sadece hücre kültürü ve mikroskopi teknikleri hakkında bilgi gerektirir. Bu protokolde kullanılan farklı teknikler ve bilişim araçları yeni bir kullanıcının gözünü korkutabilir.Görsel gösteri bir güven ile bu tekniği kullanmak için yardımcı olur. Başlamak için, Jurkat hücreleri büyümek, monomerik GFP etiketli kemokin reseptör vektörü ile transfect, ve etiketli vektör düşük ifade düzeyleri ile hücreleri seçin, eşlik eden metin protokolü açıklandığı gibi. Fibronektin ile kaplanmış her fibronektin kaplı 35 milimetrelik cam alt mikrowell yemeklerine CXCL12 ligand veya kontrol ortamı içeren ortam ekleyin ve 37 santigrat derecede bir saat kuluçkaya yatırın.Ardından, her çanağa sıralanmış hücreler ekleyin ve hücreleri görüntülemeden önce 20 dakika kuluçkaya yatırın. Kuluçkadan sonra, hücrelerin ilk çanak bir TIRF mikroskop aşamasına aktarın ve 100x yağ daldırma hedefiaçın. Fotobeyaztma etkilerini en aza indirmek için parlak alan kullanarak hücreleri bulun ve odaklanın.Ardından TIRF moduna geçin ve düşük lazer yoğunluğu kullanarak hassas odaklama ayarı yapın. Kareler arasındaki zaman aralığını en aza indirerek yaklaşık 50 saniye uzunluğunda filmler edinin. Her deneysel durum video dosyası için, bu videonun metin protokolünde açıklanan dosya yapısı yönergelerini izleyen yeni bir klasör oluşturun.Dosyayı Fiji menü çubuğuna sürükleyip bırakarak videoyu Fiji veya ImageJ ile açın ve LIF dosyasını biyobiçimler kullanarak almak için Tamam'a tıklayın. Bir maske tasarlamak için, ilgili çok kanallı görüntüyü de içe aktarın. Ardından, önce maskenin tasarımı için yararlı kanallarla tek bir görüntü oluşturarak bir maske oluşturun.Çubuk menüsünde Resim'i seçin ve farklı kanalları ayrı görüntüler olarak göstermek için Renkleri ve ardından Split Kanalları'nı tıklatın. Çubuk menüsünde Görüntü'yü seçerek, Renk'e giderek ve Kanalları Birleştir'i seçerek üç kanalı tek bir görüntüde yeniden birleştirin. Uygun kanalları seçtiğinizden ve daha sonra yeni bir istiflenmeyen görüntü oluşturmak için Tamam tuşuna bastığından emin olun.Çubuk menüsüne giderek, Çözümle'yi seçerek ve ardından Araçlar'a giderek ve Windows Eşitle'yi seçerek iki pencereyi eşitleyin. Senkronize görüntü olasılıkları içeren yeni bir pencere gösterilir. Şimdi, iki pencere senkronize ile, her iki pencerede aynı bölge kırpılmış olabilir.Çubuk menüsündeki Resim'e gidin ve Kırpma'yı seçin. Dikdörtgen seçim aracı ile ilgi bölgesini çizin. Kırpılan iki görüntü tek tek gösterecektir.Ardından, her iki pencereyi de eşitlemeden çıkarın. Maske oluşturulmadıysa, seçim aracı ve kırpma ile ilgi bölgesini çizin. Bundan sonra, video klibi videosek dizininde görüntü dizisi olarak kaydedin.Ardından çok kanallı görüntüyü seçin, menüdeki Eklentiler'e gidin ve segmentasyon düzenleyicisi eklentisini açmak için Segmentasyon Düzenleyicisi'ni seçin. Serbest seçim aracını seçin ve yeşil bir etiket seçmek ve en dıştaki maskeyi tasarlamak için kullanın. Tasarlandıktan sonra, bileşik pencerenin seçim seçeneğinde Plus düğmesine basın ve seçili maske görüntüleyicide görüntülenir.Tüm etiketler için bu adımı yineleyin. Tüm maskeler tasarlandıktan sonra maskeyi videoyla aynı dosya adı ile kaydedin ve adı:mask.tif. MATLAB'ı açın ve Yol Ayarla'ya giderek ve Ekle'yi seçerek uTrack dizinini yola ekleyin.Ardından, çözümlenecek diziyi içeren Çalışma Dizini'ni diziolarak değiştirin. Konsolda Movie Selector GUI yazıp Enter tuşuna basarak uTrack'i çağırın. Bu, film seçim penceresinin açılmasına neden olur.Yeni Film düğmesine basın ve Film Ekleme penceresinin görünmesini bekleyin. Videoyla birlikte dizini seçmek ve film bilgileri parametrelerini doldurmak için Kanal Ekle'ye basın. uTrack to Results sonuçları için çıktı dizini ayarlayın, ardından Gelişmiş Kanal Ayarları'na basın, satın almayla ilgili parametreleri doldurun ve kaydedin.Filmi oluşturduktan sonra film seçimi penceresinde Devam et'e basın. Burada, uTrack analiz edilecek nesnenin türü hakkında soru soracaktır. Tek Parçacıklar'ı seçin ve ardından denetim masası penceresi görüntülenir.Ardından, ilk adım olan Adım 1:Algılama'yı seçin ve Ayar'ı tıklatın. Ayar Gaussian Karışım Modeli Montaj penceresi görüntülenir. Burada gösterildiği gibi ayarları girin ve sonra Uygula tuşuna basın.Denetim panelinde, algılama adımını çalıştırmak için Çalıştır'ı tıklatın. Birkaç dakika sonra Sonuç düğmesine basarak sonuçları kontrol edin. Film, algılanan parçacıklar üzerinde kırmızı daireler gösterir.Kırmızı daire gösterilmezse, bu adım doğru çalışmamıştır ve yeniden denemelisiniz. Şimdi, az önce burada gösterildiği gibi parametreleri ayarlayarak birden fazla kareyi kapsayan parçalarhalinde tespit edilen parçacıkları birleştirin. Ardından kontrol panelinde Çalıştır'a basın.Ardından, Parça Analizi'ni gerçekleştirin. Burada gösterildiği gibi ayarları tanımlayın ve uygula ve çalıştır'a basın. Sonuçları önce Sonuç düğmesine basarak doğrulayın, ardından film seçenekleri penceresinin Parça Numarasını Göster'e tıklayın ve her parçanın doğru şekilde tanımlandığını kare kare kontrol edin, gerçek parçacıklar olmayan parçacıkları el ile işaretleyin.MATLAB'da, burada gösterildiği gibi komutu girin. Bu komut, programın tüm yörüngeleri okumasına ve difüzyon katsayılarını hesaplamasına neden olur. Ardından, dışlayabilmek için noktalar listesini vererek yanlış tanımlanmış noktalara veya yörüngelere karşılık gelen yörüngeleri hariç tut.Bu hücrenin her bir parçası için anlık difüzyon katsayılarını, eşlik eden metin protokolünü takip ederek hesaplayın. Bu durumda, diffüzyon katsayısını bir zaman gecikmesi için hesaplayın 4 ile 4 arasında d1 olarak adlandırılır. Bittiğinde, kısa ve uzun yörüngeler halinde yörüngeleri ayrıştırın.Uzun yörüngeleri analiz etmek için, hareket türünü moment ölçekleme spektrumu boyunca sınıflandırmak için burada gösterildiği komutu yazın. Her parçacığın yörüngeleri boyunca yoğunluğunu analiz edin. Bu temel davranışı, eşlik eden metin iletişim kuralını takip ederek çok farklı şekillerde yapılandırın.Sonra, tüm yörüngeler için difüzyon ve yoğunluk bilgilerini toplamak. Kısa yörüngeler için yalnızca difüzyon ve yoğunluk bilgilerini toplayın. Son olarak, daha önce kullanılan sonek uzun olan aşağıdakileri yazarak moment spektrumu ölçeklemesini ve yoğunluk bilgilerini toplayın.Bu protokolde tanımlanan tekniklerin kullanılması, floresan mikroskopi filmlerinde tespit edilen parçacıkların otomatik olarak izlenmesine ve dinamik özelliklerinin analizine olanak sağlar. Bu analizden, uyaranların varyasyonlarına göre farklı özellikler elde edilebilir. Buna, dört farklı uyaranlara dayalı hareketsiz noktaların yüzdesi, 50'den büyük kareler uzun yörüngelerin yüzdesi ve yönlendirilmiş, özgür veya sınırlı hareketler tarafından parçalanmış olarak yörüngeler boyunca hareket türleri içerir.Buna ek olarak, difüzyon katsayısı, ortalama nokta yoğunlukları ve parçacık başına reseptör sayısı belirlenebilir. Bu, farklı uyaranlara yanıt olarak her nokta için kısa difüzyon katsayısı değerlerinin dağılımını gösterir. Kırmızı çizgi ortanca değeri temsil eder, bu benzer grafik aynı uyaranlara yanıt olarak ilk 20 kare boyunca her nokta için ortalama nokta yoğunlukları gösterir.Yine, kırmızı çizgi ortalama yoğunluk değerini temsil eder. Bir noktanın ortalama düzeltilmiş yoğunluğu bu noktada bulunan floresan protein sayısı ile ilişkili olduğundan, burada gösterildiği gibi, parçacık başına reseptör sayısını doğrudan hesaplayabilirsiniz. MATLAB büyük/küçük harf duyarlı bir programlama dilidir.Değişken adlarını bu protokolde açıklananlara göre değiştirebilirsiniz, ancak adlandırmanızda tutarlı olduğundan emin olun. Işlevlerin adları değiştirilemez ve doğru bir sözdizimi için virgüller, üst üste ve yarı iki nokta üst üste ler önemlidir. Tek moleküllü mikroskopi, tek tek membran proteinlerinin benzeri görülmemiş spatio-temporal çözünürlüğe sahip görselleştirilmesine olanak sağlar ve hücre biyolojisinin beklenmeyen yönlerini ortaya çıkarmak için eşsiz fırsatlar sunar.Bu protokoller hücrelerde ve moleküler biyolojide mikroskopi videolarının kantitatif analizi için yeni kapılar açılmaktadır.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Intravital Microscopy of the Spleen: Quantitative Analysis of Parasite Mobility and Blood Flow

Dalak intravital Mikroskopi: Parazit Mobilite ve Kan Akımının Kantitatif Analiz

The advent of intravital microscopy in experimental rodent malaria models has allowed major advances to the knowledge of parasite-host interactions 1,2. ...

Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

Tek hücreli Analizi Bacillus subtilis</emFloresan Mikroskobu ve Akım Sitometri Kullanma> Biyofilmler

Biofilm formation is a general attribute to almost all bacteria 1-6. When bacteria form biofilms, cells are encased in extracellular matrix that is mostly ...

Antigens Protected Functional Red Blood Cells By The Membrane Grafting Of Compact Hyperbranched Polyglycerols

Antijenler Kompakt Hyperbranched Polyglycerols Of Aşılama Membran By Fonksiyonel Kırmızı Kan Hücreleri Korumalı

Red blood cell (RBC) transfusion is vital for the treatment of a number of acute and chronic medical problems such as thalassemia major and sickle cell ...

Fluorescence Microscopy Methods for Determining the Viability of Bacteria in Association with Mammalian Cells

Memeli Hücreleri ile Derneği&#39;nin Bakterilerin Canlılık belirlenmesi için Floresan Mikroskopi Yöntemleri

Central to the field of bacterial pathogenesis is the ability to define if and how microbes survive after exposure to eukaryotic cells. Current protocols ...

Analysis of the Epithelial Damage Produced by Entamoeba histolytica Infection

Analysis of the Epithelial Damage Produced by Entamoeba histolytica Infection

Yapımcı Epitel Hasar Analizi<em&gt; Entamoeba histolytica</em&gt; Enfeksiyon

Entamoeba histolytica is the causative agent of human amoebiasis, a major cause of diarrhea and hepatic abscess in tropical countries. Infection is ...

Measuring Phagosome pH by Ratiometric Fluorescence Microscopy

Oranlı metrik Floresan Mikroskopi fagosom pH ölçümü

Phagocytosis is a fundamental process through which innate immune cells engulf bacteria, apoptotic cells or other foreign particles in order to kill or ...

Cortical Actin Flow in T Cells Quantified by Spatio-temporal Image Correlation Spectroscopy of Structured Illumination Microscopy Data

Yapılandırılmış Aydınlatma Mikroskopi Verilerinin uzay-zamansal Görüntü Korelasyon Spektroskopisi nicel T Hücreleri kortikal Aktin Akışı

Filamentous-actin plays a crucial role in a majority of cell processes including motility and, in immune cells, the formation of a key cell-cell ...

Preparation of CD4+ T Cells for Analysis of GD3 and GD2 Ganglioside Membrane Expression by Microscopy

Preparation of CD4+ T Cells for Analysis of GD3 and GD2 Ganglioside Membrane Expression by Microscopy

CD4 hazırlanması<sup&gt; +</sup&gt; Mikroskopi GD3 ve GD2 Gangliozidleri Membran İfade Analizi T hücreleri

The methods described herein for activation of na&#239;ve CD4+ T cells in suspension and their adherence in coverslips for confocal microscopy analysis ...

Molecular Diffusion in Plasma Membranes of Primary Lymphocytes Measured by Fluorescence Correlation Spectroscopy

Flüoresan Korelasyon Spektroskopisi Ölçülen İlköğretim Lenfositler Plazma Membranlarda moleküler difüzyon

Fluorescence correlation spectroscopy (FCS) is a powerful technique for studying the diffusion of molecules within biological membranes with high spatial ...