Name: rapid evaluation of toxicity of chemical compounds using zebrafish embryos
Uploaded: 2019-08-25T14:00:00
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この活動は、シグリッド・ジュセリウス財団(SP、MP)、フィンランド文化財団(AA、MH)、フィンランドアカデミー(SP、MP)、オリオン・ファルモス財団(MH)、タンペレ結核財団(SP、MH、MP)、ジェーン・アンド・アトス・エルコ財団(SP、MP)からの助成金によって支援されました。).イタリアとフランスの共同研究者であるスプーラン教授とウィナム教授は、抗結核および抗がん剤開発目的で安全性と毒性評価のための炭酸アンヒドラーゼ阻害剤を提供してくれたことに感謝します。アウリッキ・レムムスとマリアンヌ・クスラフティの技術支援に感謝します。我々はまた、ゼブラフィッシュの繁殖と胚の収集に彼らの助けのためにリーナ・メキネンとハンナリーナ・ピッポに感謝します。私たちは、原稿と洞察力に満ちたコメントの批判的な評価のためにハーラン・バーカーに心から感謝します。

タンペレ大学のゼブラフィッシュコア施設は、国立動物実験委員会(ESAVI/7975/04.10.05/2016)によって認可された設立許可を受けています。ゼブラフィッシュ胚を用いたすべての実験は、東フィンランド州政府、タンペレ地域サービスユニットプロトコル#LSLH-2007-7254/Ym-23の社会保健省に従って行われた。
1. 一晩ゼブラフィッシュ交配タンクのセットアップ
<ol><li>2-5成人の雄ゼ?...

<ol>
	<li>Amaouche, N., Casaert Salome, H., Collignon, O., Santos, M. R., Ziogas, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Marketing+authorization+applications+submitted+to+the+European+Medicines+Agency+by+small+and+medium-sized+enterprises:+an+analysis+of+major+objections+and+their+impact+on+outcomes.">Marketing authorization applications submitted to the European Medicines Agency by small and medium-sized enterprises: an analysis of major objections and their impact on outcomes.</a> Drug Discovery Today. 23 (10), 1801-1805 (2018).</li><li>Garg, R. C., Bracken, W. M., Hoberman, A. M., Gupta, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reproductive+and+developmental+safety+evaluation+of+new+pharmaceutical+compounds.">Reproductive and developmental safety evaluation of new pharmaceutical compounds.</a> Reproductive and Developmental Toxicology. , 89-109 (2011).</li><li>Lee, H. Y., Inselman, A. L., Kanungo, J., Hansen, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+models+in+developmental+toxicology.">Alternative models in developmental toxicology.</a> Systems Biology in Reproductive Medicine. 58 (1), 10-22 (2012).</li><li>Gao, G., Chen, L., Huang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-cancer+drug+discovery:+update+and+comparisons+in+yeast,+Drosophila,+and+zebrafish.">Anti-cancer drug discovery: update and comparisons in yeast, Drosophila, and zebrafish.</a> Current Molecular Pharmacology. 7 (1), 44-51 (2014).</li><li>Brown, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+of+test+chemicals+for+the+ECVAM+international+validation+study+on+in+vitro+embryotoxicity+tests.+European+Centre+for+the+Validation+of+Alternative+Methods.">Selection of test chemicals for the ECVAM international validation study on in vitro embryotoxicity tests. European Centre for the Validation of Alternative Methods.</a> Alternatives to Laboratory Animals. 30 (2), 177-198 (2002).</li><li>Selderslaghs, I. W., Van Rompay, A. R., De Coen, W., Witters, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+screening+assay+to+identify+teratogenic+and+embryotoxic+chemicals+using+the+zebrafish+embryo.">Development of a screening assay to identify teratogenic and embryotoxic chemicals using the zebrafish embryo.</a> Reproductive Toxicology. 28 (3), 308-320 (2009).</li><li>Brannen, K. C., Panzica-Kelly, J. M., Danberry, T. L., Augustine-Rauch, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+zebrafish+embryo+teratogenicity+assay+and+quantitative+prediction+model.">Development of a zebrafish embryo teratogenicity assay and quantitative prediction model.</a> Birth Defects Research Part B Developmental and Reproductive Toxicology. 89 (1), 66-77 (2010).</li><li>Hermsen, S. A., van den Brandhof, E. J., van der Ven, L. T., Piersma, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relative+embryotoxicity+of+two+classes+of+chemicals+in+a+modified+zebrafish+embryotoxicity+test+and+comparison+with+their+in+vivo+potencies.">Relative embryotoxicity of two classes of chemicals in a modified zebrafish embryotoxicity test and comparison with their in vivo potencies.</a> Toxicology in Vitro. 25 (3), 745-753 (2011).</li><li>Lessman, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+developing+zebrafish+(Danio+rerio):+a+vertebrate+model+for+high-throughput+screening+of+chemical+libraries.">The developing zebrafish (Danio rerio): a vertebrate model for high-throughput screening of chemical libraries.</a> Birth Defects Research. Part C, Embryo Today: Reviews. 93 (3), 268-280 (2011).</li><li>Lantz-McPeak, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+toxicity+assay+using+high+content+screening+of+zebrafish+embryos.">Developmental toxicity assay using high content screening of zebrafish embryos.</a> Journal of Applied Toxicology. 35 (3), 261-272 (2015).</li><li>Truong, L., Harper, S. L., Tanguay, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+embryotoxicity+using+the+zebrafish+model.">Evaluation of embryotoxicity using the zebrafish model.</a> Methods in Molecular Biology. 691, 271-279 (2011).</li><li>Rodrigues, G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design,+synthesis,+and+evaluation+of+hydroxamic+acid+derivatives+as+promising+agents+for+the+management+of+Chagas+disease.">Design, synthesis, and evaluation of hydroxamic acid derivatives as promising agents for the management of Chagas disease.</a> Journal of Medicinal Chemistry. 57 (2), 298-308 (2014).</li><li>Kanungo, J., Cuevas, E., Ali, S. F., Paule, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+model+in+drug+safety+assessment.">Zebrafish model in drug safety assessment.</a> Current Pharmaceutical Design. 20 (34), 5416-5429 (2014).</li><li>Peterson, R. T., Link, B. A., Dowling, J. E., Schreiber, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+molecule+developmental+screens+reveal+the+logic+and+timing+of+vertebrate+development.">Small molecule developmental screens reveal the logic and timing of vertebrate development.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (24), 12965-12969 (2000).</li><li>Stainier, D. Y., Fishman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+as+a+model+system+to+study+cardiovascular+development.">The zebrafish as a model system to study cardiovascular development.</a> Trends in Cardiovascular Medicine. 4 (5), 207-212 (1994).</li><li>Aspatwar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitroimidazole-based+inhibitors+DTP338+and+DTP348+are+safe+for+zebrafish+embryos+and+efficiently+inhibit+the+activity+of+human+CA+IX+in+Xenopus+oocytes.">Nitroimidazole-based inhibitors DTP338 and DTP348 are safe for zebrafish embryos and efficiently inhibit the activity of human CA IX in Xenopus oocytes.</a> Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry. 33 (1), 1064-1073 (2018).</li><li>Rami, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia-targeting+carbonic+anhydrase+IX+inhibitors+by+a+new+series+of+nitroimidazole-sulfonamides/sulfamides/sulfamates.">Hypoxia-targeting carbonic anhydrase IX inhibitors by a new series of nitroimidazole-sulfonamides/sulfamides/sulfamates.</a> Journal of Medicinal Chemistry. 56 (21), 8512-8520 (2013).</li><li>Spitsbergen, J. M., Kent, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+state+of+the+art+of+the+zebrafish+model+for+toxicology+and+toxicologic+pathology+research--advantages+and+current+limitations.">The state of the art of the zebrafish model for toxicology and toxicologic pathology research--advantages and current limitations.</a> Toxicologic Pathology. , 62-87 (2003).</li><li>Teraoka, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+cytochrome+P450+1A+is+required+for+circulation+failure+and+edema+by+2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin+in+zebrafish.">Induction of cytochrome P450 1A is required for circulation failure and edema by 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin in zebrafish.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 304 (2), 223-228 (2003).</li><li>Zon, L. I., Peterson, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+drug+discovery+in+the+zebrafish.">In vivo drug discovery in the zebrafish.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 4 (1), 35-44 (2005).</li><li>Hill, A. J., Teraoka, H., Heideman, W., Peterson, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+as+a+model+vertebrate+for+investigating+chemical+toxicity.">Zebrafish as a model vertebrate for investigating chemical toxicity.</a> Toxicological Sciences. 86 (1), 6-19 (2005).</li><li>Kari, G., Rodeck, U., Dicker, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish:+an+emerging+model+system+for+human+disease+and+drug+discovery.">Zebrafish: an emerging model system for human disease and drug discovery.</a> Clinical Pharmacology and Therapeutics. 82 (1), 70-80 (2007).</li><li>Gourmelon, A., Delrue, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+in+Support+of+Internationally+Harmonised+OECD+Test+Guidelines+for+Assessing+the+Safety+of+Chemicals.">Validation in Support of Internationally Harmonised OECD Test Guidelines for Assessing the Safety of Chemicals.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 856, 9-32 (2016).</li><li>Aspatwar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=beta-CA-specific+inhibitor+dithiocarbamate+Fc14-584B:+a+novel+antimycobacterial+agent+with+potential+to+treat+drug-resistant+tuberculosis.">beta-CA-specific inhibitor dithiocarbamate Fc14-584B: a novel antimycobacterial agent with potential to treat drug-resistant tuberculosis.</a> Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry. 32 (1), 832-840 (2017).</li><li>Kazokaite, J., Aspatwar, A., Kairys, V., Parkkila, S., Matulis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorinated+benzenesulfonamide+anticancer+inhibitors+of+carbonic+anhydrase+IX+exhibit+lower+toxic+effects+on+zebrafish+embryonic+development+than+ethoxzolamide.">Fluorinated benzenesulfonamide anticancer inhibitors of carbonic anhydrase IX exhibit lower toxic effects on zebrafish embryonic development than ethoxzolamide.</a> Drug and Chemical Toxicology. 40 (3), 309-319 (2017).</li><li>Howe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+reference+genome+sequence+and+its+relationship+to+the+human+genome.">The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome.</a> Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).</li><li>Granato, M., Nusslein-Volhard, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fishing+for+genes+controlling+development.">Fishing for genes controlling development.</a> Current Opinion in Genetics &amp; Development. 6 (4), 461-468 (1996).</li><li>Bambino, K., Chu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+in+Toxicology+and+Environmental+Health.">Zebrafish in Toxicology and Environmental Health.</a> Current Topics in Developmental Biology. 124, 331-367 (2017).</li><li>Goldsmith, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+as+a+pharmacological+tool:+the+how,+why+and+when.">Zebrafish as a pharmacological tool: the how, why and when.</a> Current Opinion in Pharmacology. 4 (5), 504-512 (2004).</li></ol>

培養細胞を用いてインビトロ毒性試験は、試験化合物によって誘導される毒性に関する限られた情報を提供する細胞の生存および形態学的研究を検出することができる。ゼブラフィッシュ胚を用いた化学化合物の毒性スクリーニングの利点は、関連するモデル生物における胚発生時の動物全体における化学的に誘発された型分法変化の迅速な検出である。タンパク質コードヒト遺伝子?...

医薬品開発は高価なプロセスです。単一の化学化合物が食品医薬品局(FDA)および欧州医薬品庁(EMA)によって承認される前に、数千の化合物が10億ドル以上の費用でスクリーニングされます1.前臨床開発の間、この費用の最も大きい部分は動物実験2のために要求される。コストを制限するために、医薬品開発の分野の研究者は、化学化合物3の安全性スクリーニングのための代替モデルを必要とします。したがって、薬剤開発の初期段階では、適切なモデルにおける化合物の安全性および毒性を迅速に評価できる方法を用いることは非常に有益であろう。動物および細胞培養モデルを含む化学化合物の毒性スクリーニングに使用されているいくつかのプロトコルがありますが、検証され、一般的に使用される単一のプロトコルはありません 4,5.ゼブラフィッシュを使用する既存のプロトコルは、長さが異なり、利便性要件6、7、8、9、および、その利便性要件に従って毒性を評価した個々の研究者によって使用されています。10歳,11歳,12.
最近では、ゼブラフィッシュは、胚発生時の化学化合物の毒性の評価のための便利なモデルとして浮上している 6,7.ゼブラフィッシュは、化学化合物13の評価のための多くの内蔵の利点を有する。ゼブラフィッシュメスは、急速にex vivoを開発し、200〜300個の卵のバッチを産むことができるので、大規模な実験でさえ、1週間まで外部摂食を必要とせず、透明である。化合物は、彼らが(化合物の性質に応じて)絨皮を通して拡散することができ、そして孵化後、皮膚、エラおよび幼虫の口を通して、水に直接添加することができる。実験は、胚の小さなサイズのために大量の化学化合物14を必要としない。ゼブラフィッシュ胚の開発は、正常な発達結果を達成するために必要なタンパク質のほとんどを発現する。したがって、ゼブラフィッシュ胚は、潜在的な薬物が発達的に重要なタンパク質またはシグナル伝達分子の機能を妨げることができるかどうかを評価する敏感なモデルである。ゼブラフィッシュの器官は2-5 dpf15の間で機能し、胚発生のこの敏感な期間中に有毒である化合物は、ゼブラフィッシュ幼虫のフェノティピック欠陥を誘発する。これらの型分法の変化は、侵襲的な技術を用いずに単純な顕微鏡を用いて容易に検出することができる11.ゼブラフィッシュ胚は、細胞培養モデル16,17を用いてインビトロ薬物スクリーニングに比べて生物学的複雑性が非常に大きいため、毒物学的研究に広く使用されている。 脊椎動物として、ゼブラフィッシュの遺伝的および生理学的構成はヒトに匹敵し、したがって化学化合物の毒性はゼブラフィッシュとヒト8、18、19の間で類似している。20歳,21歳,22.ゼブラフィッシュは、したがって、化学化合物の毒性および安全性の評価のための創薬の初期段階における貴重なツールである。
本稿では、1~5日間の受精後受精(dpf)ゼブラフィッシュ胚を用いて炭酸アンヒドラーゼ(CA)阻害剤化合物の安全性と毒性を評価するために用いられる方法の詳細な説明を、単一の研究者による。このプロトコルは、ゼブラフィッシュ胚を異なる濃度の化学阻害剤化合物に暴露し、胚発生時の死亡率および先記異動の変化を研究することを含む。化学化合物への曝露の終わりに、化学物質のLC50用量が決定される。この方法は、個人が1〜5の試験化合物の効率的なスクリーニングを行うことを可能にし、方法を持つ人の経験に応じて約8〜10時間かかります(図1)。化合物の毒性を評価するために必要な各ステップは、図2に概説されています。CA阻害剤の毒性の評価は8日を必要とし、交配ペアの設定を含む(1日目)。繁殖タンクから胚のコレクション, 洗浄し、28.5 °Cインキュベーターに転送 (2 日目);24ウェルプレートのウェルへの胚の分布と希釈されたCA阻害剤化合物の添加(3日目)。幼虫のフェ記視分析および画像化(4~8日目)、およびLC50用量(day8)の決定。 この方法は、迅速かつ効率的であり、少量の化学化合物と実験室の基本的な設備のみを必要とする。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:972px;" width="972">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:342px;">24-well plates</td>
			<td style="width:185px;">Nunc</td>
			<td style="width:260px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:185px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:342px;">Balance (Weighing scale)</td>
			<td style="width:185px;">KERN</td>
			<td style="width:260px;">PLJ3000-2CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:342px;">Balance (Weighing scale)</td>
			<td style="width:185px;">Mettler Toledo</td>
			<td style="width:260px;">AB104-S/PH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:342px;">CaCl2</td>
			<td style="width:185px;">JT.Baker</td>
			<td style="width:260px;">RS421910024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:342px;">Disecting Probe</td>
			<td style="width:185px;">Thermo Scientific</td>
			<td>17-467-604&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:342px;">DMSO</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich, Germany</td>
			<td style="width:260px;">D4540</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:342px;">Falcon tubes 15 mL</td>
			<td style="width:185px;">Greiner bio-one</td>
			<td style="width:260px;">188271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:342px;">High molecular weight methylcellulose</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich, Germany</td>
			<td style="width:260px;">M0262&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:342px;">Incubator for zebrafish larvae</td>
			<td style="width:185px;">Termaks</td>
			<td style="width:260px;">B8000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:342px;">KCL</td>
			<td style="width:185px;">Merck</td>
			<td style="width:260px;">1.04936.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:342px;">Methyl Blue</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich, Germany</td>
			<td style="width:260px;">28983-56-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:342px;">MgSO4</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich, Germany</td>
			<td style="width:260px;">M7506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:342px;">Microcentrifuge tubes</td>
			<td style="width:185px;">Starlab</td>
			<td style="width:260px;">S1615-5500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:342px;">NaCl</td>
			<td style="width:185px;">VWR Chemicals</td>
			<td style="width:260px;">27810.295</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:342px;">Paraffin Histoplast IM</td>
			<td style="width:185px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:260px;">8331</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:342px;">Pasteur pipette&#160;</td>
			<td style="width:185px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:260px;">86.1171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:342px;">Petri dish</td>
			<td style="width:185px;">Thermo Scientific</td>
			<td>101R20&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:342px;">Petri plates</td>
			<td style="width:185px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:260px;">82.1473</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:342px;">Pipette (1 mL and 200 &#956;L)</td>
			<td style="width:185px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:260px;">4641230N, 4641210N&#160;&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:342px;">Plates 24-Well</td>
			<td style="width:185px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:260px;">142485</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:342px;">Steriomicroscope/Camera</td>
			<td style="width:185px;">Zeiss</td>
			<td style="width:260px;">Stemi 2000-C/Axiocam 105 color</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:342px;">Vials (1.5 mL)</td>
			<td style="width:185px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:260px;">11569914</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:342px;">Zebrafish AB strains</td>
			<td style="width:185px;">ZIRC&#160;</td>
			<td style="width:260px;">&#160; ZL1&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid evaluation of toxicity of chemical compounds using zebrafish embryos

ゼブラフィッシュは、疾患および表現型ベースの創薬のために広く使用されている脊椎動物モデル生物である。ゼブラフィッシュは、多くの子孫を生成し、透明な胚と迅速な外部発達を有する。したがって、ゼブラフィッシュ胚は、貴重で少量で入手可能な薬物の毒性の迅速な評価にも使用することができる。本記事では、1〜5日後受精胚を用いて化学化合物の毒性を効率的にスクリーニングする方法について説明する。胚は、化合物の異なる濃度への暴露によって引き起こされる見型学的欠陥を調査するために、立体顕微鏡によって監視されます。化合物の半分最大致死濃度(LC50)も決定される。本研究では、阻害剤化合物の3〜6mgを必要とし、実験全体は、基本的な設備を有する実験室の個人が完了するのに約8〜10時間かかります。現在のプロトコルは、創薬の初期段階で化合物の耐えうない毒性またはオフターゲット効果を識別し、細胞培養または他の動物モデルで見逃される可能性のある微妙な毒性効果を検出するために、任意の化合物をテストするのに適しています。この方法は、手続き上の遅延と薬剤開発のコストを削減します。

毒性の評価の重要な部分は、単一の実験で1つまたは複数の化学化合物の異なる濃度をテストすることです。最初に、毒性の評価のための化合物を選択し、各化合物についてテストする濃度の数、およびそれに応じて、チャートを作成します(図3)。各化合物に固有の色を使用してサンプルを整理しました(図3)。溶剤耐性マー...

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Rapid Evaluation of Toxicity of Chemical Compounds Using Zebrafish Embryos

ゼブラフィッシュ胚は、化学化合物の毒性を評価するために使用されます。それらは外部で発達し、化学物質に敏感であり、微妙な形知らずの変化の検出を可能にする。実験は少量の化合物しか必要としないが、これは胚を含むプレートに直接添加され、試験システムを効率的かつ費用対効果の高い方法にする。

ゼブラフィッシュ胚を用いる化学化合物の毒性の迅速評価

The zebrafish is a widely used vertebrate model organism for the disease and phenotype-based drug discovery. The zebrafish generates many offspring, has ...

毒性試験の手順は、私の研究室の上級研究員であるアショク・アスパスワー博士によって実証されます。当社のプロトコルは、オフターゲット効果を特定し、細胞培養やその他の動物モデルで見逃される可能性のある発見の初期段階で化学物質の微妙な毒性効果を検出します。私たちの技術の主な利点は:それは迅速かつ効率的であり、化学物質の非常に少量、および実験室での基本的な施設を必要とします。毒性スクリーニングは、結核を引き起こす抗酸菌に対する効率を研究し、さらに前臨床計算のための濃度を決定するのに役立ちます。この方法は、化学物質のオフターゲット効果に関する洞察を使用し、したがって、この方法は、化学物質の毒性が主要な重要性である研究の任意の分野で使用することができます。この方法は非常に簡単で、経験のない誰でも実行できます。経験のない個人は、慎重に実験を計画し、1つの化合物を使用する必要があります。この方法は、開発中のゼブラフィッシュ胚の表述薬の変化の形で化学物質の毒性効果を提供し、したがって試験された化合物の安全性を提供する。まず、2~5匹の成体雄ゼブラフィッシュと3~5匹の成体雌ゼブラフィッシュを一晩交配タンクに入れます。朝、自動暗い光サイクルとその後の光サイクルによって繁殖が誘発されるように、ライトをオンにします。動物へのストレスを避けるために、動物が繁殖のために同じ個体を使用する前に2週間休むことを許可する。翌日の正午に、細かいメッシュストレーナーを使用して胚を収集し、E3胚培地を含むシャーレに移します。シャーレをステレオ顕微鏡の下に置き、胚の各バッチを調べます。不透明な外観を特定し、未受精または死んだ胚として除去します。一晩インキュベーターで28.5度の胚を保ちます。翌朝、ステレオ顕微鏡で胚を調べ、不健康または死んだ胚を取り除く。慎重に24ウェルプレートの各ウェルに1胚を転送するためにパスツールピペットを使用しています。各ウェルに胚を覆うのに十分なE3媒体が含まれていることを確認してください。冷蔵庫に摂氏4度で保存されている阻害剤化合物を含むバイアルを取り出します。分析バランスを使用して化合物の適切な量を秤量し、E3培地または別の適切な溶媒中の化合物ごとに250マイクロリットルの100ミリモルストック溶液を調製する。次に、E3培地を使用して、15ミリリットル遠心管の毒性レベルに基づいてストック溶液の連続希釈液を作ります。各々が1つのDPF胚を含む井戸から、パスツールピペットと1ミリリットルのピペットを使用して、E3水を一列ずつ取り除きます。すぐに、ストック溶液の各希釈液の1ミリリットルを、より低くから始めてより高い濃度に移動する24ウェルプレートの井戸に分配する。対照群に対して、E3水または他の関連する溶媒を加えます。化合物の名前と濃度を持つ24ウェルプレートにラベルを付け、インキュベーターでプレートを摂氏28.5度に保ちます。ウェル内の化学物質の希釈剤は、24ウェルプレートの側面を密封することによって、インキュベーターで蒸発しないように注意してください。化学化合物の曝露後24時間後、低温殺菌ピペットを用いて、3%高分子量メチルセルロースを含む小さなシャーレ内の各濃度の化合物に曝露された幼虫を移送する。金属プローブで横に置きます。カメラに取り付けられたステレオ顕微鏡の下にシャーレを置きます。画像を撮り、実験が終わるまで毎日別のフォルダに保存します。オンライン テーブルまたは印刷シートに、毎日テーブルにすべての観測値を入力します。神経毒性化合物曝露の場合、4~5匹のDPF幼虫は異常な泳ぎパターンを示し得る。その場合は、幼虫の短い30秒から1分間のビデオをキャプチャすることによって、このような変更の記録を作成します。化学化合物への5日間の暴露の後、胚の半分が各化学物質の半分の最大致死濃度50として死ぬ濃度に注意してください。適切なプログラムを使用して、すべての濃度の胚の死亡率のための曲線を構築します。このプロトコルでは、毒性の評価の重要な部分は、1つの実験で1つまたは複数の化学化合物の異なる濃度をテストすることです。幼虫に任意の表形異常を誘発する化合物については、化学物質への暴露後1〜5日の期間にわたって24時間ごとに欠陥を記録した。250マイクロモルおよび125マイクロモルの濃度でβCA阻害剤で治療された胚は、対照と比較して様々な現象性欠陥を示す。例えば、3日目でも孵化していない胚は、湾曲した身体構造、未利用の黄身嚢および心膜浮腫、および治療後5日で幼虫に耳鼻嚢が存在しない。別の研究では、CA阻害剤で治療された胚は、オトリス嚢および水泳膀胱の欠如を示した。実験は、500マイクロモルで胚発生中に最小限または全く表現型変化を誘発しない代表的な炭酸脱水酵素9を同定した。化合物は高いLC50濃度を示した。しかし、対照と比較して、300マイクロモルで同じ化合物は、5日間の暴露後に幼虫の神経毒性および誘発運動失調であることが判明した。胚の良質は、化学物質の毒性スクリーニングに重要である。良質の胚を得るために、繁殖のために成虫ゼブラフィッシュの若いペアを使用してください。安全として出現する化合物は、インビトロおよびインビボ実験に関連する実験を行うことによってさらに特徴付けることができる。抗結核薬の開発の分野では、この技術はゼブラフィッシュ胚におけるマイコバクテリウムマリナムのインビボ阻害のためのさらなる実験を設定するのに役立った。プロトコルは、人間に有毒である可能性のある化学物質の使用を含みます.実験に携わる人は、化学物質を取り扱う際には適切な注意を払う必要があります。

Research

JoVE Journal

Medicine

Evaluation of Nanoparticle Uptake in Tumors in Real Time Using Intravital Imaging

生体内イメージングを使ってリアルタイムで腫瘍におけるナノ粒子の取り込みの評価

Current technologies for tumor imaging, such as ultrasound, MRI, PET and CT, are unable to yield high-resolution images for the assessment of nanoparticle ...

Accurate and Simple Evaluation of Vascular Anastomoses in Monochorionic Placenta using Colored Dye

カラー染料を使用して単一絨毛膜性の胎盤における血管吻合の正確かつ簡単に評価

The presence of placental vascular anastomoses is a conditio sine qua non for the development of twin-to-twin transfusion syndrome (TTTS) and twin anemia ...

Induction of Myocardial Infarction in Adult Zebrafish Using Cryoinjury

Cryoinjuryを使用した大人のゼブラフィッシュにおける心筋梗塞の誘発

The mammalian heart is incapable of significant regeneration following an acute injury such as myocardial infarction1. By contrast, urodele amphibians and ...

The &alpha;-test: Rapid Cell-free CD4 Enumeration Using Whole Saliva

The ÃƒÅ½Ã‚Â±-test: Rapid Cell-free CD4 Enumeration Using Whole Saliva

α-テスト：全唾液を用いた迅速な無細胞CD4列挙

There is an urgent need for affordable CD4 enumeration to monitor HIV disease. CD4 enumeration is out of reach in resource-limited regions due to the time ...

Screening for Melanoma Modifiers using a Zebrafish Autochthonous Tumor Model

ゼブラ土着腫瘍モデルを用いたメラノーマの修飾のためのスクリーニング

Genomic studies of  human cancers have yielded a wealth of information about genes that are altered  in tumors1,2,3. A challenge arising from these ...

Chemotherapy-induced Vascular Toxicity - Real-time In vivo Imaging of Vessel Impairment

Chemotherapy-induced Vascular Toxicity - Real-time In vivo Imaging of Vessel Impairment

化学療法誘発性血管毒性 - リアルタイム<em&gt;インビボ</em船舶減損の&gt;イメージング

Certain classes of chemotherapies may exert acute vascular changes that may progress into long-term conditions that may predispose the patient to an ...

Quantification of the Immunosuppressant Tacrolimus on Dried Blood Spots Using LC-MS/MS

LC-MS / MSを用いて乾燥血液スポット上で免疫抑制タクロリムスの定量化

The calcineurin inhibitor tacrolimus is the cornerstone of most immunosuppressive treatment protocols after solid organ transplantation in the United ...

Diffuse Optical Spectroscopy for the Quantitative Assessment of Acute Ionizing Radiation Induced Skin Toxicity Using a Mouse Model

マウスモデルを用いた急性電離放射線による皮膚毒性の定量的評価のための光学分光拡散

Acute skin toxicities from ionizing radiation (IR) are a common side effect from therapeutic courses of external beam radiation therapy (RT) and ...

Solubility of Hydrophobic Compounds in Aqueous Solution Using Combinations of Self-assembling Peptide and Amino Acid

自己組織化ペプチドとアミノ酸の組み合わせを用いる水溶液中の疎水性化合物の溶解度

Self-assembling peptides (SAPs) are promising vehicles for the delivery of hydrophobic therapeutics for clinical applications; their amphipathic ...

Evaluation of Cerebral Blood Flow Autoregulation in the Rat Using Laser Doppler Flowmetry

レーザードップラー流量測定を用いたラットにおける脳血流自動調節の評価

When investigating the body&#39;s mechanisms for regulating cerebral blood flow, a relative measurement of microcirculatory blood flow can be obtained ...