Name: rapid evaluation of toxicity of chemical compounds using zebrafish embryos
Uploaded: 2019-08-25T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Rapid Evaluation of Toxicity of Chemical Compounds Using Zebrafish Embryos at JoVE.com

Arbejdet blev støttet af tilskud fra Sigrid Juselius Foundation (SP, MP), finsk kulturfond (AA, MH), Finlands Akademi (SP, MP), Orion Farmos Foundation (MH), Tampere tuberkulose Foundation (SP, MH og MP) og Jane og Aatos Erkko Foundation (SP og MP ). Vi takker vores italienske og franske samarbejdspartnere, Prof. Supuran, og Prof. Winum, for at levere carbonanhydrasehæmmere for sikkerhed og toksicitet evaluering for anti-TB og anti-cancer Drug udvikling formål. Vi takker Aulikki Lehmus og Marianne Kuuslahti for den tekniske bistand. Vi takker også Leena Mäkinen og hannaleena piippo for deres hjælp med Zebra avl og indsamling af embryoner. Vi oprigtigt takke Harlan Barker for kritisk evaluering af manuskriptet og indsigtsfulde kommentarer.

Zebra Core Facility på Tampere University har en autorisation for virksomheder, der er udstedt af det nationale dyreeksperiment nævn (esavi/7975/04.10.05/2016). Alle eksperimenter med Zebra embryoner blev udført i henhold til provinsregeringen i det østlige Finland, social-og Sundhedsministeriet i Tampere regional service Unit Protocol # lslh-2007-7254/YM-23.
1. opsætning af natten over Zebrafish Mating tanks
<ol><li>Placer 2-5 voksne mandlige Zebra og 3-5 voksne kvindelige Zebra i parr...

<ol>
	<li>Amaouche, N., Casaert Salome, H., Collignon, O., Santos, M. R., Ziogas, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Marketing+authorization+applications+submitted+to+the+European+Medicines+Agency+by+small+and+medium-sized+enterprises:+an+analysis+of+major+objections+and+their+impact+on+outcomes.">Marketing authorization applications submitted to the European Medicines Agency by small and medium-sized enterprises: an analysis of major objections and their impact on outcomes.</a> Drug Discovery Today. 23 (10), 1801-1805 (2018).</li><li>Garg, R. C., Bracken, W. M., Hoberman, A. M., Gupta, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reproductive+and+developmental+safety+evaluation+of+new+pharmaceutical+compounds.">Reproductive and developmental safety evaluation of new pharmaceutical compounds.</a> Reproductive and Developmental Toxicology. , 89-109 (2011).</li><li>Lee, H. Y., Inselman, A. L., Kanungo, J., Hansen, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+models+in+developmental+toxicology.">Alternative models in developmental toxicology.</a> Systems Biology in Reproductive Medicine. 58 (1), 10-22 (2012).</li><li>Gao, G., Chen, L., Huang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-cancer+drug+discovery:+update+and+comparisons+in+yeast,+Drosophila,+and+zebrafish.">Anti-cancer drug discovery: update and comparisons in yeast, Drosophila, and zebrafish.</a> Current Molecular Pharmacology. 7 (1), 44-51 (2014).</li><li>Brown, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+of+test+chemicals+for+the+ECVAM+international+validation+study+on+in+vitro+embryotoxicity+tests.+European+Centre+for+the+Validation+of+Alternative+Methods.">Selection of test chemicals for the ECVAM international validation study on in vitro embryotoxicity tests. European Centre for the Validation of Alternative Methods.</a> Alternatives to Laboratory Animals. 30 (2), 177-198 (2002).</li><li>Selderslaghs, I. W., Van Rompay, A. R., De Coen, W., Witters, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+screening+assay+to+identify+teratogenic+and+embryotoxic+chemicals+using+the+zebrafish+embryo.">Development of a screening assay to identify teratogenic and embryotoxic chemicals using the zebrafish embryo.</a> Reproductive Toxicology. 28 (3), 308-320 (2009).</li><li>Brannen, K. C., Panzica-Kelly, J. M., Danberry, T. L., Augustine-Rauch, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+zebrafish+embryo+teratogenicity+assay+and+quantitative+prediction+model.">Development of a zebrafish embryo teratogenicity assay and quantitative prediction model.</a> Birth Defects Research Part B Developmental and Reproductive Toxicology. 89 (1), 66-77 (2010).</li><li>Hermsen, S. A., van den Brandhof, E. J., van der Ven, L. T., Piersma, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relative+embryotoxicity+of+two+classes+of+chemicals+in+a+modified+zebrafish+embryotoxicity+test+and+comparison+with+their+in+vivo+potencies.">Relative embryotoxicity of two classes of chemicals in a modified zebrafish embryotoxicity test and comparison with their in vivo potencies.</a> Toxicology in Vitro. 25 (3), 745-753 (2011).</li><li>Lessman, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+developing+zebrafish+(Danio+rerio):+a+vertebrate+model+for+high-throughput+screening+of+chemical+libraries.">The developing zebrafish (Danio rerio): a vertebrate model for high-throughput screening of chemical libraries.</a> Birth Defects Research. Part C, Embryo Today: Reviews. 93 (3), 268-280 (2011).</li><li>Lantz-McPeak, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+toxicity+assay+using+high+content+screening+of+zebrafish+embryos.">Developmental toxicity assay using high content screening of zebrafish embryos.</a> Journal of Applied Toxicology. 35 (3), 261-272 (2015).</li><li>Truong, L., Harper, S. L., Tanguay, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+embryotoxicity+using+the+zebrafish+model.">Evaluation of embryotoxicity using the zebrafish model.</a> Methods in Molecular Biology. 691, 271-279 (2011).</li><li>Rodrigues, G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design,+synthesis,+and+evaluation+of+hydroxamic+acid+derivatives+as+promising+agents+for+the+management+of+Chagas+disease.">Design, synthesis, and evaluation of hydroxamic acid derivatives as promising agents for the management of Chagas disease.</a> Journal of Medicinal Chemistry. 57 (2), 298-308 (2014).</li><li>Kanungo, J., Cuevas, E., Ali, S. F., Paule, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+model+in+drug+safety+assessment.">Zebrafish model in drug safety assessment.</a> Current Pharmaceutical Design. 20 (34), 5416-5429 (2014).</li><li>Peterson, R. T., Link, B. A., Dowling, J. E., Schreiber, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+molecule+developmental+screens+reveal+the+logic+and+timing+of+vertebrate+development.">Small molecule developmental screens reveal the logic and timing of vertebrate development.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (24), 12965-12969 (2000).</li><li>Stainier, D. Y., Fishman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+as+a+model+system+to+study+cardiovascular+development.">The zebrafish as a model system to study cardiovascular development.</a> Trends in Cardiovascular Medicine. 4 (5), 207-212 (1994).</li><li>Aspatwar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitroimidazole-based+inhibitors+DTP338+and+DTP348+are+safe+for+zebrafish+embryos+and+efficiently+inhibit+the+activity+of+human+CA+IX+in+Xenopus+oocytes.">Nitroimidazole-based inhibitors DTP338 and DTP348 are safe for zebrafish embryos and efficiently inhibit the activity of human CA IX in Xenopus oocytes.</a> Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry. 33 (1), 1064-1073 (2018).</li><li>Rami, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia-targeting+carbonic+anhydrase+IX+inhibitors+by+a+new+series+of+nitroimidazole-sulfonamides/sulfamides/sulfamates.">Hypoxia-targeting carbonic anhydrase IX inhibitors by a new series of nitroimidazole-sulfonamides/sulfamides/sulfamates.</a> Journal of Medicinal Chemistry. 56 (21), 8512-8520 (2013).</li><li>Spitsbergen, J. M., Kent, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+state+of+the+art+of+the+zebrafish+model+for+toxicology+and+toxicologic+pathology+research--advantages+and+current+limitations.">The state of the art of the zebrafish model for toxicology and toxicologic pathology research--advantages and current limitations.</a> Toxicologic Pathology. , 62-87 (2003).</li><li>Teraoka, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+cytochrome+P450+1A+is+required+for+circulation+failure+and+edema+by+2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin+in+zebrafish.">Induction of cytochrome P450 1A is required for circulation failure and edema by 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin in zebrafish.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 304 (2), 223-228 (2003).</li><li>Zon, L. I., Peterson, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+drug+discovery+in+the+zebrafish.">In vivo drug discovery in the zebrafish.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 4 (1), 35-44 (2005).</li><li>Hill, A. J., Teraoka, H., Heideman, W., Peterson, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+as+a+model+vertebrate+for+investigating+chemical+toxicity.">Zebrafish as a model vertebrate for investigating chemical toxicity.</a> Toxicological Sciences. 86 (1), 6-19 (2005).</li><li>Kari, G., Rodeck, U., Dicker, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish:+an+emerging+model+system+for+human+disease+and+drug+discovery.">Zebrafish: an emerging model system for human disease and drug discovery.</a> Clinical Pharmacology and Therapeutics. 82 (1), 70-80 (2007).</li><li>Gourmelon, A., Delrue, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+in+Support+of+Internationally+Harmonised+OECD+Test+Guidelines+for+Assessing+the+Safety+of+Chemicals.">Validation in Support of Internationally Harmonised OECD Test Guidelines for Assessing the Safety of Chemicals.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 856, 9-32 (2016).</li><li>Aspatwar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=beta-CA-specific+inhibitor+dithiocarbamate+Fc14-584B:+a+novel+antimycobacterial+agent+with+potential+to+treat+drug-resistant+tuberculosis.">beta-CA-specific inhibitor dithiocarbamate Fc14-584B: a novel antimycobacterial agent with potential to treat drug-resistant tuberculosis.</a> Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry. 32 (1), 832-840 (2017).</li><li>Kazokaite, J., Aspatwar, A., Kairys, V., Parkkila, S., Matulis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorinated+benzenesulfonamide+anticancer+inhibitors+of+carbonic+anhydrase+IX+exhibit+lower+toxic+effects+on+zebrafish+embryonic+development+than+ethoxzolamide.">Fluorinated benzenesulfonamide anticancer inhibitors of carbonic anhydrase IX exhibit lower toxic effects on zebrafish embryonic development than ethoxzolamide.</a> Drug and Chemical Toxicology. 40 (3), 309-319 (2017).</li><li>Howe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+reference+genome+sequence+and+its+relationship+to+the+human+genome.">The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome.</a> Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).</li><li>Granato, M., Nusslein-Volhard, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fishing+for+genes+controlling+development.">Fishing for genes controlling development.</a> Current Opinion in Genetics &amp; Development. 6 (4), 461-468 (1996).</li><li>Bambino, K., Chu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+in+Toxicology+and+Environmental+Health.">Zebrafish in Toxicology and Environmental Health.</a> Current Topics in Developmental Biology. 124, 331-367 (2017).</li><li>Goldsmith, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+as+a+pharmacological+tool:+the+how,+why+and+when.">Zebrafish as a pharmacological tool: the how, why and when.</a> Current Opinion in Pharmacology. 4 (5), 504-512 (2004).</li></ol>

In vitro toksicitetstest ved hjælp af dyrkede celler kan detektere overlevelse og morfologiske undersøgelser af cellerne, der giver begrænsede oplysninger om toksiciteten induceret af teststoffet. Fordelen ved toksicitets screening af kemiske forbindelser ved hjælp af zebrafiskembryoner er hurtig påvisning af kemisk inducerede fænotypiske forandringer i et helt dyr under fosterudviklingen i en relevant model organisme. Omkring 70% af protein-kodning menneskelige gener har orthologs modparter i Zebra genom<...

Narkotika udvikling er en kostbar proces. Før en enkelt kemisk forbindelse er godkendt af Food and Drug Administration (FDA) og det Europæiske Lægemiddelagentur (EMA) flere tusinde forbindelser screenes til en pris på over 1.000.000.000 dollars1. Under den prækliniske udvikling, den største del af denne omkostning er nødvendig for dyreforsøg2. For at begrænse omkostningerne har forskere inden for narkotika udvikling brug for alternative modeller til sikkerhedsscreening af kemiske forbindelser3. Derfor, i den tidlige fase af lægemiddel udviklingen, ville det være meget gavnligt at bruge en metode, der hurtigt kan evaluere sikkerheden og toksiciteten af forbindelserne i en passende model. Der er flere protokoller, der er blevet anvendt til toksicitets screening af kemiske forbindelser, der involverer dyre-og cellekultur modeller, men der er ikke en enkelt protokol, som er valideret og er til fælles brug4,5. Eksisterende protokoller med Zebra varierer i længden og er blevet brugt af individuelle forskere, der vurderede toksiciteten som pr deres bekvemmelighed krav6,7,8,9, 10 , 11 , 12.
I den seneste fortid, zebra er dukket op som en bekvem model for vurdering af toksiciteten af kemiske forbindelser under embryonale udvikling6,7. Zebra har mange indbyggede fordele til vurdering af kemiske forbindelser13. Selv store eksperimenter er modtagelige, som en zebra kvinde kan lægge partier af 200-300 æg, som udvikler sig hurtigt ex vivo, behøver ikke ekstern fodring i op til en uge og er gennemsigtige. Forbindelserne kan tilsættes direkte i vandet, hvor de kan (afhængigt af arten af den sammensatte) diffus gennem chorion, og efter klækning, gennem huden, gæller og mund af larver. Forsøgene kræver ikke rigelige mængder af kemiske forbindelser14 på grund af den lille størrelse af embryonet. Udvikle Zebra embryoner udtrykker de fleste af de proteiner, der kræves for at opnå det normale udviklingsmæssige resultat. Derfor er en zebra embryo en følsom model til at vurdere, om et potentielt lægemiddel kan forstyrre funktionen af et protein eller signalerings molekyle, der er udviklingsmæssigt signifikant. De organer af Zebra bliver funktionelle mellem 2-5 DPF15, og forbindelser, der er giftige i denne følsomme periode af embryonale udvikling inducerer fænotypiske defekter i Zebra larver. Disse fænotypiske ændringer kan let påvises ved hjælp af et simpelt mikroskop uden invasive teknikker11. Zebrafish embryoner er meget udbredt i toksikologisk forskning på grund af deres langt større biologisk kompleksitet i forhold til in vitro Drug screening ved hjælp af cellekultur modeller16,17.  Som et hvirveldyr er den genetiske og fysiologiske makeup af Zebra sammenlignelig med mennesker, og derfor er toksiciteter af kemiske forbindelser ens mellem Zebra og mennesker8,18,19, 20 , 21 , 22. zebrafish er således et værdifuldt redskab i den tidlige fase af lægemiddel opdagelsen til vurdering af de kemiske forbindelsers Toksicitet og sikkerhed.
I denne artikel giver vi en detaljeret beskrivelse af den metode, der anvendes til at evaluere sikkerheden og toksiciteten af carbonanhydrase (ca)-hæmmer forbindelser ved hjælp af 1-5-dag efter befrugtning (DPF) Zebra embryoner af en enkelt forsker. Protokollen indebærer at udsætte Zebra-embryoner for forskellige koncentrationer af kemiske inhibitor forbindelser og studere dødelighed og fænotypiske forandringer under fosterudviklingen. Ved afslutningen af eksponeringen for de kemiske forbindelser bestemmes LC50 dosis af kemikaliet. Metoden gør det muligt for en person at udføre effektiv screening af 1-5 test forbindelser og tager omkring 8-10 h afhængigt af oplevelsen af den person med metoden (figur 1). Hvert af de skridt, der kræves for at vurdere toksiciteten af forbindelserne er skitseret i figur 2. Vurderingen af toksicitet af CA-hæmmere kræver 8 dage, og omfatter opsætning af parring par (dag 1); opsamling af embryoner fra avls tanke, rengøring og overførsel til 28,5 °C inkubator (dag 2); fordeling af embryonerne i brøndene på en 24-brønd plade og tilsætning af fortyndede CA-inhibitor forbindelser (dag 3); fænotypisk analyse og billeddannelse af larver (dag 4-8) og bestemmelse af LC50 dosis (day8).  Denne metode er hurtig og effektiv, kræver en lille mængde af den kemiske forbindelse og kun grundlæggende faciliteter på laboratoriet.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:972px;" width="972">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:342px;">24-well plates</td>
			<td style="width:185px;">Nunc</td>
			<td style="width:260px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:185px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:342px;">Balance (Weighing scale)</td>
			<td style="width:185px;">KERN</td>
			<td style="width:260px;">PLJ3000-2CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:342px;">Balance (Weighing scale)</td>
			<td style="width:185px;">Mettler Toledo</td>
			<td style="width:260px;">AB104-S/PH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:342px;">CaCl2</td>
			<td style="width:185px;">JT.Baker</td>
			<td style="width:260px;">RS421910024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:342px;">Disecting Probe</td>
			<td style="width:185px;">Thermo Scientific</td>
			<td>17-467-604&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:342px;">DMSO</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich, Germany</td>
			<td style="width:260px;">D4540</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:342px;">Falcon tubes 15 mL</td>
			<td style="width:185px;">Greiner bio-one</td>
			<td style="width:260px;">188271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:342px;">High molecular weight methylcellulose</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich, Germany</td>
			<td style="width:260px;">M0262&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:342px;">Incubator for zebrafish larvae</td>
			<td style="width:185px;">Termaks</td>
			<td style="width:260px;">B8000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:342px;">KCL</td>
			<td style="width:185px;">Merck</td>
			<td style="width:260px;">1.04936.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:342px;">Methyl Blue</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich, Germany</td>
			<td style="width:260px;">28983-56-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:342px;">MgSO4</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich, Germany</td>
			<td style="width:260px;">M7506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:342px;">Microcentrifuge tubes</td>
			<td style="width:185px;">Starlab</td>
			<td style="width:260px;">S1615-5500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:342px;">NaCl</td>
			<td style="width:185px;">VWR Chemicals</td>
			<td style="width:260px;">27810.295</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:342px;">Paraffin Histoplast IM</td>
			<td style="width:185px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:260px;">8331</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:342px;">Pasteur pipette&#160;</td>
			<td style="width:185px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:260px;">86.1171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:342px;">Petri dish</td>
			<td style="width:185px;">Thermo Scientific</td>
			<td>101R20&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:342px;">Petri plates</td>
			<td style="width:185px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:260px;">82.1473</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:342px;">Pipette (1 mL and 200 &#956;L)</td>
			<td style="width:185px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:260px;">4641230N, 4641210N&#160;&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:342px;">Plates 24-Well</td>
			<td style="width:185px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:260px;">142485</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:342px;">Steriomicroscope/Camera</td>
			<td style="width:185px;">Zeiss</td>
			<td style="width:260px;">Stemi 2000-C/Axiocam 105 color</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:342px;">Vials (1.5 mL)</td>
			<td style="width:185px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:260px;">11569914</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:342px;">Zebrafish AB strains</td>
			<td style="width:185px;">ZIRC&#160;</td>
			<td style="width:260px;">&#160; ZL1&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid evaluation of toxicity of chemical compounds using zebrafish embryos

Den Zebra er en udbredte hvirveldyr model organisme for sygdommen og fænotype-baserede Drug Discovery. Den Zebra genererer mange afkom, har gennemsigtige embryoner og hurtig ekstern udvikling. Zebrafish-embryoner kan derfor også anvendes til hurtig vurdering af toksiciteten af de lægemidler, der er dyrebare og tilgængelige i små mængder. I denne artikel beskrives en metode til effektiv screening af toksiciteten af kemiske forbindelser, der anvender 1-5-dages efter befrugtnings embryoner. Embryonerne overvåges af stereomicroskop for at undersøge de fænotypiske defekter, der forårsages af eksponeringen for forskellige koncentrationer af forbindelser. Halv-maximale dødelige koncentrationer (LC50) af forbindelserne bestemmes også. Den nuværende undersøgelse krævede 3-6 mg af en inhibitor sammensatte, og hele eksperimentet tager omkring 8-10 h, der skal udfyldes af en person i et laboratorium, der har grundlæggende faciliteter. Den nuværende protokol er egnet til at teste enhver forbindelse til at identificere uacceptable toksiske eller off-Target effekter af forbindelsen i den tidlige fase af Drug Discovery og til at opdage subtile toksiske virkninger, der kan blive savnet i cellekulturen eller andre dyremodeller. Metoden mindsker procedure forsinkelser og omkostninger til narkotika udvikling.

Den kritiske del af vurderingen af toksicitet er afprøvning af forskellige koncentrationer af en eller flere kemiske forbindelser i et enkelt eksperiment. I begyndelsen skal du vælge de forbindelser til evaluering af toksicitet, antallet af koncentrationer til at teste for hver forbindelse, og derfor gøre et diagram (figur 3). Vi brugte en unik farve for hver forbindelse til at organisere prøverne (figur 3). Brugen af solvent...

Watch this Scientific Journal Video about Rapid Evaluation of Toxicity of Chemical Compounds Using Zebrafish Embryos at JoVE.com

Rapid Evaluation of Toxicity of Chemical Compounds Using Zebrafish Embryos

Zebrafish embryoner anvendes til at evaluere toksiciteten af kemiske forbindelser. De udvikler sig eksternt og er følsomme over for kemikalier, hvilket gør det muligt at påvise subtile fænotypiske forandringer. Eksperimentet kræver kun en lille mængde af sammensatte, som er direkte føjet til pladen, der indeholder embryoner, hvilket gør testsystemet effektivt og omkostningseffektivt.

Hurtig evaluering af kemiske forbindelsers Toksicitet ved hjælp af Zebrafish-embryoner

The zebrafish is a widely used vertebrate model organism for the disease and phenotype-based drug discovery. The zebrafish generates many offspring, has ...

Toksicitet testprocedurer vil blive demonstreret af Dr.Ashok Aspatwar, en seniorforsker fra mit laboratorium. Vores protokol identificerer off-target effekter og registrerer subtile toksiske virkninger af kemikalier i den tidlige fase af opdagelsen, der kan være savnet i cellekultur eller andre dyremodeller. De vigtigste fordele ved vores teknik er: det er hurtigt og effektivt, kræver meget lille mængde af kemiske, og de grundlæggende faciliteter i laboratoriet.Toksicitet screening vil hjælpe os med at beslutte koncentrationen for at studere dens effektivitet mod mycobacterium, der forårsager tuberkulose og for yderligere præklinisk beregning. Denne metode bruger indsigt i off-target effekter af kemikalier, og dermed denne metode kan anvendes i ethvert forskningsområde, hvor toksiciteten af kemiske er af primær betydning. Denne metode er meget enkel og kan udføres af nogen uden forudgående erfaring.Personer uden erfaring bør planlægge eksperimentet omhyggeligt og kun bruge én forbindelse. Denne metode giver toksiske virkninger af kemikalierne i form af fænoypiske ændringer i de udviklende zebrafiskembryoner og dermed sikkerheden af de testede forbindelser. Til at begynde, sted to til fem voksne mandlige zebrafisk og tre til fem voksne kvindelige zebrafisk i parring tanke natten over.Om morgenen tændes lyset, da avlen induceres af den automatiske mørke og efterfølgende lyscyklus. For at undgå at håndtere stress på dyrene skal dyrene hvile i to uger, før de samme individer skal opdrættes. Dagen efter før middag indsamles embryonerne ved hjælp af en finmasket si, og overføre dem på en petriskål, der indeholder E3 embryo medium.Placer petriskålen under et stereomikroskop for at undersøge hvert parti embryoner. Identificer det uigennemsigtige udseende, og fjern dem som ubefrugtede eller døde embryoner. Hold embryonerne på 28,5 grader Celsius i en kuvøse natten over.Næste morgen skal embryonerne undersøges under et stereomikroskop, og alle usunde eller døde embryoner fjernes. Brug forsigtigt en pasteurpipette til at overføre et foster til hver brønd på en 24 brøndplade. Sørg for, at hver brønd indeholder nok E3 medium til at dække embryoner.Tag hætteglassene med inhibitorforbindelser, der opbevares ved 4 grader Celsius, ud i køleskab. Der anvendes en analysevægt til at veje en passende mængde af forbindelsen, og der klargør 250 mikroliter 100 millimolar stock-opløsning for hver forbindelse i E3-medium eller et andet passende opløsningsmiddel. Brug derefter E3-mediet til at foretage serielle fortyndinger af stamopløsningerne baseret på toksicitetsniveauer i 15 millilitercentrifugerør.Fra brøndene, der hver indeholder en DPF embryo, skal du bruge en pasteur pipette og 1 milliliter pipette til at fjerne E3 vand en række ad gangen. 1 milliliter af hver fortyndingstyndingsopløsninger fordeles straks i brøndene på den 24 brøndplade, der starter fra lavere og flytter til højere koncentration. For kontrolgrupperne tilsættes E3 vand eller et andet relevant opløsningsmiddel.Label 24 brøndplader med navn og koncentration af forbindelsen og holde pladerne på 28,5 grader Celsius i en inkubator. Pas på, at fortyndendende stofferne i brøndene ikke fordampes i inkubatoren ved at forsegle siderne af 24 brøndplade. Fireogtyve timer efter eksponering af de kemiske forbindelser, bruge en pasteur pipette til at overføre larver udsat for hver koncentration af forbindelsen i en lille petriskål, der indeholder 3% høj molekylvægt methyl cellulose.Med en metalsonde, læg den sidelæns. Placer petriskålen under et stereomikroskop, der er fastgjort til et kamera. Tag billederne, og gem billederne i en separat mappe hver dag indtil afslutningen af eksperimentet.Angiv alle observationerne i en tabel hver dag enten i en onlinetabel eller på et udskrevet ark. For neurotoksisk sammensat eksponering, de fire til fem DPF larver kan vise unormal svømme mønster. I så fald skal du registrere sådanne ændringer ved at fange en kort 30 sekunder til et minut video af larverne.Efter fem dages udsættelse for de kemiske forbindelser skal det bemærkes, at halvdelen af embryonerne dør som den halve maksimale dødelige koncentration 50 af hvert kemikalie. Konstruere en kurve for dødelighed af embryoner for alle koncentrationer ved hjælp af et passende program. I denne protokol tester den kritiske del af toksicitetsvurderingen forskellige koncentrationer af en eller flere kemiske forbindelser i et enkelt eksperiment.For de forbindelser, der fremkalder fænotopypiske defekter i larverne, blev defekterne registreret hver 24. Embryonerne, der behandles med beta CA-hæmmere ved koncentrationerne af 250 mikromolar og 125 mikromolar, udviser forskellige fænotopypiske defekter sammenlignet med kontrollen. For eksempel, unhatched embryoner selv på dag 3, buet kropsstruktur, utilgivet æggeblomme sæk og perikardiel ødem, og fravær af otolith sække i larverne på fem dage efter behandlingen.I en anden undersøgelse viste embryonerne behandlet med CA-hæmmere fraværet af otolith sække og svømmeblære. Forsøgene identificerede en repræsentativ forbindelseskulstofanhydrase 9, som inducerede minimale eller ingen fænotopypiske ændringer under embryonale udvikling på 500 mikromolar. Forbindelsen viste en høj LC50 koncentration.I en sammenligning med en kontrol blev det imidlertid konstateret, at det samme stof ved 300 mikromolar var neurotoksisk og induceret ataksi i larverne efter fem dages eksponering. En god kvalitet af embryoner er vigtige for toksicitetsscreening af kemikalier. For at opnå høj kvalitet embryoner, bruge unge par voksne zebrafisk til avl.De forbindelser, der fremstår som sikre, kan karakteriseres yderligere ved at udføre relevante in vitro- og in vivo-eksperimenter. Inden for udvikling af lægemidler mod blodfjerdse bidrog denne teknik til at etablere yderligere forsøg med in vivo-hæmning af mycobacterium marinum i zebrafiskembryoner. Protokollen indebærer brug af kemikalier, der kan være giftige for mennesker.Personer, der er involveret i forsøgene, bør være behørigt forsigtige, når de håndterer kemikalierne.

Research

JoVE Journal

Medicine

Evaluation of Nanoparticle Uptake in Tumors in Real Time Using Intravital Imaging

Current technologies for tumor imaging, such as ultrasound, MRI, PET and CT, are unable to yield high-resolution images for the assessment of nanoparticle ...

Accurate and Simple Evaluation of Vascular Anastomoses in Monochorionic Placenta using Colored Dye

The presence of placental vascular anastomoses is a conditio sine qua non for the development of twin-to-twin transfusion syndrome (TTTS) and twin anemia ...

Induction of Myocardial Infarction in Adult Zebrafish Using Cryoinjury

Induktion af myokardieinfarkt i Adult Zebrafisk Brug kryobeskadigelse

The mammalian heart is incapable of significant regeneration following an acute injury such as myocardial infarction1. By contrast, urodele amphibians and ...

The &alpha;-test: Rapid Cell-free CD4 Enumeration Using Whole Saliva

The ÃƒÅ½Ã‚Â±-test: Rapid Cell-free CD4 Enumeration Using Whole Saliva

Den α-test: Rapid Cellefri CD4 Optælling Anvendelse helspyt

There is an urgent need for affordable CD4 enumeration to monitor HIV disease. CD4 enumeration is out of reach in resource-limited regions due to the time ...

Screening for Melanoma Modifiers using a Zebrafish Autochthonous Tumor Model

Screening for Melanoma Modifiers anvendelse af et zebrafisk Autokton tumormodel

Genomic studies of  human cancers have yielded a wealth of information about genes that are altered  in tumors1,2,3. A challenge arising from these ...

Chemotherapy-induced Vascular Toxicity - Real-time In vivo Imaging of Vessel Impairment

Chemotherapy-induced Vascular Toxicity - Real-time In vivo Imaging of Vessel Impairment

Kemoterapi-induceret vaskulær toksicitet - Real-time<em&gt; In vivo</em&gt; Imaging af Vessel Nedskrivninger

Certain classes of chemotherapies may exert acute vascular changes that may progress into long-term conditions that may predispose the patient to an ...

Quantification of the Immunosuppressant Tacrolimus on Dried Blood Spots Using LC-MS/MS

Kvantificering af det immunsuppressive Tacrolimus om Tørrede blodpletter ved LC-MS / MS

The calcineurin inhibitor tacrolimus is the cornerstone of most immunosuppressive treatment protocols after solid organ transplantation in the United ...

Diffuse Optical Spectroscopy for the Quantitative Assessment of Acute Ionizing Radiation Induced Skin Toxicity Using a Mouse Model

Diffus optisk spektroskopi til kvantitativ vurdering af akut ioniserende stråling induceret hudtoksicitet Brug af mus Model

Acute skin toxicities from ionizing radiation (IR) are a common side effect from therapeutic courses of external beam radiation therapy (RT) and ...

Solubility of Hydrophobic Compounds in Aqueous Solution Using Combinations of Self-assembling Peptide and Amino Acid

Opløseligheden af hydrofobe forbindelser i vandig opløsning ved hjælp af kombinationer af selvstændige montage peptid og aminosyre

Self-assembling peptides (SAPs) are promising vehicles for the delivery of hydrophobic therapeutics for clinical applications; their amphipathic ...

Evaluation of Cerebral Blood Flow Autoregulation in the Rat Using Laser Doppler Flowmetry

Evaluering af cerebral Blood flow Autoregulation i rotter ved hjælp af Laser Doppler Flowmetry

When investigating the body&#39;s mechanisms for regulating cerebral blood flow, a relative measurement of microcirculatory blood flow can be obtained ...