Name: rapid evaluation of toxicity of chemical compounds using zebrafish embryos
Uploaded: 2019-08-25T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Rapid Evaluation of Toxicity of Chemical Compounds Using Zebrafish Embryos at JoVE.com

Het werk werd gesteund door subsidies van Sigrid Juselius Foundation (SP, MP), Fins Cultural Foundation (AA, MH), Academy of Finland (SP, MP), Orion Farmos Foundation (MH), Tampere Tuberculosefonds (SP, MH en MP) en Jane en Aatos Erkko Foundation (SP en MP ). We danken onze Italiaanse en Franse medewerkers, Prof. Supuran, en Prof. Winum, voor het leveren van koolzuuranhydraseremmers voor de veiligheid en toxiciteit bij de evaluatie van anti-TUBERCULOSE en anti-kankergeneesmiddelen ontwikkeling. Wij danken Aulikki Lehmus en Marianne Kuuslahti voor de technische bijstand. We bedanken ook Leena Mäkinen en Hannaleena Piippo voor hun hulp bij het fokken van zebravis en het verzamelen van embryo's. We danken Harlan Barker oprecht voor de kritische evaluatie van het manuscript en inzichtelijke commentaren.

De kern faciliteit van zebravis aan de Universiteit van Tampere heeft een vestigingsvergunning verleend door de National Animal experiment Board (esavi/7975/04.10.05/2016). Alle experimenten met behulp van zebravis embryo's werden uitgevoerd volgens de provinciale overheid van Oost-Finland, sociale en gezondheidsafdeling van Tampere Regional Service Unit protocol # LSLH-2007-7254/YM-23.
1. opzetten van overnight zebravis parings tanks
<ol><li>Plaats 2-5 volwassen mannelijke zebravis en 3-5 v...

<ol>
	<li>Amaouche, N., Casaert Salome, H., Collignon, O., Santos, M. R., Ziogas, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Marketing+authorization+applications+submitted+to+the+European+Medicines+Agency+by+small+and+medium-sized+enterprises:+an+analysis+of+major+objections+and+their+impact+on+outcomes.">Marketing authorization applications submitted to the European Medicines Agency by small and medium-sized enterprises: an analysis of major objections and their impact on outcomes.</a> Drug Discovery Today. 23 (10), 1801-1805 (2018).</li><li>Garg, R. C., Bracken, W. M., Hoberman, A. M., Gupta, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reproductive+and+developmental+safety+evaluation+of+new+pharmaceutical+compounds.">Reproductive and developmental safety evaluation of new pharmaceutical compounds.</a> Reproductive and Developmental Toxicology. , 89-109 (2011).</li><li>Lee, H. Y., Inselman, A. L., Kanungo, J., Hansen, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+models+in+developmental+toxicology.">Alternative models in developmental toxicology.</a> Systems Biology in Reproductive Medicine. 58 (1), 10-22 (2012).</li><li>Gao, G., Chen, L., Huang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-cancer+drug+discovery:+update+and+comparisons+in+yeast,+Drosophila,+and+zebrafish.">Anti-cancer drug discovery: update and comparisons in yeast, Drosophila, and zebrafish.</a> Current Molecular Pharmacology. 7 (1), 44-51 (2014).</li><li>Brown, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+of+test+chemicals+for+the+ECVAM+international+validation+study+on+in+vitro+embryotoxicity+tests.+European+Centre+for+the+Validation+of+Alternative+Methods.">Selection of test chemicals for the ECVAM international validation study on in vitro embryotoxicity tests. European Centre for the Validation of Alternative Methods.</a> Alternatives to Laboratory Animals. 30 (2), 177-198 (2002).</li><li>Selderslaghs, I. W., Van Rompay, A. R., De Coen, W., Witters, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+screening+assay+to+identify+teratogenic+and+embryotoxic+chemicals+using+the+zebrafish+embryo.">Development of a screening assay to identify teratogenic and embryotoxic chemicals using the zebrafish embryo.</a> Reproductive Toxicology. 28 (3), 308-320 (2009).</li><li>Brannen, K. C., Panzica-Kelly, J. M., Danberry, T. L., Augustine-Rauch, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+zebrafish+embryo+teratogenicity+assay+and+quantitative+prediction+model.">Development of a zebrafish embryo teratogenicity assay and quantitative prediction model.</a> Birth Defects Research Part B Developmental and Reproductive Toxicology. 89 (1), 66-77 (2010).</li><li>Hermsen, S. A., van den Brandhof, E. J., van der Ven, L. T., Piersma, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relative+embryotoxicity+of+two+classes+of+chemicals+in+a+modified+zebrafish+embryotoxicity+test+and+comparison+with+their+in+vivo+potencies.">Relative embryotoxicity of two classes of chemicals in a modified zebrafish embryotoxicity test and comparison with their in vivo potencies.</a> Toxicology in Vitro. 25 (3), 745-753 (2011).</li><li>Lessman, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+developing+zebrafish+(Danio+rerio):+a+vertebrate+model+for+high-throughput+screening+of+chemical+libraries.">The developing zebrafish (Danio rerio): a vertebrate model for high-throughput screening of chemical libraries.</a> Birth Defects Research. Part C, Embryo Today: Reviews. 93 (3), 268-280 (2011).</li><li>Lantz-McPeak, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+toxicity+assay+using+high+content+screening+of+zebrafish+embryos.">Developmental toxicity assay using high content screening of zebrafish embryos.</a> Journal of Applied Toxicology. 35 (3), 261-272 (2015).</li><li>Truong, L., Harper, S. L., Tanguay, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+embryotoxicity+using+the+zebrafish+model.">Evaluation of embryotoxicity using the zebrafish model.</a> Methods in Molecular Biology. 691, 271-279 (2011).</li><li>Rodrigues, G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design,+synthesis,+and+evaluation+of+hydroxamic+acid+derivatives+as+promising+agents+for+the+management+of+Chagas+disease.">Design, synthesis, and evaluation of hydroxamic acid derivatives as promising agents for the management of Chagas disease.</a> Journal of Medicinal Chemistry. 57 (2), 298-308 (2014).</li><li>Kanungo, J., Cuevas, E., Ali, S. F., Paule, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+model+in+drug+safety+assessment.">Zebrafish model in drug safety assessment.</a> Current Pharmaceutical Design. 20 (34), 5416-5429 (2014).</li><li>Peterson, R. T., Link, B. A., Dowling, J. E., Schreiber, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+molecule+developmental+screens+reveal+the+logic+and+timing+of+vertebrate+development.">Small molecule developmental screens reveal the logic and timing of vertebrate development.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (24), 12965-12969 (2000).</li><li>Stainier, D. Y., Fishman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+as+a+model+system+to+study+cardiovascular+development.">The zebrafish as a model system to study cardiovascular development.</a> Trends in Cardiovascular Medicine. 4 (5), 207-212 (1994).</li><li>Aspatwar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitroimidazole-based+inhibitors+DTP338+and+DTP348+are+safe+for+zebrafish+embryos+and+efficiently+inhibit+the+activity+of+human+CA+IX+in+Xenopus+oocytes.">Nitroimidazole-based inhibitors DTP338 and DTP348 are safe for zebrafish embryos and efficiently inhibit the activity of human CA IX in Xenopus oocytes.</a> Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry. 33 (1), 1064-1073 (2018).</li><li>Rami, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia-targeting+carbonic+anhydrase+IX+inhibitors+by+a+new+series+of+nitroimidazole-sulfonamides/sulfamides/sulfamates.">Hypoxia-targeting carbonic anhydrase IX inhibitors by a new series of nitroimidazole-sulfonamides/sulfamides/sulfamates.</a> Journal of Medicinal Chemistry. 56 (21), 8512-8520 (2013).</li><li>Spitsbergen, J. M., Kent, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+state+of+the+art+of+the+zebrafish+model+for+toxicology+and+toxicologic+pathology+research--advantages+and+current+limitations.">The state of the art of the zebrafish model for toxicology and toxicologic pathology research--advantages and current limitations.</a> Toxicologic Pathology. , 62-87 (2003).</li><li>Teraoka, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+cytochrome+P450+1A+is+required+for+circulation+failure+and+edema+by+2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin+in+zebrafish.">Induction of cytochrome P450 1A is required for circulation failure and edema by 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin in zebrafish.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 304 (2), 223-228 (2003).</li><li>Zon, L. I., Peterson, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+drug+discovery+in+the+zebrafish.">In vivo drug discovery in the zebrafish.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 4 (1), 35-44 (2005).</li><li>Hill, A. J., Teraoka, H., Heideman, W., Peterson, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+as+a+model+vertebrate+for+investigating+chemical+toxicity.">Zebrafish as a model vertebrate for investigating chemical toxicity.</a> Toxicological Sciences. 86 (1), 6-19 (2005).</li><li>Kari, G., Rodeck, U., Dicker, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish:+an+emerging+model+system+for+human+disease+and+drug+discovery.">Zebrafish: an emerging model system for human disease and drug discovery.</a> Clinical Pharmacology and Therapeutics. 82 (1), 70-80 (2007).</li><li>Gourmelon, A., Delrue, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+in+Support+of+Internationally+Harmonised+OECD+Test+Guidelines+for+Assessing+the+Safety+of+Chemicals.">Validation in Support of Internationally Harmonised OECD Test Guidelines for Assessing the Safety of Chemicals.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 856, 9-32 (2016).</li><li>Aspatwar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=beta-CA-specific+inhibitor+dithiocarbamate+Fc14-584B:+a+novel+antimycobacterial+agent+with+potential+to+treat+drug-resistant+tuberculosis.">beta-CA-specific inhibitor dithiocarbamate Fc14-584B: a novel antimycobacterial agent with potential to treat drug-resistant tuberculosis.</a> Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry. 32 (1), 832-840 (2017).</li><li>Kazokaite, J., Aspatwar, A., Kairys, V., Parkkila, S., Matulis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorinated+benzenesulfonamide+anticancer+inhibitors+of+carbonic+anhydrase+IX+exhibit+lower+toxic+effects+on+zebrafish+embryonic+development+than+ethoxzolamide.">Fluorinated benzenesulfonamide anticancer inhibitors of carbonic anhydrase IX exhibit lower toxic effects on zebrafish embryonic development than ethoxzolamide.</a> Drug and Chemical Toxicology. 40 (3), 309-319 (2017).</li><li>Howe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+reference+genome+sequence+and+its+relationship+to+the+human+genome.">The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome.</a> Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).</li><li>Granato, M., Nusslein-Volhard, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fishing+for+genes+controlling+development.">Fishing for genes controlling development.</a> Current Opinion in Genetics &amp; Development. 6 (4), 461-468 (1996).</li><li>Bambino, K., Chu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+in+Toxicology+and+Environmental+Health.">Zebrafish in Toxicology and Environmental Health.</a> Current Topics in Developmental Biology. 124, 331-367 (2017).</li><li>Goldsmith, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+as+a+pharmacological+tool:+the+how,+why+and+when.">Zebrafish as a pharmacological tool: the how, why and when.</a> Current Opinion in Pharmacology. 4 (5), 504-512 (2004).</li></ol>

In vitro toxiciteitstest met behulp van gekweekte cellen kan overleven en morfologische studies van de cellen die beperkte informatie over de toxiciteit geïnduceerd door de teststof te detecteren. Het voordeel van toxiciteits screening van chemische verbindingen met behulp van zebravis embryo's is een snelle detectie van chemisch geïnduceerde fenotypische veranderingen in een heel dier tijdens de embryonale ontwikkeling in een relevant modelorganisme. Ongeveer 70% van de eiwit codering menselijke genen hebben ...

De ontwikkeling van geneesmiddelen is een kostbaar proces. Voordat een enkele chemische verbinding wordt goedgekeurd door de Food and Drug Administration (FDA) en Europees Geneesmiddelenbureau (EMA) enkele duizend verbindingen worden gescreend tegen een kostprijs van meer dan 1.000.000.000 dollar1. Tijdens de preklinische ontwikkeling is het grootste deel van deze kosten vereist voor de dierproeven2. Om de kosten te beperken, hebben onderzoekers op het gebied van Geneesmiddelenontwikkeling alternatieve modellen nodig voor de veiligheids screening van chemische verbindingen3. Daarom, in de vroege fase van de ontwikkeling van het geneesmiddel, het zou zeer gunstig zijn voor het gebruik van een methode die snel de veiligheid en de toxiciteit van de verbindingen in een geschikt model kan evalueren. Er zijn verschillende protocollen die zijn gebruikt voor de toxiciteits screening van chemische verbindingen waarbij dier-en celkweek modellen zijn betrokken, maar er is geen enkel protocol dat wordt gevalideerd en dat gemeenschappelijk wordt gebruikt4,5. Bestaande protocollen die zebravis gebruiken, variëren in lengte en zijn gebruikt door individuele onderzoekers die de toxiciteit hebben geëvalueerd aan de hand van hun gemak vereiste6,7,8,9, 10 , 11 , 12.
In het recente verleden is de zebravis naar voren gekomen als een handig model voor de evaluatie van de toxiciteit van chemische verbindingen tijdens de embryonale ontwikkeling op6,7. De zebravis heeft veel ingebouwde voordelen voor de evaluatie van chemische verbindingen13. Zelfs grootschalige experimenten zijn vatbaar, omdat een zebravis-vrouw batches van 200-300 eieren kan leggen, die snel ex vivoontwikkelen, geen externe voeding nodig hebben voor maximaal een week en transparant zijn. De verbindingen kunnen direct in het water worden toegevoegd, waar ze kunnen (afhankelijk van de aard van de compound) diffuus door de chorion, en na het uitkomen, door de huid, kieuwen en de mond van larven. De experimenten vereisen geen overvloedige hoeveelheden chemische verbindingen14 vanwege de geringe omvang van het embryo. Het ontwikkelen van zebravis embryo's Express de meeste eiwitten die nodig zijn om het normale ontwikkelings resultaat te bereiken. Daarom is een zebravis embryo een gevoelig model om te beoordelen of een potentieel medicijn de functie van een eiwit of signalerings molecuul dat ontwikkelend significant is, kan verstoren. De organen van de zebravis worden functioneel tussen 2-5 DPF15, en verbindingen die giftig zijn tijdens deze gevoelige periode van embryonale ontwikkeling induceren fenotypische defecten in zebravis larven. Deze fenotypische veranderingen kunnen gemakkelijk worden gedetecteerd met behulp van een eenvoudige Microscoop zonder invasieve technieken11. Zebravis embryo's worden veel gebruikt in toxicologisch onderzoek vanwege hun veel grotere biologische complexiteit in vergelijking met in vitro geneesmiddelen screening met behulp van celkweek modellen16,17.  Als gewervelde is de genetische en fysiologische make-up van zebravis vergelijkbaar met de mens en daarom zijn de toxiciteiten van chemische verbindingen vergelijkbaar tussen zebravis en mensen8,18,19, 20 , 21 , 22. zebravis is dus een waardevol hulpmiddel in de vroege fase van de geneesmiddelen ontdekking voor de beoordeling van de toxiciteit en de veiligheid van de chemische verbindingen.
In dit artikel geven we een gedetailleerde beschrijving van de methode die wordt gebruikt voor het evalueren van de veiligheid en de toxiciteit van koolzuuranhydrase (CA) remmer-verbindingen met behulp van 1-5-Day Post fertilisatie (DPF) zebravis-embryo's door een enkele onderzoeker. Het protocol omvat het blootstellen van zebravis embryo's aan verschillende concentraties van chemische remmer verbindingen en het bestuderen van de sterfte en fenotypische veranderingen tijdens de embryonale ontwikkeling. Aan het einde van de blootstelling aan de chemische verbindingen wordt de LC50 dosis van de chemische stof bepaald. De methode stelt een individu in staat om efficiënte screening van 1-5 test verbindingen uit te voeren en duurt ongeveer 8-10 uur, afhankelijk van de ervaring van de persoon met de methode (Figuur 1). Elk van de stappen die nodig zijn om de toxiciteit van de verbindingen te beoordelen, wordt beschreven in Figuur 2. De beoordeling van de toxiciteit van CA-remmers vereist 8 dagen, en omvat het instellen van parings paren (dag 1); inzameling van embryo's uit kweek tanks, reiniging en overbrenging naar een broedplaats van 28,5 °C (dag 2); verdeling van de embryo's in de putjes van een 24-putplaat en toevoeging van verdunde CA-remmer verbindingen (dag 3); Fenotypische analyse en beeldvorming van larven (dag 4-8), en bepaling van LC50 dosis (day8).  Deze methode is snel en efficiënt, vereist een kleine hoeveelheid van de chemische verbinding en alleen basisvoorzieningen van het laboratorium.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:972px;" width="972">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:342px;">24-well plates</td>
			<td style="width:185px;">Nunc</td>
			<td style="width:260px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:185px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:342px;">Balance (Weighing scale)</td>
			<td style="width:185px;">KERN</td>
			<td style="width:260px;">PLJ3000-2CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:342px;">Balance (Weighing scale)</td>
			<td style="width:185px;">Mettler Toledo</td>
			<td style="width:260px;">AB104-S/PH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:342px;">CaCl2</td>
			<td style="width:185px;">JT.Baker</td>
			<td style="width:260px;">RS421910024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:342px;">Disecting Probe</td>
			<td style="width:185px;">Thermo Scientific</td>
			<td>17-467-604&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:342px;">DMSO</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich, Germany</td>
			<td style="width:260px;">D4540</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:342px;">Falcon tubes 15 mL</td>
			<td style="width:185px;">Greiner bio-one</td>
			<td style="width:260px;">188271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:342px;">High molecular weight methylcellulose</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich, Germany</td>
			<td style="width:260px;">M0262&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:342px;">Incubator for zebrafish larvae</td>
			<td style="width:185px;">Termaks</td>
			<td style="width:260px;">B8000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:342px;">KCL</td>
			<td style="width:185px;">Merck</td>
			<td style="width:260px;">1.04936.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:342px;">Methyl Blue</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich, Germany</td>
			<td style="width:260px;">28983-56-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:342px;">MgSO4</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich, Germany</td>
			<td style="width:260px;">M7506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:342px;">Microcentrifuge tubes</td>
			<td style="width:185px;">Starlab</td>
			<td style="width:260px;">S1615-5500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:342px;">NaCl</td>
			<td style="width:185px;">VWR Chemicals</td>
			<td style="width:260px;">27810.295</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:342px;">Paraffin Histoplast IM</td>
			<td style="width:185px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:260px;">8331</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:342px;">Pasteur pipette&#160;</td>
			<td style="width:185px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:260px;">86.1171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:342px;">Petri dish</td>
			<td style="width:185px;">Thermo Scientific</td>
			<td>101R20&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:342px;">Petri plates</td>
			<td style="width:185px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:260px;">82.1473</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:342px;">Pipette (1 mL and 200 &#956;L)</td>
			<td style="width:185px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:260px;">4641230N, 4641210N&#160;&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:342px;">Plates 24-Well</td>
			<td style="width:185px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:260px;">142485</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:342px;">Steriomicroscope/Camera</td>
			<td style="width:185px;">Zeiss</td>
			<td style="width:260px;">Stemi 2000-C/Axiocam 105 color</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:342px;">Vials (1.5 mL)</td>
			<td style="width:185px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:260px;">11569914</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:342px;">Zebrafish AB strains</td>
			<td style="width:185px;">ZIRC&#160;</td>
			<td style="width:260px;">&#160; ZL1&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid evaluation of toxicity of chemical compounds using zebrafish embryos

De zebravis is een algemeen gebruikte modelorganisme voor de ziekte en fenotype-based drug Discovery. De zebravis genereert veel nakomelingen, heeft transparante embryo's en een snelle externe ontwikkeling. Zebravis embryo's kunnen daarom ook worden gebruikt voor de snelle evaluatie van de toxiciteit van de geneesmiddelen die kostbaar zijn en in kleine hoeveelheden beschikbaar zijn. In dit artikel wordt een methode beschreven voor het efficiënt screenen van de toxiciteit van chemische verbindingen met 1-5-Day Post fertilisatie embryo's. De embryo's worden gecontroleerd door stereomicroscoop om de fenotypische defecten te onderzoeken die worden veroorzaakt door de blootstelling aan verschillende concentraties van verbindingen. Half-maximale dodelijke concentraties (LC50) van de verbindingen worden ook bepaald. De huidige studie vereiste 3-6 mg van een verbinding van de remmer, en het hele experiment duurt ongeveer 8-10 h worden voltooid door een individu in een laboratorium met basisvoorzieningen. Het huidige protocol is geschikt voor het testen van een verbinding om onverdraaglijke toxische of off-target effecten van de compound in de vroege fase van de opsporing van geneesmiddelen te identificeren en om subtiele toxische effecten te detecteren die kunnen worden gemist in de celkweek of andere diermodellen. De methode vermindert de procedurele vertragingen en de kosten van de ontwikkeling van geneesmiddelen.

Het kritische deel van de evaluatie van toxiciteit is het testen van verschillende concentraties van één of meerdere chemische verbindingen in één experiment. In het begin, selecteer de verbindingen voor de beoordeling van de toxiciteit, het aantal concentraties om te testen voor elke compound, en dienovereenkomstig, maak een grafiek (Figuur 3). We gebruikten een unieke kleur voor elke compound om de monsters te ordenen (Figuur 3</str...

Watch this Scientific Journal Video about Rapid Evaluation of Toxicity of Chemical Compounds Using Zebrafish Embryos at JoVE.com

Rapid Evaluation of Toxicity of Chemical Compounds Using Zebrafish Embryos

Zebravis embryo's worden gebruikt voor het evalueren van de toxiciteit van chemische verbindingen. Ze ontwikkelen zich extern en zijn gevoelig voor chemicaliën, waardoor subtiele fenotypische veranderingen kunnen worden opgespoord. Het experiment vereist slechts een kleine hoeveelheid stof, die direct wordt toegevoegd aan de plaat die embryo's bevat, waardoor het testsysteem efficiënt en kosteneffectief is.

Snelle evaluatie van de toxiciteit van chemische verbindingen met behulp van zebravis embryo's

The zebrafish is a widely used vertebrate model organism for the disease and phenotype-based drug discovery. The zebrafish generates many offspring, has ...

De toxiciteit testen procedures zullen worden aangetoond door Dr.Ashok Aspatwar, een senior onderzoeker van mijn laboratorium. Ons protocol identificeert off-target effecten en detecteert subtiele toxische effecten van chemische stoffen in de vroege fase van ontdekking die kunnen worden gemist in celkweek of andere diermodellen. De belangrijkste voordelen van onze techniek zijn: het is snel en efficiënt, vereist een zeer kleine hoeveelheid chemische, en de basisfaciliteiten in het laboratorium.Toxiciteitsscreening zal ons helpen bij het bepalen van de concentratie voor het bestuderen van de efficiëntie ervan tegen mycobacterium dat tuberculose veroorzaakt en voor verdere preklinische berekening. Deze methode maakt gebruik van inzichten in off-target effecten van chemische stoffen, en dus deze methode kan worden gebruikt in elk gebied van onderzoek waar de toxiciteit van chemische is van primair belang. Deze methode is zeer eenvoudig en kan worden uitgevoerd door iedereen zonder voorafgaande ervaring.Personen zonder ervaring moeten het experiment zorgvuldig plannen en slechts één verbinding gebruiken. Deze methode biedt toxische effecten van de chemische stoffen in de vorm van fenotypische veranderingen in de zich ontwikkelende zebravisembryo's en dus de veiligheid van de geteste verbindingen. Om te beginnen, plaats twee tot vijf volwassen mannelijke zebravissen en drie tot vijf volwassen vrouwelijke zebravissen in paren tanks 's nachts.In de ochtend, zet het licht als fokken wordt veroorzaakt door de automatische donkere en daaropvolgende lichtcyclus. Om stress voor de dieren te voorkomen, moet u de dieren twee weken laten rusten voordat ze dezelfde personen gebruiken om te fokken. De volgende dag voor de middag, verzamel de embryo's met behulp van een fijne mesh zeef, en breng ze op een petrischaaltje met E3 embryo medium.Plaats de petrischaal onder een stereomicroscoop om elke partij embryo's te onderzoeken. Identificeer het ondoorzichtige uiterlijk en verwijder ze als onbevruchte of dode embryo's. Houd de embryo's 's nachts op 28,5 graden Celsius in een couveuse.De volgende ochtend, onderzoek de embryo's onder een stereo microscoop en verwijder alle ongezonde of dode embryo's. Gebruik voorzichtig een pasteur pipet om een embryo over te brengen in elke put van een 24 put plaat. Zorg ervoor dat elke put bevat genoeg E3 medium om de embryo's te dekken.Haal de flesjes met remmerverbindingen opgeslagen bij 4 graden Celsius in een koelkast. Gebruik een analytische balans om de juiste hoeveelheid van de verbinding te wegen en bereid 250 microliter van 100 millimolar voorraadoplossing voor elke verbinding in E3-medium of een ander geschikt oplosmiddel. Gebruik vervolgens E3-medium om seriële verdunningen van de voorraadoplossingen te maken op basis van toxiciteitsniveaus in 15 milliliter centrifugebuizen.Gebruik uit de putten die elk één DPF-embryo bevatten, een pasteurpipet en 1 milliliter pipet om het E3-water één rij tegelijk te verwijderen. Verdeel onmiddellijk 1 milliliter van elk verdunningsvermogen van de voorraadoplossingen in de putten van de 24 putplaat die van lagere en het bewegen aan hogere concentratie begint. Voeg voor de controlegroepen E3-water of een ander relevant oplosmiddel toe.Label 24 goed platen met de naam en concentratie van de verbinding en houd de platen op 28,5 graden Celsius in een couveuse. Zorg ervoor dat de verdunningsmiddelen van de chemicaliën in de putten niet verdampt in de couveuse door het afdichten van de zijkanten van 24 put plaat. Vierentwintig uur na blootstelling van de chemische verbindingen, gebruik een pasteur pipet om de larven blootgesteld aan elke concentratie van de verbinding in een kleine petrischaal met 3% hoog moleculair gewicht methyhylcellulose over te brengen.Leg het met een metalen sonde zijwaarts. Plaats de petrischaal onder een stereomicroscoop die aan een camera is bevestigd. Neem de afbeeldingen en sla de afbeeldingen elke dag op in een aparte map tot het einde van het experiment.Voer elke dag alle waarnemingen in een tabel in in een online tabel of op een gedrukt blad. Voor neurotoxische blootstelling aan verbindingen kunnen de vier tot vijf DPF-larven een abnormaal zwempatroon vertonen. Maak in dat geval een record van dergelijke veranderingen door een korte video van 30 seconden tot één minuut van de larven vast te leggen.Let na vijf dagen blootstelling aan de chemische verbindingen op de concentratie waarbij de helft van de embryo's sterft als de half maximale dodelijke concentratie 50 van elke chemische stof. Maak een curve voor de mortaliteit van embryo's voor alle concentraties met behulp van een geschikt programma. In dit protocol is het cruciale deel van de evaluatie van toxiciteit het testen van verschillende concentraties van een of meerdere chemische verbindingen in één experiment.Voor de verbindingen die fenotypische defecten in de larven veroorzaken, werden de defecten elke 24 uur geregistreerd gedurende de periode van één tot vijf dagen na blootstelling aan de chemische stof. De embryo's behandeld met bèta-CA-remmers bij de concentraties van 250 micromolar en 125 micromolar vertonen verschillende fenotypische defecten in vergelijking met de controle. Bijvoorbeeld, unhatched embryo's zelfs op dag 3, gebogen lichaamsstructuur, ongebruikte dooierzak en hart-iemetaal oedeem, en afwezigheid van otolietzakjes in de larven op vijf dagen na de behandeling.In een andere studie toonden de embryo's die met CA-remmers werden behandeld de afwezigheid van otolietzakjes en zwemblaas. De experimenten identificeerden een representatieve samenstelling carbonische anhydrase 9, die minimale of geen fenotypische veranderingen tijdens de embryonale ontwikkeling bij 500 micromolar veroorzaakte. De verbinding vertoonde een hoge LC50-concentratie.Echter, in een vergelijking met een controle, dezelfde verbinding op 300 micromolar bleek te zijn neurotoxisch en geïnduceerde ataxie in de larven na vijf dagen van blootstelling. Een goede kwaliteit van embryo's is belangrijk voor toxiciteitsscreening van chemische stoffen. Voor het verkrijgen van embryo's van goede kwaliteit, gebruik jonge paar volwassen zebravissen voor de fokkerij.De verbindingen die als veilig naar voren komen, kunnen verder worden gekenmerkt door het uitvoeren van relevante in vitro en in vivo experimenten. Op het gebied van de ontwikkeling van antituberculosegeneelingen hielp deze techniek bij het opzetten van verdere experimenten voor in vivo remming van mycobacterium marinum in zebravisembryo's. Het protocol omvat het gebruik van chemische stoffen die giftig kunnen zijn voor de mens.Personen die betrokken zijn bij de experimenten moeten de juiste zorg bij de behandeling van de chemische stoffen.

Research

JoVE Journal

Medicine

Evaluation of Nanoparticle Uptake in Tumors in Real Time Using Intravital Imaging

Evaluatie van de Nanodeeltje Opname in Tumoren in real time via intravitale Imaging

Current technologies for tumor imaging, such as ultrasound, MRI, PET and CT, are unable to yield high-resolution images for the assessment of nanoparticle ...

Accurate and Simple Evaluation of Vascular Anastomoses in Monochorionic Placenta using Colored Dye

Nauwkeurige en eenvoudige evaluatie van de Vasculaire Anastomosen in monochoriale placenta met behulp van kleurstof

The presence of placental vascular anastomoses is a conditio sine qua non for the development of twin-to-twin transfusion syndrome (TTTS) and twin anemia ...

Induction of Myocardial Infarction in Adult Zebrafish Using Cryoinjury

Inductie van myocardinfarct bij Adult Zebravissen Met behulp van Cryoinjury

The mammalian heart is incapable of significant regeneration following an acute injury such as myocardial infarction1. By contrast, urodele amphibians and ...

The &alpha;-test: Rapid Cell-free CD4 Enumeration Using Whole Saliva

The ÃƒÅ½Ã‚Â±-test: Rapid Cell-free CD4 Enumeration Using Whole Saliva

De α-test: Rapid Celvrije CD4 Enumeration met hele Speeksel

There is an urgent need for affordable CD4 enumeration to monitor HIV disease. CD4 enumeration is out of reach in resource-limited regions due to the time ...

Screening for Melanoma Modifiers using a Zebrafish Autochthonous Tumor Model

Screening op Melanoom Modifiers het gebruik van een zebravis Autochtone tumormodel

Genomic studies of  human cancers have yielded a wealth of information about genes that are altered  in tumors1,2,3. A challenge arising from these ...

Chemotherapy-induced Vascular Toxicity - Real-time In vivo Imaging of Vessel Impairment

Chemotherapy-induced Vascular Toxicity - Real-time In vivo Imaging of Vessel Impairment

Chemotherapie-geïnduceerde vaattoxiciteit - Real-time<em&gt; In vivo</em&gt; Beeldvorming van Vessel Impairment

Certain classes of chemotherapies may exert acute vascular changes that may progress into long-term conditions that may predispose the patient to an ...

Quantification of the Immunosuppressant Tacrolimus on Dried Blood Spots Using LC-MS/MS

Kwantificering van de Immunosuppressieve tacrolimus op opgedroogd bloed Spots Met behulp van LC-MS / MS

The calcineurin inhibitor tacrolimus is the cornerstone of most immunosuppressive treatment protocols after solid organ transplantation in the United ...

Diffuse Optical Spectroscopy for the Quantitative Assessment of Acute Ionizing Radiation Induced Skin Toxicity Using a Mouse Model

Diffuse optische spectroscopie voor de kwantitatieve beoordeling van Acute ioniserende straling veroorzaakte Huidtoxiciteit Met behulp van een muismodel

Acute skin toxicities from ionizing radiation (IR) are a common side effect from therapeutic courses of external beam radiation therapy (RT) and ...

Solubility of Hydrophobic Compounds in Aqueous Solution Using Combinations of Self-assembling Peptide and Amino Acid

Oplosbaarheid van hydrofobe bestanddelen in waterige oplossing met behulp van combinaties van het zelf monteren van Peptide en aminozuur

Self-assembling peptides (SAPs) are promising vehicles for the delivery of hydrophobic therapeutics for clinical applications; their amphipathic ...

Evaluation of Cerebral Blood Flow Autoregulation in the Rat Using Laser Doppler Flowmetry

Evaluatie van cerebrale bloedstroom autoregulatie in de rat met behulp van laser doppler flowmetrie

When investigating the body&#39;s mechanisms for regulating cerebral blood flow, a relative measurement of microcirculatory blood flow can be obtained ...