Name: rapid evaluation of toxicity of chemical compounds using zebrafish embryos
Uploaded: 2019-08-25T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Rapid Evaluation of Toxicity of Chemical Compounds Using Zebrafish Embryos at JoVE.com

تم دعم العمل بمنح من مؤسسة سيغريد جوسيليوس (SP, MP), المؤسسة الثقافية الفنلندية (AA, MH), أكاديمية فنلندا (SP, MP), أوريون فارموس مؤسسة (MH), مؤسسة تامبيري للسل (SP, MH وMP) وجين وأتوس إركو مؤسسة (SP وMP ). نشكر متعاونينا الإيطالي والفرنسي، البروفيسور سوبوران، والبروفيسور وينوم، على توفير مثبطات أنهيدراز الكربونية لتقييم السلامة والسمية لأغراض تطوير الأدوية المضادة للسل والسرطان. ونشكر أوليكي ليموس وماريان كوسلاتي على المساعدة التقنية. كما نشكر لينا ماكينن وهانالينا بيبو على مساعدتهما في تربية أسماك الحمار الوحشي وجمع الأجنة. نشكر باخلاص هارلان باركر على التقييم النقدي للمخطوطة والتعليقات الثاقبة.

وللمنشأة الأساسية لسمك الحمار الوحشي في جامعة تامبيري إذن بإنشاء من المجلس الوطني للتجارب الحيوانية (ESAVI/7975/04.10.05/2016). وقد أجريت جميع التجارب باستخدام أجنة سمك الحمار الوحشي وفقا لبروتوكول وحدة الخدمات الإقليمية التابعة لحكومة مقاطعة شرق فنلندا، والإدارة الاجتماعية والصحية لوحدة الخدمات...

<ol>
	<li>Amaouche, N., Casaert Salome, H., Collignon, O., Santos, M. R., Ziogas, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Marketing+authorization+applications+submitted+to+the+European+Medicines+Agency+by+small+and+medium-sized+enterprises:+an+analysis+of+major+objections+and+their+impact+on+outcomes.">Marketing authorization applications submitted to the European Medicines Agency by small and medium-sized enterprises: an analysis of major objections and their impact on outcomes.</a> Drug Discovery Today. 23 (10), 1801-1805 (2018).</li><li>Garg, R. C., Bracken, W. M., Hoberman, A. M., Gupta, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reproductive+and+developmental+safety+evaluation+of+new+pharmaceutical+compounds.">Reproductive and developmental safety evaluation of new pharmaceutical compounds.</a> Reproductive and Developmental Toxicology. , 89-109 (2011).</li><li>Lee, H. Y., Inselman, A. L., Kanungo, J., Hansen, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+models+in+developmental+toxicology.">Alternative models in developmental toxicology.</a> Systems Biology in Reproductive Medicine. 58 (1), 10-22 (2012).</li><li>Gao, G., Chen, L., Huang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-cancer+drug+discovery:+update+and+comparisons+in+yeast,+Drosophila,+and+zebrafish.">Anti-cancer drug discovery: update and comparisons in yeast, Drosophila, and zebrafish.</a> Current Molecular Pharmacology. 7 (1), 44-51 (2014).</li><li>Brown, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+of+test+chemicals+for+the+ECVAM+international+validation+study+on+in+vitro+embryotoxicity+tests.+European+Centre+for+the+Validation+of+Alternative+Methods.">Selection of test chemicals for the ECVAM international validation study on in vitro embryotoxicity tests. European Centre for the Validation of Alternative Methods.</a> Alternatives to Laboratory Animals. 30 (2), 177-198 (2002).</li><li>Selderslaghs, I. W., Van Rompay, A. R., De Coen, W., Witters, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+screening+assay+to+identify+teratogenic+and+embryotoxic+chemicals+using+the+zebrafish+embryo.">Development of a screening assay to identify teratogenic and embryotoxic chemicals using the zebrafish embryo.</a> Reproductive Toxicology. 28 (3), 308-320 (2009).</li><li>Brannen, K. C., Panzica-Kelly, J. M., Danberry, T. L., Augustine-Rauch, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+zebrafish+embryo+teratogenicity+assay+and+quantitative+prediction+model.">Development of a zebrafish embryo teratogenicity assay and quantitative prediction model.</a> Birth Defects Research Part B Developmental and Reproductive Toxicology. 89 (1), 66-77 (2010).</li><li>Hermsen, S. A., van den Brandhof, E. J., van der Ven, L. T., Piersma, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relative+embryotoxicity+of+two+classes+of+chemicals+in+a+modified+zebrafish+embryotoxicity+test+and+comparison+with+their+in+vivo+potencies.">Relative embryotoxicity of two classes of chemicals in a modified zebrafish embryotoxicity test and comparison with their in vivo potencies.</a> Toxicology in Vitro. 25 (3), 745-753 (2011).</li><li>Lessman, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+developing+zebrafish+(Danio+rerio):+a+vertebrate+model+for+high-throughput+screening+of+chemical+libraries.">The developing zebrafish (Danio rerio): a vertebrate model for high-throughput screening of chemical libraries.</a> Birth Defects Research. Part C, Embryo Today: Reviews. 93 (3), 268-280 (2011).</li><li>Lantz-McPeak, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+toxicity+assay+using+high+content+screening+of+zebrafish+embryos.">Developmental toxicity assay using high content screening of zebrafish embryos.</a> Journal of Applied Toxicology. 35 (3), 261-272 (2015).</li><li>Truong, L., Harper, S. L., Tanguay, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+embryotoxicity+using+the+zebrafish+model.">Evaluation of embryotoxicity using the zebrafish model.</a> Methods in Molecular Biology. 691, 271-279 (2011).</li><li>Rodrigues, G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design,+synthesis,+and+evaluation+of+hydroxamic+acid+derivatives+as+promising+agents+for+the+management+of+Chagas+disease.">Design, synthesis, and evaluation of hydroxamic acid derivatives as promising agents for the management of Chagas disease.</a> Journal of Medicinal Chemistry. 57 (2), 298-308 (2014).</li><li>Kanungo, J., Cuevas, E., Ali, S. F., Paule, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+model+in+drug+safety+assessment.">Zebrafish model in drug safety assessment.</a> Current Pharmaceutical Design. 20 (34), 5416-5429 (2014).</li><li>Peterson, R. T., Link, B. A., Dowling, J. E., Schreiber, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+molecule+developmental+screens+reveal+the+logic+and+timing+of+vertebrate+development.">Small molecule developmental screens reveal the logic and timing of vertebrate development.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (24), 12965-12969 (2000).</li><li>Stainier, D. Y., Fishman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+as+a+model+system+to+study+cardiovascular+development.">The zebrafish as a model system to study cardiovascular development.</a> Trends in Cardiovascular Medicine. 4 (5), 207-212 (1994).</li><li>Aspatwar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitroimidazole-based+inhibitors+DTP338+and+DTP348+are+safe+for+zebrafish+embryos+and+efficiently+inhibit+the+activity+of+human+CA+IX+in+Xenopus+oocytes.">Nitroimidazole-based inhibitors DTP338 and DTP348 are safe for zebrafish embryos and efficiently inhibit the activity of human CA IX in Xenopus oocytes.</a> Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry. 33 (1), 1064-1073 (2018).</li><li>Rami, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia-targeting+carbonic+anhydrase+IX+inhibitors+by+a+new+series+of+nitroimidazole-sulfonamides/sulfamides/sulfamates.">Hypoxia-targeting carbonic anhydrase IX inhibitors by a new series of nitroimidazole-sulfonamides/sulfamides/sulfamates.</a> Journal of Medicinal Chemistry. 56 (21), 8512-8520 (2013).</li><li>Spitsbergen, J. M., Kent, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+state+of+the+art+of+the+zebrafish+model+for+toxicology+and+toxicologic+pathology+research--advantages+and+current+limitations.">The state of the art of the zebrafish model for toxicology and toxicologic pathology research--advantages and current limitations.</a> Toxicologic Pathology. , 62-87 (2003).</li><li>Teraoka, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+cytochrome+P450+1A+is+required+for+circulation+failure+and+edema+by+2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin+in+zebrafish.">Induction of cytochrome P450 1A is required for circulation failure and edema by 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin in zebrafish.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 304 (2), 223-228 (2003).</li><li>Zon, L. I., Peterson, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+drug+discovery+in+the+zebrafish.">In vivo drug discovery in the zebrafish.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 4 (1), 35-44 (2005).</li><li>Hill, A. J., Teraoka, H., Heideman, W., Peterson, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+as+a+model+vertebrate+for+investigating+chemical+toxicity.">Zebrafish as a model vertebrate for investigating chemical toxicity.</a> Toxicological Sciences. 86 (1), 6-19 (2005).</li><li>Kari, G., Rodeck, U., Dicker, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish:+an+emerging+model+system+for+human+disease+and+drug+discovery.">Zebrafish: an emerging model system for human disease and drug discovery.</a> Clinical Pharmacology and Therapeutics. 82 (1), 70-80 (2007).</li><li>Gourmelon, A., Delrue, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+in+Support+of+Internationally+Harmonised+OECD+Test+Guidelines+for+Assessing+the+Safety+of+Chemicals.">Validation in Support of Internationally Harmonised OECD Test Guidelines for Assessing the Safety of Chemicals.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 856, 9-32 (2016).</li><li>Aspatwar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=beta-CA-specific+inhibitor+dithiocarbamate+Fc14-584B:+a+novel+antimycobacterial+agent+with+potential+to+treat+drug-resistant+tuberculosis.">beta-CA-specific inhibitor dithiocarbamate Fc14-584B: a novel antimycobacterial agent with potential to treat drug-resistant tuberculosis.</a> Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry. 32 (1), 832-840 (2017).</li><li>Kazokaite, J., Aspatwar, A., Kairys, V., Parkkila, S., Matulis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorinated+benzenesulfonamide+anticancer+inhibitors+of+carbonic+anhydrase+IX+exhibit+lower+toxic+effects+on+zebrafish+embryonic+development+than+ethoxzolamide.">Fluorinated benzenesulfonamide anticancer inhibitors of carbonic anhydrase IX exhibit lower toxic effects on zebrafish embryonic development than ethoxzolamide.</a> Drug and Chemical Toxicology. 40 (3), 309-319 (2017).</li><li>Howe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+reference+genome+sequence+and+its+relationship+to+the+human+genome.">The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome.</a> Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).</li><li>Granato, M., Nusslein-Volhard, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fishing+for+genes+controlling+development.">Fishing for genes controlling development.</a> Current Opinion in Genetics &amp; Development. 6 (4), 461-468 (1996).</li><li>Bambino, K., Chu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+in+Toxicology+and+Environmental+Health.">Zebrafish in Toxicology and Environmental Health.</a> Current Topics in Developmental Biology. 124, 331-367 (2017).</li><li>Goldsmith, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+as+a+pharmacological+tool:+the+how,+why+and+when.">Zebrafish as a pharmacological tool: the how, why and when.</a> Current Opinion in Pharmacology. 4 (5), 504-512 (2004).</li></ol>

في اختبار السمية في المختبر باستخدام الخلايا المستزرعة يمكن الكشف عن البقاء على قيد الحياة والدراسات المورفولوجية للخلايا التي توفر معلومات محدودة عن السمية الناجمة عن مركب الاختبار. وميزة فحص سمية المركبات الكيميائية التي تستخدم أجنة سمك الحمار الوحشي هي الكشف السريع عن التغيرات ...

إن تطوير المخدرات عملية مكلفة. قبل أن يتم الموافقة على مجمع كيميائي واحد من قبل إدارة الغذاء والدواء (FDA) والوكالة الأوروبية للأدوية (EMA) يتم فحص عدة آلاف من المركبات بتكلفة أكثر من مليار دولار1. خلال التنمية ما قبل السريرية، ومطلوب الجزء الأكبرمن هذه التكلفة لاختبار الحيوان 2. للحد من التكاليف، يحتاج الباحثون في مجال تطوير المخدرات نماذج بديلة لفحص سلامة المركبات الكيميائية3. ولذلك ، في المرحلة المبكرة من تطوير المخدرات ، سيكون من المفيد جدا استخدام طريقة يمكن أن تقيم بسرعة سلامة وسمية المركبات في نموذج مناسب. هناك العديد من البروتوكولات التي تم استخدامها لفحص سمية المركبات الكيميائية التي تنطوي على نماذج زراعة الحيوانات والخلايا ولكنلا يوجد بروتوكول واحد يتم التحقق من صحته وهو في الاستخدام المشترك 4،5. البروتوكولات القائمة باستخدام حمار وحشي تختلف في الطول، وقد استخدمت من قبل الباحثين الفردية الذين قاموا بتقييم السمية وفقا لمتطلبات الراحةالخاصةبهم 6،7،8،9، 10 سنوات , 11 , 12.
في الماضي القريب، ظهرت سمك الحمار الوحشي كنموذج مناسب لتقييم سمية المركبات الكيميائية أثناءالتطور الجنيني 6،7. حمار وحشي لديه العديد من المزايا المضمنة لتقييم المركبات الكيميائية13. حتى التجارب على نطاق واسع قابلة، كما يمكن للأنثى حمار وحشي وضع دفعات من 200-300 البيض، والتي تتطور بسرعة خارج الجسم الحي، لا تحتاج إلى تغذية خارجية لمدة تصل إلى أسبوع وشفافة. يمكن إضافة المركبات مباشرة إلى الماء، حيث يمكن (اعتمادا على طبيعة المجمع) تنتشر من خلال الشيوريون، وبعد الفقس، من خلال الجلد والخياشيم والفم من اليرقات. التجارب لا تتطلب كميات وفيرة من المركبات الكيميائية14 بسبب صغر حجم الجنين. تطوير أجنة حمار وحشي تعبر عن معظم البروتينات اللازمة لتحقيق نتيجة النمو الطبيعي. ولذلك، فإن جنين سمك الحمار الوحشي هو نموذج حساس لتقييم ما إذا كان دواء محتمل يمكن أن يزعج وظيفة البروتين أو جزيء إشارة ذات أهمية التنمية. تصبح أجهزة سمك الحمار الوحشي وظيفية بين 2-5 dpf15، والمركبات التي هي سامة خلال هذه الفترة الحساسة من التطور الجنيني تحفز العيوب الفينوتية في يرقات حمار وحشي. هذه التغييرات phenotypic يمكن الكشف عنها بسهولة باستخدام المجهر بسيطة دون تقنيات الغازية11. وتستخدم على نطاق واسع أجنة حمار وحشي في البحوث السمية بسبب تعقيدها البيولوجي أكبر بكثير بالمقارنة مع فحص المخدرات في المختبر باستخدام نماذج ثقافة الخلايا16،17.  كما الفقاريات، والتركيب الوراثي والفيزيولوجي من حمار وحشي قابلة للمقارنة مع البشر، وبالتالي سمية المركبات الكيميائية متشابهة بين حمار وحشي والبشر8،18،19، 20 , 21 , ٢٢- وبالتالي، فإن سمك الحمار الوحشي أداة قيمة في المرحلة الأولى من اكتشاف المخدرات لتقييم سمية وسلامة المركبات الكيميائية.
في هذه المقالة، نقدم وصفا مفصلا للطريقة المستخدمة لتقييم سلامة وسمية مركبات مثبطات الأنهيدراز الكربونية (CA) باستخدام 1-5 أيام بعد الإخصاب (dpf) أجنة حمار وحشي من قبل باحث واحد. ويشمل البروتوكول تعريض أجنة سمك الحمار الوحشي لتركيزات مختلفة من مركبات المثبطات الكيميائية ودراسة الوفيات والتغيرات الفينوتية أثناء التطور الجنيني. في نهاية التعرض للمركبات الكيميائية، يتم تحديد جرعة LC50 من المادة الكيميائية. الطريقة تسمح للفرد لإجراء فحص فعال من 1-5 مركبات الاختبار ويستغرق حوالي 8-10 ساعة اعتماداعلى تجربة الشخص مع الطريقة (الشكل 1). ويرد في الشكل 2بيان لكل خطوة من الخطوات المطلوبة لتقييم سمية المركبات. يتطلب تقييم سمية مثبطات CA 8 أيام، ويشمل إعداد أزواج التزاوج (اليوم 1)؛ جمع الأجنة من خزانات تربية وتنظيفونقلها إلى حاضنة 28.5 درجة مئوية (اليوم 2)؛ توزيع الأجنة في آبار لوحة 24 بئر وإضافة مركبات مثبطات CA المخففة (اليوم 3)؛ تحليل الفينوتيبيك والتصوير من اليرقات (اليوم 4-8)، وتحديد جرعة LC50 (day8).  هذه الطريقة سريعة وفعالة، ويتطلب كمية صغيرة من المركب الكيميائي والمرافق الأساسية فقط من المختبر.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:972px;" width="972">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:342px;">24-well plates</td>
			<td style="width:185px;">Nunc</td>
			<td style="width:260px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:185px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:342px;">Balance (Weighing scale)</td>
			<td style="width:185px;">KERN</td>
			<td style="width:260px;">PLJ3000-2CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:342px;">Balance (Weighing scale)</td>
			<td style="width:185px;">Mettler Toledo</td>
			<td style="width:260px;">AB104-S/PH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:342px;">CaCl2</td>
			<td style="width:185px;">JT.Baker</td>
			<td style="width:260px;">RS421910024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:342px;">Disecting Probe</td>
			<td style="width:185px;">Thermo Scientific</td>
			<td>17-467-604&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:342px;">DMSO</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich, Germany</td>
			<td style="width:260px;">D4540</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:342px;">Falcon tubes 15 mL</td>
			<td style="width:185px;">Greiner bio-one</td>
			<td style="width:260px;">188271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:342px;">High molecular weight methylcellulose</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich, Germany</td>
			<td style="width:260px;">M0262&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:342px;">Incubator for zebrafish larvae</td>
			<td style="width:185px;">Termaks</td>
			<td style="width:260px;">B8000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:342px;">KCL</td>
			<td style="width:185px;">Merck</td>
			<td style="width:260px;">1.04936.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:342px;">Methyl Blue</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich, Germany</td>
			<td style="width:260px;">28983-56-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:342px;">MgSO4</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich, Germany</td>
			<td style="width:260px;">M7506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:342px;">Microcentrifuge tubes</td>
			<td style="width:185px;">Starlab</td>
			<td style="width:260px;">S1615-5500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:342px;">NaCl</td>
			<td style="width:185px;">VWR Chemicals</td>
			<td style="width:260px;">27810.295</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:342px;">Paraffin Histoplast IM</td>
			<td style="width:185px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:260px;">8331</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:342px;">Pasteur pipette&#160;</td>
			<td style="width:185px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:260px;">86.1171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:342px;">Petri dish</td>
			<td style="width:185px;">Thermo Scientific</td>
			<td>101R20&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:342px;">Petri plates</td>
			<td style="width:185px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:260px;">82.1473</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:342px;">Pipette (1 mL and 200 &#956;L)</td>
			<td style="width:185px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:260px;">4641230N, 4641210N&#160;&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:342px;">Plates 24-Well</td>
			<td style="width:185px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:260px;">142485</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:342px;">Steriomicroscope/Camera</td>
			<td style="width:185px;">Zeiss</td>
			<td style="width:260px;">Stemi 2000-C/Axiocam 105 color</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:342px;">Vials (1.5 mL)</td>
			<td style="width:185px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:260px;">11569914</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:342px;">Zebrafish AB strains</td>
			<td style="width:185px;">ZIRC&#160;</td>
			<td style="width:260px;">&#160; ZL1&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid evaluation of toxicity of chemical compounds using zebrafish embryos

وسمك الحمار الوحشي هو كائن نموذجي للفقاريات يستخدم على نطاق واسع للمرض واكتشاف المخدرات القائمة على النمط الظاهري. سمك الحمار الوحشي يولد العديد من الذرية، لديه أجنة شفافة والتنمية الخارجية السريعة. وبالتالي، يمكن أيضا استخدام أجنة سمك الحمار الوحشي للتقييم السريع لسمية الأدوية الثمينة والمتاحة بكميات صغيرة. ويرد في هذه المادة وصف لطريقة الفحص الفعال لسمية المركبات الكيميائية باستخدام أجنة ما بعد الإخصاب لمدة تفي بمدة تبعد 1-5 أيام. يتم رصد الأجنة بواسطة مجهر مجسم للتحقيق في العيوب الفينوتية الناجمة عن التعرض لتركيزات مختلفة من المركبات. كما يتم تحديد تركيزات نصف قصوى قاتلة (LC50)من المركبات. تطلبت هذه الدراسة 3-6 ملغ من مركب مثبط، والتجربة بأكملها تستغرق حوالي 8-10 ساعة لإكمالها من قبل فرد في مختبر يحتوي على مرافق أساسية. البروتوكول الحالي مناسب لاختبار أي مركب لتحديد الآثار السمية أو غير المستهدفة التي لا تطاق للمركب في المرحلة المبكرة من اكتشاف المخدرات والكشف عن الآثار السامة الخفية التي قد تفوت في ثقافة الخلية أو غيرها من النماذج الحيوانية. وتقلل هذه الطريقة من التأخيرات الإجرائية وتكاليف تطوير المخدرات.

والجزء الحاسم من تقييم السمية هو اختبار تركيزات مختلفة من مركب كيميائي واحد أو مركب كيميائي متعدد في تجربة واحدة. في البداية، حدد المركبات لتقييم السمية، وعدد التركيزات لاختبار لكل مركب، وبناء على ذلك، قم بإجراء مخطط (الشكل3). استخدمنا لون فريد لكل مركب ل?...

Watch this Scientific Journal Video about Rapid Evaluation of Toxicity of Chemical Compounds Using Zebrafish Embryos at JoVE.com

Rapid Evaluation of Toxicity of Chemical Compounds Using Zebrafish Embryos

وتستخدم أجنة سمك الحمار الوحشي لتقييم سمية المركبات الكيميائية. وهي تتطور خارجيا وحساسة للمواد الكيميائية، مما يسمح بالكشف عن التغيرات الفينوتية خفية. تتطلب التجربة فقط كمية صغيرة من المركب، والتي تضاف مباشرة إلى لوحة تحتوي على الأجنة، مما يجعل نظام الاختبار فعالة وفعالة من حيث التكلفة.

التقييم السريع لسمية المركبات الكيميائية باستخدام أجنة سمك الحمار الوحشي

The zebrafish is a widely used vertebrate model organism for the disease and phenotype-based drug discovery. The zebrafish generates many offspring, has ...

سيتم إثبات إجراءات اختبار السمية من قبل الدكتور أشوك أباتوار، وهو باحث أول من مختبري. ويحدد بروتوكولنا الآثار غير المستهدفة ويكشف عن الآثار السامة الدقيقة للمواد الكيميائية في المرحلة المبكرة من الاكتشاف التي قد تفوت في زراعة الخلايا أو نماذج حيوانية أخرى. المزايا الرئيسية لتقنيتنا هي: أنها سريعة وفعالة، وتتطلب كمية صغيرة جدا من المواد الكيميائية، والمرافق الأساسية في المختبر.سوف فحص السمية تساعدنا في تحديد تركيز لدراسة كفاءتها ضد البكتيريا التي تسبب السل ولمزيد من الحساب قبل الفحص. وتستخدم هذه الطريقة رؤى في الآثار غير المستهدفة للمواد الكيميائية، وبالتالي يمكن استخدام هذه الطريقة في أي مجال من مجالات البحث حيث تكون سمية المادة الكيميائية ذات أهمية رئيسية. هذه الطريقة بسيطة جدا ويمكن أن يقوم بها أي شخص دون خبرة سابقة.يجب على الأفراد الذين ليس لديهم خبرة خطة التجربة بعناية واستخدام مركب واحد فقط. توفر هذه الطريقة تأثيرات سامة للمواد الكيميائية في شكل تغيرات في الشكل الظاهري في الأجنة الحمار الوحشي النامية وبالتالي سلامة المركبات التي تم اختبارها. للبدء، ضع 2-5 حمار وحشي ذكر بالغ وثلاثة إلى خمسة حمار وحشي أنثى بالغة في خزانات التزاوج بين عشية وضحاها.في الصباح، بدوره على ضوء كما هو مستحث تربية من قبل دورة الضوء التلقائي الظلام واللاحقة. لتجنب التعامل مع الإجهاد للحيوانات، والسماح للحيوانات للراحة لمدة أسبوعين قبل استخدام نفس الأفراد للتكاثر. في اليوم التالي قبل الظهر، جمع الأجنة باستخدام مصفاة شبكة غرامة، ونقلها إلى طبق بتري تحتوي على متوسط الجنين E3.ضع طبق بتري تحت مجهر ستيريو لفحص كل دفعة من الأجنة. تحديد مظهر مبهم وإزالتها كأجنة غير مخصبة أو ميتة. إبقاء الأجنة في 28.5 درجة مئوية في حاضنة بين عشية وضحاها.في صباح اليوم التالي، فحص الأجنة تحت مجهر ستيريو وإزالة أي أجنة غير صحية أو ميتة. استخدام بعناية ماصة معجنات لنقل جنين واحد في كل بئر من 24 بئر. تأكد من أن كل بئر تحتوي على ما يكفي من E3 المتوسطة لتغطية الأجنة.أخرج القنينات التي تحتوي على مركبات مثبطات مخزنة عند 4 درجات مئوية في الثلاجة. استخدام توازن تحليلي لوزن كمية مناسبة من المجمع، وإعداد 250 ميكرولترات من 100 ميل الأسهم ميليمولر لكل مركب في E3 المتوسطة أو آخر المذيب المناسب. ثم استخدم E3 المتوسطة لجعل التخفيفات التسلسلية من حلول المخزون على أساس مستويات السمية في أنابيب الطرد المركزي 15 ملليلتر.من الآبار التي تحتوي كل منها على جنين واحد من DPF، استخدم ماصة باستور وماصة ملليلتر لإزالة الماء E3 صف واحد في وقت واحد. توزيع على الفور 1 ملليلتر من كل مزيل من حلول الأسهم في آبار 24 بئر لوحة بدءا من انخفاض والانتقال إلى أعلى تركيز. بالنسبة لمجموعات التحكم، أضف مياه E3 أو مذيب آخر ذي صلة.تسمية 24 لوحات جيدا مع اسم وتركيز المجمع والحفاظ على لوحات في 28.5 درجة مئوية في حاضنة. الحرص على أن المخففات من المواد الكيميائية في الآبار لا تتبخر في الحاضنة عن طريق ختم الجانبين من 24 لوحة جيدا. بعد 24 ساعة من التعرض للمركبات الكيميائية ، استخدم ماصة البسترة لنقل اليرقات المعرضة لكل تركيز من المجمع في طبق بتري صغير يحتوي على 3٪ من السليلوز الميثيل الجزيئي عالي الوزن.مع مسبار معدني، ضعه جانبية. ضع طبق بتري تحت مجهر ستيريو متصل بكاميرا. التقاط الصور وحفظ الصور في مجلد منفصل كل يوم حتى نهاية التجربة.أدخل كافة الملاحظات في جدول كل يوم إما في جدول عبر إنترنت أو على ورقة مطبوعة. بالنسبة للتعرض للمركبات السمة العصبية، قد تظهر يرقات DPF الأربعة إلى الخمسة نمط سباحة غير طبيعي. في هذه الحالة ، قم بعمل سجل لهذه التغييرات عن طريق التقاط فيديو قصير من 30 ثانية إلى دقيقة واحدة لليرقات.بعد خمسة أيام من التعرض للمركبات الكيميائية، لاحظ التركيز الذي يموت نصف الأجنة حيث التركيز المميت النصف الأقصى 50 من كل مادة كيميائية. بناء منحنى لوفيات الأجنة لجميع التركيزات باستخدام برنامج مناسب. في هذا البروتوكول، الجزء الحاسم من تقييم السمية هو اختبار تركيزات مختلفة من مركب كيميائي واحد أو عدة مركبات في تجربة واحدة.بالنسبة للمركبات التي تحفز أي عيوب في شكلية في اليرقات ، تم تسجيل العيوب كل 24 ساعة على مدى فترة من يوم إلى خمسة أيام بعد التعرض للمواد الكيميائية. الأجنة تعامل مع مثبطات بيتا CA بتركيزات 250 ميكرومولار و 125 micromolar يحمل مختلف العيوب الظاهرية مقارنة مع عنصر التحكم. على سبيل المثال ، الأجنة غير المهزوزة حتى في اليوم الثالث ، بنية الجسم المنحنية ، كيس الصفار غير المستخدم والوذمة المتجانسة ، وعدم وجود كيس أوثيث في اليرقات في خمسة أيام بعد العلاج.في دراسة أخرى، وأظهرت الأجنة تعامل مع مثبطات CA عدم وجود الحويصلات أوتوليث والمثانة السباحة. حددت التجارب مركبًا تمثيليًا للانهيدراس الكربوني 9 ، الذي تسبب في حدوث تغييرات ظاهرية بسيطة أو معدومة أثناء التطور الجنيني عند 500 ميكرومولار. أظهر المركب تركيز LC50 مرتفعًا.ومع ذلك ، في مقارنة مع السيطرة ، وجد أن نفس المركب في 300 ميكرومولار هو سم عصبي ويستحث ترنح في اليرقات بعد خمسة أيام من التعرض. نوعية جيدة من الأجنة مهمة لفحص سمية المواد الكيميائية. للحصول على أجنة ذات نوعية جيدة، استخدم زوجًا صغيرًا من الحمار الوحشي البالغ للتكاثر.ويمكن للمركبات التي تظهر آمنة أن تتميز كذلك من خلال أداء ذات الصلة في المختبر وفي التجارب الحية. في مجال تطوير الأدوية المضادة للترسبات ، ساعدت هذه التقنية على إعداد المزيد من التجارب لتثبيط الميتريا الميكوبتيري في زمرة الحمار الوحشي. وينطوي البروتوكول على استخدام مواد كيميائية قد تكون سامة للبشر.وينبغي للأشخاص المشاركين في التجارب أن يأخذوا العناية المناسبة عند تناول المواد الكيميائية.

Research

JoVE Journal

Medicine

Evaluation of Nanoparticle Uptake in Tumors in Real Time Using Intravital Imaging

تقييم امتصاص الجسيمات النانوية في الأورام في الوقت الحقيقي باستخدام التصوير Intravital

Current technologies for tumor imaging, such as ultrasound, MRI, PET and CT, are unable to yield high-resolution images for the assessment of nanoparticle ...

Accurate and Simple Evaluation of Vascular Anastomoses in Monochorionic Placenta using Colored Dye

دقيقة وبسيطة تقييم Anastomoses الأوعية الدموية في المشيمة المشيماء باستخدام صبغ الملونة

The presence of placental vascular anastomoses is a conditio sine qua non for the development of twin-to-twin transfusion syndrome (TTTS) and twin anemia ...

Induction of Myocardial Infarction in Adult Zebrafish Using Cryoinjury

الاستقراء من احتشاء عضلة القلب في الزرد الكبار باستخدام Cryoinjury

The mammalian heart is incapable of significant regeneration following an acute injury such as myocardial infarction1. By contrast, urodele amphibians and ...

The &alpha;-test: Rapid Cell-free CD4 Enumeration Using Whole Saliva

The ÃƒÅ½Ã‚Â±-test: Rapid Cell-free CD4 Enumeration Using Whole Saliva

وα الاختبار: رابيد تعداد CD4 خالية من الخلايا عن طريق اللعاب الجامعة

There is an urgent need for affordable CD4 enumeration to monitor HIV disease. CD4 enumeration is out of reach in resource-limited regions due to the time ...

Screening for Melanoma Modifiers using a Zebrafish Autochthonous Tumor Model

الكشف عن سرطان الجلد باستخدام المعدلات اسماك الزرد الموديل ورم الأصليين

Genomic studies of  human cancers have yielded a wealth of information about genes that are altered  in tumors1,2,3. A challenge arising from these ...

Chemotherapy-induced Vascular Toxicity - Real-time In vivo Imaging of Vessel Impairment

Chemotherapy-induced Vascular Toxicity - Real-time In vivo Imaging of Vessel Impairment

الناجم عن العلاج الكيميائي الأوعية الدموية سمية - في الوقت الحقيقي<em&gt; في الجسم الحي</em&gt; التصوير من سفينة انخفاض

Certain classes of chemotherapies may exert acute vascular changes that may progress into long-term conditions that may predispose the patient to an ...

Quantification of the Immunosuppressant Tacrolimus on Dried Blood Spots Using LC-MS/MS

الكمي للمناعة tacrolimus على وبقع الدم الجافة عن طريق LC-MS / MS

The calcineurin inhibitor tacrolimus is the cornerstone of most immunosuppressive treatment protocols after solid organ transplantation in the United ...

Diffuse Optical Spectroscopy for the Quantitative Assessment of Acute Ionizing Radiation Induced Skin Toxicity Using a Mouse Model

منتشر الطيفي الضوئي للتقييم الكمي الحاد الإشعاعات المؤينة الجلد المستحث السمية باستخدام نموذج الفأر

Acute skin toxicities from ionizing radiation (IR) are a common side effect from therapeutic courses of external beam radiation therapy (RT) and ...

Solubility of Hydrophobic Compounds in Aqueous Solution Using Combinations of Self-assembling Peptide and Amino Acid

القابلية للذوبان في مجمعات الماء في المحلول باستخدام تركيبات من تجميع ذاتي الببتيد والأحماض الأمينية

Self-assembling peptides (SAPs) are promising vehicles for the delivery of hydrophobic therapeutics for clinical applications; their amphipathic ...

Evaluation of Cerebral Blood Flow Autoregulation in the Rat Using Laser Doppler Flowmetry

تقييم التنظيم التلقائي لتدفق الدم الدماغي في الفئران باستخدام الليزر دوبلر الجريان

When investigating the body&#39;s mechanisms for regulating cerebral blood flow, a relative measurement of microcirculatory blood flow can be obtained ...