Name: rapid evaluation of toxicity of chemical compounds using zebrafish embryos
Uploaded: 2019-08-25T14:00:00
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Il lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni della Sigrid Juselius Foundation (SP, MP), della Finnish Cultural Foundation (AA, MH), dell'Accademia della Finlandia (SP, MP), della Orion Farmos Foundation (MH), della Fondazione Tampere Tuberculosis (SP, MH e MP) e della Fondazione Jane e Aatos Erkko (SP e MP) ). Ringraziamo i nostri collaboratori italiani e francesi, il professor Supuran, e il professor Winum, per aver fornito inibitori all'andradica carbonica per la valutazione della sicurezza e della tossicità per scopi di sviluppo di farmaci anti-TB e anti-cancro. Ringraziamo Aulikki Lehmus e Marianne Kuuslahti per l'assistenza tecnica. Ringraziamo anche Leena Makinen e Hannaleena Piippo per il loro aiuto con l'allevamento dei pesci zebra e la raccolta degli embrioni. Ringraziamo sinceramente Harlan Barker per la valutazione critica del manoscritto e commenti approfonditi.

La struttura centrale del pesce zebra della Tampere University ha un'autorizzazione di stabilimento concessa dal National Animal Experiment Board (ESAVI/7975/04.10.05/2016). Tutti gli esperimenti che utilizzano embrioni di pesce zebra sono stati effettuati secondo il governo provinciale della Finlandia orientale, il Dipartimento sociale e sanitario del protocollo di unità di servizio regionale di Tampere - LSLH-2007-7254/Ym-23.
1. Impostazione dei serbatoi di accoppiamento per il pesce zebra du...

<ol>
	<li>Amaouche, N., Casaert Salome, H., Collignon, O., Santos, M. R., Ziogas, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Marketing+authorization+applications+submitted+to+the+European+Medicines+Agency+by+small+and+medium-sized+enterprises:+an+analysis+of+major+objections+and+their+impact+on+outcomes.">Marketing authorization applications submitted to the European Medicines Agency by small and medium-sized enterprises: an analysis of major objections and their impact on outcomes.</a> Drug Discovery Today. 23 (10), 1801-1805 (2018).</li><li>Garg, R. C., Bracken, W. M., Hoberman, A. M., Gupta, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reproductive+and+developmental+safety+evaluation+of+new+pharmaceutical+compounds.">Reproductive and developmental safety evaluation of new pharmaceutical compounds.</a> Reproductive and Developmental Toxicology. , 89-109 (2011).</li><li>Lee, H. Y., Inselman, A. L., Kanungo, J., Hansen, D. 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M., Kent, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+state+of+the+art+of+the+zebrafish+model+for+toxicology+and+toxicologic+pathology+research--advantages+and+current+limitations.">The state of the art of the zebrafish model for toxicology and toxicologic pathology research--advantages and current limitations.</a> Toxicologic Pathology. , 62-87 (2003).</li><li>Teraoka, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+cytochrome+P450+1A+is+required+for+circulation+failure+and+edema+by+2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin+in+zebrafish.">Induction of cytochrome P450 1A is required for circulation failure and edema by 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin in zebrafish.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 304 (2), 223-228 (2003).</li><li>Zon, L. I., Peterson, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+drug+discovery+in+the+zebrafish.">In vivo drug discovery in the zebrafish.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 4 (1), 35-44 (2005).</li><li>Hill, A. J., Teraoka, H., Heideman, W., Peterson, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+as+a+model+vertebrate+for+investigating+chemical+toxicity.">Zebrafish as a model vertebrate for investigating chemical toxicity.</a> Toxicological Sciences. 86 (1), 6-19 (2005).</li><li>Kari, G., Rodeck, U., Dicker, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish:+an+emerging+model+system+for+human+disease+and+drug+discovery.">Zebrafish: an emerging model system for human disease and drug discovery.</a> Clinical Pharmacology and Therapeutics. 82 (1), 70-80 (2007).</li><li>Gourmelon, A., Delrue, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+in+Support+of+Internationally+Harmonised+OECD+Test+Guidelines+for+Assessing+the+Safety+of+Chemicals.">Validation in Support of Internationally Harmonised OECD Test Guidelines for Assessing the Safety of Chemicals.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 856, 9-32 (2016).</li><li>Aspatwar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=beta-CA-specific+inhibitor+dithiocarbamate+Fc14-584B:+a+novel+antimycobacterial+agent+with+potential+to+treat+drug-resistant+tuberculosis.">beta-CA-specific inhibitor dithiocarbamate Fc14-584B: a novel antimycobacterial agent with potential to treat drug-resistant tuberculosis.</a> Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry. 32 (1), 832-840 (2017).</li><li>Kazokaite, J., Aspatwar, A., Kairys, V., Parkkila, S., Matulis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorinated+benzenesulfonamide+anticancer+inhibitors+of+carbonic+anhydrase+IX+exhibit+lower+toxic+effects+on+zebrafish+embryonic+development+than+ethoxzolamide.">Fluorinated benzenesulfonamide anticancer inhibitors of carbonic anhydrase IX exhibit lower toxic effects on zebrafish embryonic development than ethoxzolamide.</a> Drug and Chemical Toxicology. 40 (3), 309-319 (2017).</li><li>Howe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+reference+genome+sequence+and+its+relationship+to+the+human+genome.">The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome.</a> Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).</li><li>Granato, M., Nusslein-Volhard, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fishing+for+genes+controlling+development.">Fishing for genes controlling development.</a> Current Opinion in Genetics &amp; Development. 6 (4), 461-468 (1996).</li><li>Bambino, K., Chu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+in+Toxicology+and+Environmental+Health.">Zebrafish in Toxicology and Environmental Health.</a> Current Topics in Developmental Biology. 124, 331-367 (2017).</li><li>Goldsmith, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+as+a+pharmacological+tool:+the+how,+why+and+when.">Zebrafish as a pharmacological tool: the how, why and when.</a> Current Opinion in Pharmacology. 4 (5), 504-512 (2004).</li></ol>

Il test di tossicità in vitro con cellule coltivate è in grado di rilevare la sopravvivenza e gli studi morfologici delle cellule fornendo informazioni limitate sulla tossicità indotta dal composto di prova. Il vantaggio dello screening della tossicità dei composti chimici che utilizzano embrioni di pesce zebra è la rapida individuazione di cambiamenti fenotipici indotti chimicamente in un intero animale durante lo sviluppo embrionale in un organismo modello pertinente. Circa il 70% dei geni umani che codif...

Lo sviluppo di farmaci è un processo costoso. Prima che un singolo composto chimico è approvato dalla Food and Drug Administration (FDA) e L'Agenzia europea dei medicinali (EMA) diverse migliaia di composti sono sottoposti a un costo di oltre un miliardo di dollari1. Durante lo sviluppo preclinico, la maggior parte di questo costo è necessaria per la sperimentazione animale2. Per limitare i costi, i ricercatori nel campo dello sviluppo di farmaci hanno bisogno di modelli alternativi per lo screening di sicurezza dei composti chimici3. Pertanto, nella fase iniziale dello sviluppo del farmaco, sarebbe molto utile utilizzare un metodo in grado di valutare rapidamente la sicurezza e la tossicità dei composti in un modello adatto. Ci sono diversi protocolli che sono stati utilizzati per lo screening della tossicità di composti chimici che coinvolgono modelli di coltura animale e cellulare, ma non c'è un unico protocollo che viene convalidato ed è in uso comune4,5. I protocolli esistenti che utilizzano il pesce zebra variano in lunghezza e sono stati utilizzati da singoli ricercatori che hanno valutato la tossicità in base al loro requisito di convenienza6,7,8,9, 10 del sistema , 11 Del sistema di , 12.
Nel recente passato, il pesce zebra è emerso come un modello conveniente per la valutazione della tossicità dei composti chimici durante lo sviluppo embrionale6,7. Il pesce zebra ha molti vantaggi integrati per la valutazione dei composti chimici13. Anche gli esperimenti su larga scala sono suscettibili, in quanto una femmina di pesce zebra può deporre lotti di 200-300 uova, che si sviluppano rapidamente ex vivo, non hanno bisogno di alimentazione esterna fino a una settimana e sono trasparenti. I composti possono essere aggiunti direttamente nell'acqua, dove possono (a seconda della natura del composto) diffuso attraverso il chorion, e dopo la schiusa, attraverso la pelle, branchie e bocca delle larve. Gli esperimenti non richiedono abbondanti quantità di composti chimici14 a causa delle piccole dimensioni dell'embrione. Lo sviluppo di embrioni di pesce zebra esprimono la maggior parte delle proteine necessarie per ottenere il normale risultato dello sviluppo. Pertanto, un embrione di pesce zebra è un modello sensibile per valutare se un potenziale farmaco può disturbare la funzione di una proteina o di una molecola di segnalazione che è significativa dal punto di vista dello sviluppo. Gli organi del pesce zebra diventano funzionali tra 2-5 dpf15, e composti tossici durante questo periodo delicato di sviluppo embrionale inducono difetti fenotipici nelle larve di pesce zebra. Questi cambiamenti fenotipici possono essere facilmente rilevati utilizzando un semplice microscopio senza tecniche invasive11. Gli embrioni di pesce zebra sono ampiamente utilizzati nella ricerca tossicologica a causa della loro complessità biologica molto maggiore rispetto allo screening farmacologico in vitro utilizzando modelli di coltura cellulare16,17.  Come vertebrato, la composizione genetica e fisiologica del pesce zebra è paragonabile agli esseri umani e quindi le tossicità dei composti chimici sono simili tra il pesce zebra e gli esseri umani8,18,19, 20 anni , 21 Mieto , 22. Il pesce zebra è quindi uno strumento prezioso nella fase iniziale della scoperta di farmaci per la valutazione della tossicità e della sicurezza dei composti chimici.
Nel presente articolo, forniamo una descrizione dettagliata del metodo utilizzato per valutare la sicurezza e la tossicità dei composti inibitori dell'andrasi (CA) carbonico utilizzando embrioni di pesce zebra post-5 giorni (dpf) da un singolo ricercatore. Il protocollo prevede l'esposizione degli embrioni di pesce zebra a diverse concentrazioni di composti inibitori chimici e lo studio della mortalità e dei cambiamenti fenotipici durante lo sviluppo embrionale. Alla fine dell'esposizione ai composti chimici, viene determinata la dose LC50 della sostanza chimica. Il metodo consente a un individuo di effettuare uno screening efficiente di 1-5 composti di prova e richiede circa 8-10 h a seconda dell'esperienza della persona con il metodo (Figura 1). Ciascuno dei passaggi necessari per valutare la tossicità dei composti è descritto nella Figura 2. La valutazione della tossicità degli inibitori della CA richiede 8 giorni e include l'impostazione di coppie di accoppiamento (giorno 1); raccolta di embrioni da serbatoi di riproduzione, pulizia e trasferimento a 28,5 gradi centigradi (giorno 2); distribuzione degli embrioni nei pozzi di una piastra di 24 pozze e aggiunta di composti inibitori CA diluiti (giorno 3); l'analisi fenotipica e l'imaging delle larve (giorno 4-8) e la determinazione della dose di LC50 (giorno8).  Questo metodo è rapido ed efficiente, richiede una piccola quantità del composto chimico e solo strutture di base del laboratorio.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:972px;" width="972">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:342px;">24-well plates</td>
			<td style="width:185px;">Nunc</td>
			<td style="width:260px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:185px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:342px;">Balance (Weighing scale)</td>
			<td style="width:185px;">KERN</td>
			<td style="width:260px;">PLJ3000-2CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:342px;">Balance (Weighing scale)</td>
			<td style="width:185px;">Mettler Toledo</td>
			<td style="width:260px;">AB104-S/PH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:342px;">CaCl2</td>
			<td style="width:185px;">JT.Baker</td>
			<td style="width:260px;">RS421910024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:342px;">Disecting Probe</td>
			<td style="width:185px;">Thermo Scientific</td>
			<td>17-467-604&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:342px;">DMSO</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich, Germany</td>
			<td style="width:260px;">D4540</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:342px;">Falcon tubes 15 mL</td>
			<td style="width:185px;">Greiner bio-one</td>
			<td style="width:260px;">188271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:342px;">High molecular weight methylcellulose</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich, Germany</td>
			<td style="width:260px;">M0262&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:342px;">Incubator for zebrafish larvae</td>
			<td style="width:185px;">Termaks</td>
			<td style="width:260px;">B8000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:342px;">KCL</td>
			<td style="width:185px;">Merck</td>
			<td style="width:260px;">1.04936.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:342px;">Methyl Blue</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich, Germany</td>
			<td style="width:260px;">28983-56-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:342px;">MgSO4</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich, Germany</td>
			<td style="width:260px;">M7506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:342px;">Microcentrifuge tubes</td>
			<td style="width:185px;">Starlab</td>
			<td style="width:260px;">S1615-5500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:342px;">NaCl</td>
			<td style="width:185px;">VWR Chemicals</td>
			<td style="width:260px;">27810.295</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:342px;">Paraffin Histoplast IM</td>
			<td style="width:185px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:260px;">8331</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:342px;">Pasteur pipette&#160;</td>
			<td style="width:185px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:260px;">86.1171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:342px;">Petri dish</td>
			<td style="width:185px;">Thermo Scientific</td>
			<td>101R20&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:342px;">Petri plates</td>
			<td style="width:185px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:260px;">82.1473</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:342px;">Pipette (1 mL and 200 &#956;L)</td>
			<td style="width:185px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:260px;">4641230N, 4641210N&#160;&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:342px;">Plates 24-Well</td>
			<td style="width:185px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:260px;">142485</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:342px;">Steriomicroscope/Camera</td>
			<td style="width:185px;">Zeiss</td>
			<td style="width:260px;">Stemi 2000-C/Axiocam 105 color</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:342px;">Vials (1.5 mL)</td>
			<td style="width:185px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:260px;">11569914</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:342px;">Zebrafish AB strains</td>
			<td style="width:185px;">ZIRC&#160;</td>
			<td style="width:260px;">&#160; ZL1&#160;</td>
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rapid evaluation of toxicity of chemical compounds using zebrafish embryos

Il pesce zebra è un organismo modello di vertebrato ampiamente utilizzato per la malattia e la scoperta di farmaci basati sul fenotipo. Il pesce zebra genera molti figli, ha embrioni trasparenti e rapido sviluppo esterno. Gli embrioni di pesce zebra possono quindi essere utilizzati anche per la rapida valutazione della tossicità dei farmaci preziosi e disponibili in piccole quantità. Nel presente articolo, viene descritto un metodo per lo screening efficiente della tossicità dei composti chimici utilizzando embrioni post-fecondazione di 1-5 giorni. Gli embrioni sono monitorati da stereomicroscopiper per studiare i difetti fenotipici causati dall'esposizione a diverse concentrazioni di composti. Vengono inoltre determinate concentrazioni letali semimassi (LC50) dei composti. Il presente studio ha richiesto 3-6 mg di un composto inibitore, e l'intero esperimento richiede circa 8-10 h per essere completato da un individuo in un laboratorio con strutture di base. Il protocollo attuale è adatto per testare qualsiasi composto per identificare effetti tossici o fuori bersaglio intollerabili del composto nella fase iniziale della scoperta di farmaci e per rilevare sottili effetti tossici che possono essere persi nella coltura cellulare o in altri modelli animali. Il metodo riduce i ritardi procedurali e i costi dello sviluppo di farmaci.

La parte critica della valutazione della tossicità è la sperimentazione di diverse concentrazioni di uno o più composti chimici in un singolo esperimento. All'inizio, selezionare i composti per la valutazione della tossicità, il numero di concentrazioni da testare per ogni composto e, di conseguenza, creare un grafico (Figura 3). Abbiamo usato un colore univoco per ogni composto per organizzare gli esempi (Figura 3). L'uso di...

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Rapid Evaluation of Toxicity of Chemical Compounds Using Zebrafish Embryos

Gli embrioni di pesce zebra vengono utilizzati per valutare la tossicità dei composti chimici. Si sviluppano esternamente e sono sensibili alle sostanze chimiche, consentendo il rilevamento di sottili cambiamenti fenotipici. L'esperimento richiede solo una piccola quantità di composto, che viene aggiunto direttamente alla piastra contenente embrioni, rendendo il sistema di test efficiente e conveniente.

Rapida valutazione della tossicità dei composti chimici utilizzando gli embrioni di pesce zebra

The zebrafish is a widely used vertebrate model organism for the disease and phenotype-based drug discovery. The zebrafish generates many offspring, has ...

Le procedure di prova della tossicità saranno dimostrate dal Dr. Ashok Aspatwar, un ricercatore senior del mio laboratorio. Il nostro protocollo identifica gli effetti off-target e rileva sottili effetti tossici delle sostanze chimiche nella fase iniziale di scoperta che potrebbero mancare nella coltura cellulare o in altri modelli animali. I principali vantaggi della nostra tecnica sono: è rapida ed efficiente, richiede una quantità molto piccola di sostanze chimiche e le strutture di base in laboratorio.Lo screening tossico ci aiuterà a decidere la concentrazione per studiarne l'efficienza contro il micobatterio che causa la tubercolosi e per un ulteriore calcolo preclinico. Questo metodo utilizza approfondimenti sugli effetti off-target delle sostanze chimiche, e quindi questo metodo può essere utilizzato in qualsiasi area di ricerca in cui la tossicità della sostanza chimica è di primaria importanza. Questo metodo è molto semplice e può essere eseguito da chiunque senza esperienza precedente.Gli individui senza esperienza dovrebbero pianificare attentamente l'esperimento e utilizzare un solo composto. Questo metodo fornisce effetti tossici delle sostanze chimiche sotto forma di cambiamenti fenotipici negli embrioni di zebrafish in via di sviluppo e quindi sicurezza dei composti testati. Per iniziare, posiziona da due a cinque zebrafish maschi adulti e da tre a cinque zebrafish femmine adulte in vasche di accoppiamento durante la notte.Al mattino, accendere la luce mentre l'allevamento è indotto dal ciclo automatico buio e luce successivo. Per evitare di maneggiare lo stress per gli animali, consentire agli animali di riposare per due settimane prima di utilizzare gli stessi individui per la riproduzione. Il giorno successivo, prima di mezzogiorno, raccogliere gli embrioni utilizzando un colino a rete fine e trasferirli su una piastra di petri contenente mezzo embrionale E3.Posizionare la piastra di Petri al microscopio stereo per esaminare ogni lotto di embrioni. Identificare l'aspetto opaco e rimuoverli come embrioni non fecondati o morti. Mantenere gli embrioni a 28,5 gradi Celsius in un'incubatrice durante la notte.La mattina seguente, esaminare gli embrioni al microscopio stereo e rimuovere eventuali embrioni malsani o morti. Utilizzare con cura una pipetta pasteur per trasferire un embrione in ogni pozzo di una piastra di 24 pozza. Assicurarsi che ogni pozzo contenga abbastanza mezzo E3 per coprire gli embrioni.Eseminare le fiale contenenti composti inibitori conservati a 4 gradi Celsius in frigorifero. Utilizzare una bilancia analitica per pesare la quantità appropriata del composto e preparare 250 microlitri di soluzione di 100 millimolare per ogni composto in mezzo E3 o in un altro solvente appropriato. Quindi, utilizzare il mezzo E3 per effettuare diluizioni seriali delle soluzioni stock in base ai livelli di tossicità in tubi di centrifuga da 15 millilitri.Dai pozzi che contengono ciascuno un embrione DPF, utilizzare una pipetta pasteur e una pipetta da 1 millilitro per rimuovere l'acqua E3 una riga alla volta. Distribuire immediatamente 1 millilitro di ogni diluente delle soluzioni stock nei pozzi della piastra del pozzo 24 partendo da una concentrazione inferiore e passando a una concentrazione più elevata. Per i gruppi di controllo, aggiungere acqua E3 o un altro solvente pertinente.Etichettare 24 piastre di pozzo con il nome e la concentrazione del composto e mantenere le piastre a 28,5 gradi Celsius in un'incubatrice. Fare attenzione che i diluitanti delle sostanze chimiche nei pozzi non siano evaporati nell'incubatrice sigillando i lati di 24 piastre del pozzo. Ventiquattro ore dopo l'esposizione dei composti chimici, utilizzare una pipetta pasteur per trasferire le larve esposte ad ogni concentrazione del composto in una piccola piastra di Petri contenente cellulosa metile ad alto peso molecolare del 3%.Con una sonda metallica, appoggiala lateralmente. Posizionare la piastra di Petri sotto un microscopio stereo collegato a una fotocamera. Prendi le immagini e salva le immagini in una cartella separata ogni giorno fino alla fine dell'esperimento.Immettere tutte le osservazioni in una tabella ogni giorno in una tabella online o su un foglio stampato. Per l'esposizione a composti neurotossici, le larve da quattro a cinque DPF possono mostrare un modello di nuoto anomalo. In tal caso, registra tali modifiche catturando un breve video da 30 secondi a un minuto delle larve.Dopo cinque giorni di esposizione ai composti chimici, si noti la concentrazione alla quale la metà degli embrioni muore come la concentrazione letale semi massima 50 di ciascuna sostanza chimica. Costruire una curva per la mortalità degli embrioni per tutte le concentrazioni utilizzando un programma adatto. In questo protocollo, la parte critica della valutazione della tossicità è testare diverse concentrazioni di uno o più composti chimici in un singolo esperimento.Per i composti che inducono eventuali difetti fenotipici nelle larve, i difetti sono stati registrati ogni 24 ore nel periodo da uno a cinque giorni dopo l'esposizione alla sostanza chimica. Gli embrioni trattati con inibitori beta CA alle concentrazioni di 250 micromolari e 125 micromolari presentano vari difetti fenotipici rispetto al controllo. Ad esempio, embrioni non occorsi anche al giorno 3, struttura del corpo curva, sacco tuorlo nonutilizzato ed edema pericardico e assenza di sacche di otolito nelle larve a cinque giorni dal trattamento.In un altro studio, gli embrioni trattati con inibitori della CA hanno mostrato l'assenza di sacche di otoliti e vescica da bagno. Gli esperimenti hanno identificato un composto rappresentativo dell'anidrasi carbonica 9, che ha indotto cambiamenti fenotipici minimi o nulla durante lo sviluppo embrionale a 500 micromolari. Il composto ha mostrato un'alta concentrazione di LC50.Tuttavia, in un confronto con un controllo, lo stesso composto a 300 micromolari è stato trovato neurotossico e atassia indotta nelle larve dopo cinque giorni di esposizione. Una buona qualità degli embrioni è importante per lo screening tossico delle sostanze chimiche. Per ottenere embrioni di buona qualità, utilizzare giovani coppie di zebrafish adulti per l'allevamento.I composti che emergono come sicuri possono essere ulteriormente caratterizzati dall'esecuzione di rilevanti esperimenti in vitro e in vivo. Nel campo dello sviluppo di farmaci antitubercolosi, questa tecnica ha contribuito a creare ulteriori esperimenti per l'inibizione in vivo del micobatterio marinum negli embrioni di zebrafish. Il protocollo prevede l'uso di sostanze chimiche che possono essere tossiche per l'uomo.Le persone coinvolte negli esperimenti dovrebbero prestare la dovuta attenzione quando maneggiano le sostanze chimiche.

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