Name: rapid evaluation of toxicity of chemical compounds using zebrafish embryos
Uploaded: 2019-08-25T14:00:00
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Le travail a été soutenu par des subventions de la Fondation Sigrid Juselius (SP, MP), de la Fondation culturelle finlandaise (AA, MH), de l'Académie de Finlande (SP, MP), de la Fondation Orion Farmos (MH), de la Tampere Tuberculosis Foundation (SP, MH et MP) et de la Fondation Jane et Aatos Erkko (SP et MP). ). Nous remercions nos collaborateurs italiens et Français, le professeur Supuran et le professeur Winum, d'avoir fourni des inhibiteurs de l'anhydrase carbonique pour l'évaluation de l'innocuité et de la toxicité à des fins de développement de médicaments antituberculeux et anticancéreux. Nous remercions Aulikki Lehmus et Marianne Kuuslahti pour l'assistance technique. Nous remercions également Leena M'kinen et Hannaleena Piippo pour leur aide dans l'élevage et la collecte d'embryons de poissons zèbres. Nous remercions sincèrement Harlan Barker pour l'évaluation critique du manuscrit et les commentaires perspicaces.

L'installation centrale de poisson zèbre de l'Université de Tampere dispose d'une autorisation d'établissement accordée par le National Animal Experiment Board (ESAVI/7975/04.05/2016). Toutes les expériences utilisant des embryons de poissons zèbres ont été réalisées selon le gouvernement provincial de finlande orientale, le Département social et de la santé du protocole de l'Unité des services régionaux de Tampere - LSLH-2007-7254/Ym-23.
1. Mise en place de réservoirs d'accouplem...

<ol>
	<li>Amaouche, N., Casaert Salome, H., Collignon, O., Santos, M. R., Ziogas, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Marketing+authorization+applications+submitted+to+the+European+Medicines+Agency+by+small+and+medium-sized+enterprises:+an+analysis+of+major+objections+and+their+impact+on+outcomes.">Marketing authorization applications submitted to the European Medicines Agency by small and medium-sized enterprises: an analysis of major objections and their impact on outcomes.</a> Drug Discovery Today. 23 (10), 1801-1805 (2018).</li><li>Garg, R. C., Bracken, W. M., Hoberman, A. M., Gupta, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reproductive+and+developmental+safety+evaluation+of+new+pharmaceutical+compounds.">Reproductive and developmental safety evaluation of new pharmaceutical compounds.</a> Reproductive and Developmental Toxicology. , 89-109 (2011).</li><li>Lee, H. Y., Inselman, A. L., Kanungo, J., Hansen, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+models+in+developmental+toxicology.">Alternative models in developmental toxicology.</a> Systems Biology in Reproductive Medicine. 58 (1), 10-22 (2012).</li><li>Gao, G., Chen, L., Huang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-cancer+drug+discovery:+update+and+comparisons+in+yeast,+Drosophila,+and+zebrafish.">Anti-cancer drug discovery: update and comparisons in yeast, Drosophila, and zebrafish.</a> Current Molecular Pharmacology. 7 (1), 44-51 (2014).</li><li>Brown, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+of+test+chemicals+for+the+ECVAM+international+validation+study+on+in+vitro+embryotoxicity+tests.+European+Centre+for+the+Validation+of+Alternative+Methods.">Selection of test chemicals for the ECVAM international validation study on in vitro embryotoxicity tests. European Centre for the Validation of Alternative Methods.</a> Alternatives to Laboratory Animals. 30 (2), 177-198 (2002).</li><li>Selderslaghs, I. W., Van Rompay, A. R., De Coen, W., Witters, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+screening+assay+to+identify+teratogenic+and+embryotoxic+chemicals+using+the+zebrafish+embryo.">Development of a screening assay to identify teratogenic and embryotoxic chemicals using the zebrafish embryo.</a> Reproductive Toxicology. 28 (3), 308-320 (2009).</li><li>Brannen, K. C., Panzica-Kelly, J. M., Danberry, T. L., Augustine-Rauch, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+zebrafish+embryo+teratogenicity+assay+and+quantitative+prediction+model.">Development of a zebrafish embryo teratogenicity assay and quantitative prediction model.</a> Birth Defects Research Part B Developmental and Reproductive Toxicology. 89 (1), 66-77 (2010).</li><li>Hermsen, S. A., van den Brandhof, E. J., van der Ven, L. T., Piersma, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relative+embryotoxicity+of+two+classes+of+chemicals+in+a+modified+zebrafish+embryotoxicity+test+and+comparison+with+their+in+vivo+potencies.">Relative embryotoxicity of two classes of chemicals in a modified zebrafish embryotoxicity test and comparison with their in vivo potencies.</a> Toxicology in Vitro. 25 (3), 745-753 (2011).</li><li>Lessman, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+developing+zebrafish+(Danio+rerio):+a+vertebrate+model+for+high-throughput+screening+of+chemical+libraries.">The developing zebrafish (Danio rerio): a vertebrate model for high-throughput screening of chemical libraries.</a> Birth Defects Research. Part C, Embryo Today: Reviews. 93 (3), 268-280 (2011).</li><li>Lantz-McPeak, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+toxicity+assay+using+high+content+screening+of+zebrafish+embryos.">Developmental toxicity assay using high content screening of zebrafish embryos.</a> Journal of Applied Toxicology. 35 (3), 261-272 (2015).</li><li>Truong, L., Harper, S. L., Tanguay, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+embryotoxicity+using+the+zebrafish+model.">Evaluation of embryotoxicity using the zebrafish model.</a> Methods in Molecular Biology. 691, 271-279 (2011).</li><li>Rodrigues, G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design,+synthesis,+and+evaluation+of+hydroxamic+acid+derivatives+as+promising+agents+for+the+management+of+Chagas+disease.">Design, synthesis, and evaluation of hydroxamic acid derivatives as promising agents for the management of Chagas disease.</a> Journal of Medicinal Chemistry. 57 (2), 298-308 (2014).</li><li>Kanungo, J., Cuevas, E., Ali, S. F., Paule, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+model+in+drug+safety+assessment.">Zebrafish model in drug safety assessment.</a> Current Pharmaceutical Design. 20 (34), 5416-5429 (2014).</li><li>Peterson, R. T., Link, B. A., Dowling, J. E., Schreiber, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+molecule+developmental+screens+reveal+the+logic+and+timing+of+vertebrate+development.">Small molecule developmental screens reveal the logic and timing of vertebrate development.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (24), 12965-12969 (2000).</li><li>Stainier, D. Y., Fishman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+as+a+model+system+to+study+cardiovascular+development.">The zebrafish as a model system to study cardiovascular development.</a> Trends in Cardiovascular Medicine. 4 (5), 207-212 (1994).</li><li>Aspatwar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitroimidazole-based+inhibitors+DTP338+and+DTP348+are+safe+for+zebrafish+embryos+and+efficiently+inhibit+the+activity+of+human+CA+IX+in+Xenopus+oocytes.">Nitroimidazole-based inhibitors DTP338 and DTP348 are safe for zebrafish embryos and efficiently inhibit the activity of human CA IX in Xenopus oocytes.</a> Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry. 33 (1), 1064-1073 (2018).</li><li>Rami, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia-targeting+carbonic+anhydrase+IX+inhibitors+by+a+new+series+of+nitroimidazole-sulfonamides/sulfamides/sulfamates.">Hypoxia-targeting carbonic anhydrase IX inhibitors by a new series of nitroimidazole-sulfonamides/sulfamides/sulfamates.</a> Journal of Medicinal Chemistry. 56 (21), 8512-8520 (2013).</li><li>Spitsbergen, J. M., Kent, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+state+of+the+art+of+the+zebrafish+model+for+toxicology+and+toxicologic+pathology+research--advantages+and+current+limitations.">The state of the art of the zebrafish model for toxicology and toxicologic pathology research--advantages and current limitations.</a> Toxicologic Pathology. , 62-87 (2003).</li><li>Teraoka, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+cytochrome+P450+1A+is+required+for+circulation+failure+and+edema+by+2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin+in+zebrafish.">Induction of cytochrome P450 1A is required for circulation failure and edema by 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin in zebrafish.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 304 (2), 223-228 (2003).</li><li>Zon, L. I., Peterson, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+drug+discovery+in+the+zebrafish.">In vivo drug discovery in the zebrafish.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 4 (1), 35-44 (2005).</li><li>Hill, A. J., Teraoka, H., Heideman, W., Peterson, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+as+a+model+vertebrate+for+investigating+chemical+toxicity.">Zebrafish as a model vertebrate for investigating chemical toxicity.</a> Toxicological Sciences. 86 (1), 6-19 (2005).</li><li>Kari, G., Rodeck, U., Dicker, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish:+an+emerging+model+system+for+human+disease+and+drug+discovery.">Zebrafish: an emerging model system for human disease and drug discovery.</a> Clinical Pharmacology and Therapeutics. 82 (1), 70-80 (2007).</li><li>Gourmelon, A., Delrue, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+in+Support+of+Internationally+Harmonised+OECD+Test+Guidelines+for+Assessing+the+Safety+of+Chemicals.">Validation in Support of Internationally Harmonised OECD Test Guidelines for Assessing the Safety of Chemicals.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 856, 9-32 (2016).</li><li>Aspatwar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=beta-CA-specific+inhibitor+dithiocarbamate+Fc14-584B:+a+novel+antimycobacterial+agent+with+potential+to+treat+drug-resistant+tuberculosis.">beta-CA-specific inhibitor dithiocarbamate Fc14-584B: a novel antimycobacterial agent with potential to treat drug-resistant tuberculosis.</a> Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry. 32 (1), 832-840 (2017).</li><li>Kazokaite, J., Aspatwar, A., Kairys, V., Parkkila, S., Matulis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorinated+benzenesulfonamide+anticancer+inhibitors+of+carbonic+anhydrase+IX+exhibit+lower+toxic+effects+on+zebrafish+embryonic+development+than+ethoxzolamide.">Fluorinated benzenesulfonamide anticancer inhibitors of carbonic anhydrase IX exhibit lower toxic effects on zebrafish embryonic development than ethoxzolamide.</a> Drug and Chemical Toxicology. 40 (3), 309-319 (2017).</li><li>Howe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+reference+genome+sequence+and+its+relationship+to+the+human+genome.">The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome.</a> Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).</li><li>Granato, M., Nusslein-Volhard, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fishing+for+genes+controlling+development.">Fishing for genes controlling development.</a> Current Opinion in Genetics &amp; Development. 6 (4), 461-468 (1996).</li><li>Bambino, K., Chu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+in+Toxicology+and+Environmental+Health.">Zebrafish in Toxicology and Environmental Health.</a> Current Topics in Developmental Biology. 124, 331-367 (2017).</li><li>Goldsmith, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+as+a+pharmacological+tool:+the+how,+why+and+when.">Zebrafish as a pharmacological tool: the how, why and when.</a> Current Opinion in Pharmacology. 4 (5), 504-512 (2004).</li></ol>

Le test de toxicité in vitro à l'aide de cellules cultivées peut détecter la survie et les études morphologiques des cellules fournissant des informations limitées sur la toxicité induite par le composé d'essai. L'avantage du criblage de toxicité des composés chimiques utilisant des embryons de poisson zèbre est la détection rapide des changements phénotypiques induits chimiquement dans un animal entier pendant le développement embryonnaire dans un organisme modèle pertinent. Environ 70 % des gèn...

Le développement de médicaments est un processus coûteux. Avant qu'un seul composé chimique ne soit approuvé par la Food and Drug Administration (FDA) et l'Agence européenne des médicaments (EMA), plusieurs milliers de composés sont examinés à un coût de plus d'un milliard de dollars1. Pendant le développement préclinique, la plus grande partie de ce coût est nécessaire pour l'expérimentation animale2. Pour limiter les coûts, les chercheurs dans le domaine du développement de médicaments ont besoin de modèles alternatifs pour le dépistage de l'innocuité des composés chimiques3. Par conséquent, dans la phase initiale du développement du médicament, il serait très bénéfique d'utiliser une méthode qui peut rapidement évaluer l'innocuité et la toxicité des composés dans un modèle approprié. Il existe plusieurs protocoles qui ont été utilisés pour le dépistage de la toxicité des composés chimiques impliquant des modèles de culture animale et cellulaire, mais il n'y a pas un seul protocole qui est validé et est en usage courant4,5. Les protocoles existants utilisant le poisson zèbre varient en longueur et ont été utilisés par des chercheurs individuels qui ont évalué la toxicité selon leur exigence de commodité6,7,8,9, 10 Ans et plus , 11 Ans, états-unis ( , 12.
Dans un passé récent, le poisson zèbre est apparu comme un modèle pratique pour l'évaluation de la toxicité des composés chimiques au cours du développement embryonnaire6,7. Le poisson zèbre a de nombreux avantages intégrés pour l'évaluation des composés chimiques13. Même les expériences à grande échelle sont favorables, car une femelle poisson zèbre peut pondre des lots de 200-300 œufs, qui se développent rapidement ex vivo, n'ont pas besoin d'alimentation externe pour un pas jusqu'à une semaine et sont transparents. Les composés peuvent être ajoutés directement dans l'eau, où ils peuvent (selon la nature du composé) diffuser à travers le chorion, et après l'éclosion, à travers la peau, les branchies et la bouche des larves. Les expériences ne nécessitent pas de quantités abondantes de composés chimiques14 en raison de la petite taille de l'embryon. Le développement d'embryons de poisson zèbre exprime la plupart des protéines nécessaires pour atteindre les résultats normaux du développement. Par conséquent, un embryon de poisson zèbre est un modèle sensible pour évaluer si un médicament potentiel peut perturber la fonction d'une protéine ou d'une molécule de signalisation qui est significative sur le plan du développement. Les organes du poisson zèbre deviennent fonctionnels entre 2-5 dpf15, et les composés qui sont toxiques pendant cette période sensible de développement embryonnaire induisent des défauts phénotypiques chez les larves de poissons zèbres. Ces changements phénotypiques peuvent être facilement détectés à l'aide d'un simple microscope sans techniques invasives11. Les embryons de poissons zèbres sont largement utilisés dans la recherche toxicologique en raison de leur complexité biologique beaucoup plus grande par rapport au dépistage in vitro des médicaments à l'aide de modèles de culture cellulaire16,17.  En tant que vertébré, la composition génétique et physiologique du poisson zèbre est comparable à l'homme et donc les toxicités des composés chimiques sont similaires entre le poisson zèbre et l'homme8,18,19, 20 Ans, états-unis , 21 Ans, états-unis , 22. Le poisson zèbre est donc un outil précieux dans la phase initiale de la découverte de médicaments pour l'évaluation de la toxicité et de la sécurité des composés chimiques.
Dans le présent article, nous fournissons une description détaillée de la méthode utilisée pour évaluer l'innocuité et la toxicité des composés inhibiteurs de l'anhydrase carbonique (CA) à l'aide d'embryons de poisson zèbre post-fertilisation (dpf) de 1 à 5 jours par un seul chercheur. Le protocole consiste à exposer les embryons de poissons zèbres à différentes concentrations de composés inhibiteurs chimiques et à étudier la mortalité et les changements phénotypiques au cours du développement embryonnaire. À la fin de l'exposition aux composés chimiques, la dose lc50 du produit chimique est déterminée. La méthode permet à une personne d'effectuer un dépistage efficace de 1-5 composés d'essai et prend environ 8-10 h en fonction de l'expérience de la personne avec la méthode (Figure 1). Chacune des étapes requises pour évaluer la toxicité des composés est décrite à la figure 2. L'évaluation de la toxicité des inhibiteurs de l'AC nécessite 8 jours, et comprend la mise en place de paires d'accouplement (jour 1); la collecte des embryons dans les réservoirs de reproduction, leur nettoyage et leur transfert dans un incubateur de 28,5 oC (jour 2); la distribution des embryons dans les puits d'une plaque de 24 puits et l'ajout de composés inhibiteurs dilués de l'AC (jour 3); l'analyse phénotypique et l'imagerie des larves (jour 4-8), et la détermination de la dose de LC50 (jour8).  Cette méthode est rapide et efficace, nécessite une petite quantité du composé chimique et seulement des installations de base du laboratoire.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:972px;" width="972">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:342px;">24-well plates</td>
			<td style="width:185px;">Nunc</td>
			<td style="width:260px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:185px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:342px;">Balance (Weighing scale)</td>
			<td style="width:185px;">KERN</td>
			<td style="width:260px;">PLJ3000-2CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:342px;">Balance (Weighing scale)</td>
			<td style="width:185px;">Mettler Toledo</td>
			<td style="width:260px;">AB104-S/PH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:342px;">CaCl2</td>
			<td style="width:185px;">JT.Baker</td>
			<td style="width:260px;">RS421910024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:342px;">Disecting Probe</td>
			<td style="width:185px;">Thermo Scientific</td>
			<td>17-467-604&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:342px;">DMSO</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich, Germany</td>
			<td style="width:260px;">D4540</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:342px;">Falcon tubes 15 mL</td>
			<td style="width:185px;">Greiner bio-one</td>
			<td style="width:260px;">188271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:342px;">High molecular weight methylcellulose</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich, Germany</td>
			<td style="width:260px;">M0262&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:342px;">Incubator for zebrafish larvae</td>
			<td style="width:185px;">Termaks</td>
			<td style="width:260px;">B8000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:342px;">KCL</td>
			<td style="width:185px;">Merck</td>
			<td style="width:260px;">1.04936.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:342px;">Methyl Blue</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich, Germany</td>
			<td style="width:260px;">28983-56-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:342px;">MgSO4</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich, Germany</td>
			<td style="width:260px;">M7506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:342px;">Microcentrifuge tubes</td>
			<td style="width:185px;">Starlab</td>
			<td style="width:260px;">S1615-5500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:342px;">NaCl</td>
			<td style="width:185px;">VWR Chemicals</td>
			<td style="width:260px;">27810.295</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:342px;">Paraffin Histoplast IM</td>
			<td style="width:185px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:260px;">8331</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:342px;">Pasteur pipette&#160;</td>
			<td style="width:185px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:260px;">86.1171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:342px;">Petri dish</td>
			<td style="width:185px;">Thermo Scientific</td>
			<td>101R20&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:342px;">Petri plates</td>
			<td style="width:185px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:260px;">82.1473</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:342px;">Pipette (1 mL and 200 &#956;L)</td>
			<td style="width:185px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:260px;">4641230N, 4641210N&#160;&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:342px;">Plates 24-Well</td>
			<td style="width:185px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:260px;">142485</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:342px;">Steriomicroscope/Camera</td>
			<td style="width:185px;">Zeiss</td>
			<td style="width:260px;">Stemi 2000-C/Axiocam 105 color</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:342px;">Vials (1.5 mL)</td>
			<td style="width:185px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:260px;">11569914</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:342px;">Zebrafish AB strains</td>
			<td style="width:185px;">ZIRC&#160;</td>
			<td style="width:260px;">&#160; ZL1&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid evaluation of toxicity of chemical compounds using zebrafish embryos

Le poisson zèbre est un organisme modèle vertébré largement utilisé pour la découverte de médicaments à base de phénotypes. Le poisson zèbre génère de nombreuses descendantes, a des embryons transparents et un développement externe rapide. Les embryons de poissons zèbres peuvent donc également être utilisés pour l'évaluation rapide de la toxicité des médicaments qui sont précieux et disponibles en petites quantités. Dans le présent article, une méthode pour le criblage efficace de la toxicité des composés chimiques utilisant des embryons de 1-5 jours après la fertilisation est décrite. Les embryons sont surveillés par stéréomicroscope pour étudier les défauts phénotypiques causés par l'exposition à différentes concentrations de composés. Des concentrations létales semi-maximales (LC50) des composés sont également déterminées. La présente étude a exigé 3-6 mg d'un composé d'inhibiteur, et l'ensemble de l'expérience prend environ 8-10 h pour être accompli par un individu dans un laboratoire ayant des équipements de base. Le protocole actuel est approprié pour tester n'importe quel composé afin d'identifier les effets toxiques ou hors cible intolérables du composé dans la phase initiale de la découverte de médicaments et de détecter les effets toxiques subtils qui peuvent être manqués dans la culture cellulaire ou d'autres modèles animaux. La méthode réduit les retards procéduraux et les coûts de développement des médicaments.

La partie essentielle de l'évaluation de la toxicité consiste à tester différentes concentrations d'un ou plusieurs composés chimiques dans une seule expérience. Au début, sélectionnez les composés pour l'évaluation de la toxicité, le nombre de concentrations à tester pour chaque composé, et par conséquent, faire un tableau (Figure 3). Nous avons utilisé une couleur unique pour chaque composé pour organiser les échantillons (<strong class="xf...

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Rapid Evaluation of Toxicity of Chemical Compounds Using Zebrafish Embryos

Les embryons de poissons zèbres sont utilisés pour évaluer la toxicité des composés chimiques. Ils se développent à l'extérieur et sont sensibles aux produits chimiques, permettant la détection de changements phénotypiques subtils. L'expérience ne nécessite qu'une petite quantité de composé, qui est directement ajouté à la plaque contenant des embryons, ce qui rend le système de test efficace et rentable.

Évaluation rapide de la toxicité des composés chimiques à l'aide d'embryons de poisson zèbre

The zebrafish is a widely used vertebrate model organism for the disease and phenotype-based drug discovery. The zebrafish generates many offspring, has ...

Les procédures d’essai de toxicité seront démontrées par le Dr Ashok Aspatwar, chercheur principal de mon laboratoire. Notre protocole identifie les effets hors cible et détecte les effets toxiques subtils des produits chimiques dans la phase précoce de la découverte qui peuvent être manqués dans la culture cellulaire ou d’autres modèles animaux. Les principaux avantages de notre technique sont: il est rapide et efficace, nécessite très petite quantité de produits chimiques, et les installations de base dans le laboratoire.Le dépistage de la toxicité nous aidera à décider de la concentration pour étudier son efficacité contre la mycobactérie qui cause la tuberculose et pour d’autres calculs précliniques. Cette méthode utilise un aperçu des effets hors cible des produits chimiques, et donc cette méthode peut être utilisée dans n’importe quel domaine de recherche où la toxicité du produit chimique est d’une importance primordiale. Cette méthode est très simple et peut être effectuée par n’importe qui sans expérience préalable.Les personnes qui n’ont aucune expérience devraient planifier l’expérience avec soin et utiliser un seul composé. Cette méthode fournit des effets toxiques des produits chimiques sous la forme de changements phénotypiques dans les embryons de poisson zèbre en développement et donc la sécurité des composés testés. Pour commencer, placez deux à cinq poissons zèbres mâles adultes et trois à cinq poissons zèbres femelles adultes dans des réservoirs d’accouplement pendant la nuit.Le matin, allumez la lumière car la reproduction est induite par le cycle de lumière automatique sombre et subséquent. Pour éviter de manipuler le stress pour les animaux, laissez les animaux se reposer pendant deux semaines avant d’utiliser les mêmes individus pour la reproduction. Le lendemain avant midi, recueillir les embryons à l’aide d’une passoire à mailles fines, et les transférer sur une boîte de Pétri contenant e3 milieu embryonnaire.Placez la boîte de Pétri sous un microscope stéréo pour examiner chaque lot d’embryons. Identifiez l’apparence opaque et retirez-les comme embryons non fécondés ou morts. Gardez les embryons à 28,5 degrés Celsius dans un incubateur pendant la nuit.Le lendemain matin, examinez les embryons au microscope stéréo et enlevez les embryons malsains ou morts. Utilisez soigneusement une pipette pasteur pour transférer un embryon dans chaque puits d’une plaque de 24 puits. Assurez-vous que chaque puits contient suffisamment de milieu E3 pour couvrir les embryons.Sortez les flacons contenant des composés inhibiteurs conservés à 4 degrés Celsius dans un réfrigérateur. Utilisez un équilibre analytique pour peser la quantité appropriée du composé, et préparer 250 microlitres de solution de stock de 100 millimolaires pour chaque composé dans le milieu E3 ou un autre solvant approprié. Ensuite, utilisez le milieu E3 pour faire des dilutions en série des solutions de stock basées sur les niveaux de toxicité dans des tubes de centrifugeuse de 15 millilitres.Dans les puits qui contiennent chacun un embryon de DPF, utilisez une pipette pasteur et une pipette de 1 millilitre pour enlever l’eau E3 une rangée à la fois. Distribuez immédiatement 1 millilitre de chaque diluant des solutions de stock dans les puits de la plaque de 24 puits à partir de la baisse et en passant à une concentration plus élevée. Pour les groupes de contrôle, ajouter de l’eau E3 ou un autre solvant pertinent.Étiquetez 24 plaques de puits avec le nom et la concentration du composé et gardez les plaques à 28,5 degrés Celsius dans un incubateur. Faites en sorte que les diluants des produits chimiques dans les puits ne s’évaporent pas dans l’incubateur en scellant les côtés de 24 plaques de puits. Vingt-quatre heures après l’exposition des composés chimiques, utiliser une pipette pasteur pour transférer les larves exposées à chaque concentration du composé dans une petite boîte de Pétri contenant 3% de poids moléculaire élevé cellulose méthylique.À l’insurgie d’une sonde métallique, mentent-la latéralement. Placez la boîte de Pétri sous un microscope stéréo attaché à une caméra. Prenez les images et enregistrez les images dans un dossier séparé chaque jour jusqu’à la fin de l’expérience.Entrez toutes les observations dans une table chaque jour, que ce soit dans une table en ligne ou sur une feuille imprimée. Pour l’exposition aux composés neurotoxiques, les quatre à cinq larves de DPF peuvent présenter un modèle de nage anormal. Dans ce cas, faites un enregistrement de ces changements en capturant une courte vidéo de 30 secondes à une minute des larves.Après cinq jours d’exposition aux composés chimiques, notez la concentration à laquelle la moitié des embryons meurent comme la concentration létale à moitié maximale 50 de chaque produit chimique. Construire une courbe pour la mortalité des embryons pour toutes les concentrations à l’aide d’un programme approprié. Dans ce protocole, la partie critique de l’évaluation de la toxicité est de tester différentes concentrations d’un ou plusieurs composés chimiques dans une seule expérience.Pour les composés qui induisent des défauts phénotypiques chez les larves, les défauts ont été enregistrés toutes les 24 heures sur la période d’un à cinq jours après l’exposition au produit chimique. Les embryons traités avec des inhibiteurs bêta-CA aux concentrations de 250 micromolaires et 125 micromolaires présentent divers défauts phénotypiques par rapport au contrôle. Par exemple, les embryons non chichés même au jour 3, la structure incurvée du corps, le sac jaune non utilisé et l’oedème péricardique, et l’absence de sacs otolithes chez les larves à cinq jours après le traitement.Dans une autre étude, les embryons traités avec des inhibiteurs de CA ont montré l’absence des sacs d’otolithe et de la vessie natatoire. Les expériences ont identifié une anhydrase carbonique composée représentative 9, qui a induit des changements phénotypiques minimes ou nuls pendant le développement embryonnaire à 500 micromolaires. Le composé a montré une concentration élevée de LC50.Cependant, dans une comparaison avec un contrôle, le même composé à 300 micromolar s’est trouvé pour être neurotoxic et ataxie induite dans les larves après cinq jours d’exposition. La bonne qualité des embryons est importante pour le dépistage de la toxicité des produits chimiques. Pour obtenir des embryons de bonne qualité, utilisez la jeune paire de poisson zèbre adulte pour la reproduction.Les composés qui apparaissent comme sûrs peuvent être encore caractérisés en effectuant des expériences in vitro et in vivo pertinentes. Dans le domaine du développement de médicaments antituberculose, cette technique a permis de mettre en place d’autres expériences pour l’inhibition in vivo du mycobactérie marinum chez les embryons de poisson zèbre. Le protocole implique l’utilisation de produits chimiques qui peuvent être toxiques pour les humains.Les personnes impliquées dans les expériences doivent prendre soin de manipuler les produits chimiques.

Research

JoVE Journal

Medicine

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The mammalian heart is incapable of significant regeneration following an acute injury such as myocardial infarction1. By contrast, urodele amphibians and ...

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