Name: rapid evaluation of toxicity of chemical compounds using zebrafish embryos
Uploaded: 2019-08-25T14:00:00
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이 작품은 시그리드 주셀리우스 재단(SP, MP), 핀란드 문화 재단(AA, MH), 핀란드 아카데미(SP, MP), 오리온 파노스 재단(MH), 탐페레 결핵 재단(SP, MH 및 MP), 제인 과 아토스 에르코 재단(SP 및 MP)의 보조금으로 지원되었습니다. ). 우리는 항결핵 및 항암 제 개발 목적을 위한 안전성 및 독성 평가를 위한 탄산 아수드라아제 억제제를 제공한 이탈리아와 프랑스 협력자, 수푸란 교수 및 Winum 교수에게 감사드립니다. 아울릭키 레무스와 마리안 쿠슬라티에게 기술 지원에 감사드립니다. 우리는 또한 제브라피시 사육과 배아 수집에 도움을 준 리나 메키넨과 한날리나 피포에게 감사를 표합니다. 우리는 진심으로 원고와 통찰력있는 의견의 비판적 평가 할란 바커에게 감사드립니다.

탐페레 대학의 제브라피시 핵심 시설은 국립 동물 실험 위원회(ESAVI/7975/04.10.05/2016)에서 부여한 설립 허가를 받았습니다. 제브라피시 배아를 이용한 모든 실험은 핀란드 동부 지방 정부, 탐페레 지역 서비스 단위 프로토콜의 사회 보건부에 따라 수행되었다 # LSLH-2007-7254/Ym-23.
1. 하룻밤 얼룩말 짝짓기 탱크 의 설정
<ol><li>2-5 성인 수컷 얼룩말과 3-5 성인 암컷 얼룩말어를 하룻밤 ...

<ol>
	<li>Amaouche, N., Casaert Salome, H., Collignon, O., Santos, M. R., Ziogas, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Marketing+authorization+applications+submitted+to+the+European+Medicines+Agency+by+small+and+medium-sized+enterprises:+an+analysis+of+major+objections+and+their+impact+on+outcomes.">Marketing authorization applications submitted to the European Medicines Agency by small and medium-sized enterprises: an analysis of major objections and their impact on outcomes.</a> Drug Discovery Today. 23 (10), 1801-1805 (2018).</li><li>Garg, R. C., Bracken, W. M., Hoberman, A. M., Gupta, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reproductive+and+developmental+safety+evaluation+of+new+pharmaceutical+compounds.">Reproductive and developmental safety evaluation of new pharmaceutical compounds.</a> Reproductive and Developmental Toxicology. , 89-109 (2011).</li><li>Lee, H. Y., Inselman, A. L., Kanungo, J., Hansen, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+models+in+developmental+toxicology.">Alternative models in developmental toxicology.</a> Systems Biology in Reproductive Medicine. 58 (1), 10-22 (2012).</li><li>Gao, G., Chen, L., Huang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-cancer+drug+discovery:+update+and+comparisons+in+yeast,+Drosophila,+and+zebrafish.">Anti-cancer drug discovery: update and comparisons in yeast, Drosophila, and zebrafish.</a> Current Molecular Pharmacology. 7 (1), 44-51 (2014).</li><li>Brown, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+of+test+chemicals+for+the+ECVAM+international+validation+study+on+in+vitro+embryotoxicity+tests.+European+Centre+for+the+Validation+of+Alternative+Methods.">Selection of test chemicals for the ECVAM international validation study on in vitro embryotoxicity tests. European Centre for the Validation of Alternative Methods.</a> Alternatives to Laboratory Animals. 30 (2), 177-198 (2002).</li><li>Selderslaghs, I. W., Van Rompay, A. R., De Coen, W., Witters, H. 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T., Piersma, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relative+embryotoxicity+of+two+classes+of+chemicals+in+a+modified+zebrafish+embryotoxicity+test+and+comparison+with+their+in+vivo+potencies.">Relative embryotoxicity of two classes of chemicals in a modified zebrafish embryotoxicity test and comparison with their in vivo potencies.</a> Toxicology in Vitro. 25 (3), 745-753 (2011).</li><li>Lessman, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+developing+zebrafish+(Danio+rerio):+a+vertebrate+model+for+high-throughput+screening+of+chemical+libraries.">The developing zebrafish (Danio rerio): a vertebrate model for high-throughput screening of chemical libraries.</a> Birth Defects Research. Part C, Embryo Today: Reviews. 93 (3), 268-280 (2011).</li><li>Lantz-McPeak, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+toxicity+assay+using+high+content+screening+of+zebrafish+embryos.">Developmental toxicity assay using high content screening of zebrafish embryos.</a> Journal of Applied Toxicology. 35 (3), 261-272 (2015).</li><li>Truong, L., Harper, S. L., Tanguay, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+embryotoxicity+using+the+zebrafish+model.">Evaluation of embryotoxicity using the zebrafish model.</a> Methods in Molecular Biology. 691, 271-279 (2011).</li><li>Rodrigues, G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design,+synthesis,+and+evaluation+of+hydroxamic+acid+derivatives+as+promising+agents+for+the+management+of+Chagas+disease.">Design, synthesis, and evaluation of hydroxamic acid derivatives as promising agents for the management of Chagas disease.</a> Journal of Medicinal Chemistry. 57 (2), 298-308 (2014).</li><li>Kanungo, J., Cuevas, E., Ali, S. F., Paule, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+model+in+drug+safety+assessment.">Zebrafish model in drug safety assessment.</a> Current Pharmaceutical Design. 20 (34), 5416-5429 (2014).</li><li>Peterson, R. T., Link, B. A., Dowling, J. E., Schreiber, S. 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M., Kent, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+state+of+the+art+of+the+zebrafish+model+for+toxicology+and+toxicologic+pathology+research--advantages+and+current+limitations.">The state of the art of the zebrafish model for toxicology and toxicologic pathology research--advantages and current limitations.</a> Toxicologic Pathology. , 62-87 (2003).</li><li>Teraoka, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+cytochrome+P450+1A+is+required+for+circulation+failure+and+edema+by+2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin+in+zebrafish.">Induction of cytochrome P450 1A is required for circulation failure and edema by 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin in zebrafish.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 304 (2), 223-228 (2003).</li><li>Zon, L. I., Peterson, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+drug+discovery+in+the+zebrafish.">In vivo drug discovery in the zebrafish.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 4 (1), 35-44 (2005).</li><li>Hill, A. J., Teraoka, H., Heideman, W., Peterson, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+as+a+model+vertebrate+for+investigating+chemical+toxicity.">Zebrafish as a model vertebrate for investigating chemical toxicity.</a> Toxicological Sciences. 86 (1), 6-19 (2005).</li><li>Kari, G., Rodeck, U., Dicker, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish:+an+emerging+model+system+for+human+disease+and+drug+discovery.">Zebrafish: an emerging model system for human disease and drug discovery.</a> Clinical Pharmacology and Therapeutics. 82 (1), 70-80 (2007).</li><li>Gourmelon, A., Delrue, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+in+Support+of+Internationally+Harmonised+OECD+Test+Guidelines+for+Assessing+the+Safety+of+Chemicals.">Validation in Support of Internationally Harmonised OECD Test Guidelines for Assessing the Safety of Chemicals.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 856, 9-32 (2016).</li><li>Aspatwar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=beta-CA-specific+inhibitor+dithiocarbamate+Fc14-584B:+a+novel+antimycobacterial+agent+with+potential+to+treat+drug-resistant+tuberculosis.">beta-CA-specific inhibitor dithiocarbamate Fc14-584B: a novel antimycobacterial agent with potential to treat drug-resistant tuberculosis.</a> Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry. 32 (1), 832-840 (2017).</li><li>Kazokaite, J., Aspatwar, A., Kairys, V., Parkkila, S., Matulis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorinated+benzenesulfonamide+anticancer+inhibitors+of+carbonic+anhydrase+IX+exhibit+lower+toxic+effects+on+zebrafish+embryonic+development+than+ethoxzolamide.">Fluorinated benzenesulfonamide anticancer inhibitors of carbonic anhydrase IX exhibit lower toxic effects on zebrafish embryonic development than ethoxzolamide.</a> Drug and Chemical Toxicology. 40 (3), 309-319 (2017).</li><li>Howe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+reference+genome+sequence+and+its+relationship+to+the+human+genome.">The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome.</a> Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).</li><li>Granato, M., Nusslein-Volhard, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fishing+for+genes+controlling+development.">Fishing for genes controlling development.</a> Current Opinion in Genetics &amp; Development. 6 (4), 461-468 (1996).</li><li>Bambino, K., Chu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+in+Toxicology+and+Environmental+Health.">Zebrafish in Toxicology and Environmental Health.</a> Current Topics in Developmental Biology. 124, 331-367 (2017).</li><li>Goldsmith, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+as+a+pharmacological+tool:+the+how,+why+and+when.">Zebrafish as a pharmacological tool: the how, why and when.</a> Current Opinion in Pharmacology. 4 (5), 504-512 (2004).</li></ol>

배양된 세포를 이용한 시험관내 독성 시험은 시험 화합물에 의해 유도된 독성에 대한 제한된 정보를 제공하는 세포의 생존 및 형태학적 연구를 검출할 수 있다. 제브라피시 배아를 이용한 화학 화합물의 독성 스크리닝의 장점은 관련 모델 유기체에서 배아 개발 동안 전체 동물에서 화학적으로 유도된 현상형 변화를 신속하게 검출하는 것이다. 단백질 코딩 인간 유전자의 약 70%는 제브라피?...

약물 개발은 비용이 많이 드는 과정입니다. 단일 화학 화합물이 식품 의약국 (FDA)과 유럽 의약품 기구 (EMA)에 의해 승인되기 전에 수천 개의화합물이 10 억 달러 이상의 비용으로 선별됩니다 1. 전임상 개발 동안, 이 비용의 가장 큰 부분은동물 실험에 필요한 2. 비용을 제한하기 위해, 약물 개발 분야의 연구자들은 화학 화합물의 안전성 스크리닝을위한 대체 모델이 필요합니다 3. 따라서, 약물 개발의 초기 단계에서, 적합한 모델에서 화합물의 안전성 및 독성을 신속하게 평가할 수 있는 방법을 사용하는 것이 매우 유익할 것이다. 동물 및 세포 배양 모델을 포함하는 화학 화합물의 독성 스크리닝에 사용되는 여러 프로토콜이 있지만 검증되고 공통사용되는단일 프로토콜은 없다 4,5. zebrafish를 이용한 기존 프로토콜은 길이가 다양하며 편의요건6, 7,8,9에 따라 독성을 평가한 개별 연구자들이 사용하고 있습니다. 10개 , 11세 , 12.
최근, 제브라피쉬는 배아 개발 시 화학물질의 독성을 평가하는 편리한 모델로 대두되어있다6,7. 제브라피쉬는 화학화합물(13)의 평가에많은 내장장점을 갖는다. 심지어 대규모 실험은 제브라피쉬 여성이 200-300 개의 계란을 배치 할 수 있기 때문에 급속하게 생체 내생체 내에서 발달할 수 있으며 최대 1 주일 동안 외부 먹이가 필요하지 않으며 투명합니다. 화합물은 물 속으로 직접 첨가 될 수 있으며, 여기서 (화합물의 특성에 따라) 융모를 통해 확산되고 부화 후 피부, 아가미 및 유충의 입을 통해 확산 될 수 있습니다. 실험은 배아의 작은 크기 로 인해 풍부한 양의 화학 화합물(14)을 필요로하지 않는다. 제브라피시 배아를 개발하는 것은 정상적인 발달 결과를 달성하는 데 필요한 대부분의 단백질을 표현합니다. 따라서, 제브라피쉬 배아는 잠재적인 약물이 발달적으로 유의한 단백질 또는 신호 분자의 기능을 방해할 수 있는지 여부를 평가하는 민감한 모델이다. 제브라피쉬의 장기는 2-5 dpf15사이의 기능적이 되고, 배아 발달의 이 민감한 기간 동안 독성이 있는 화합물은 제브라피시 유충의 현상형 결함을 유발한다. 이러한 현상형 변화는 침습적 기술11없이 간단한 현미경을 사용하여 쉽게 검출될 수 있다. Zebrafish 배아는 세포 배양 모델16,17을사용하여 시험관내 약물 스크리닝에 비해 훨씬 더 큰 생물학적 복잡성으로 인해 독성 연구에서 널리 사용된다.  척추동물로서, 제브라피쉬의 유전적, 생리학적 구성은 인간과 비교할 수 있으며, 따라서 화학물질의 독성은 제브라피시와 인간8,18,19, 20개 , 21세 , 22. Zebrafish는, 따라서, 화학 화합물의 독성 및 안전성의 평가를 위한 약물 발견의 초기 단계에서 귀중한 도구이다.
본 기사에서는, 단일 연구자가 1-5일 후 수정(dpf) 제브라피시 배아를 사용하여 탄산 무수효소(CA) 억제제 화합물의 안전성 및 독성을 평가하는 데 사용되는 방법에 대한 상세한 설명을 제공합니다. 프로토콜은 화학 억제제 화합물의 다른 농도에 제브라피시 배아를 노출하고 배아 발달 도중 사망과 현상형 변경을 공부하는 관련시킵니다. 화학 화합물에 대한 노출이 끝나면, 화학 물질의 LC50 투여량이 결정된다. 이 방법은 개인이 1-5 개의 시험 화합물을 효율적으로 선별 할 수 있게하고 방법을 가진 사람의 경험에따라 약 8-10 시간이 걸립니다 (그림 1). 화합물의 독성을 평가하는 데 필요한 각 단계는 도2에 설명되어 있다. CA 억제제의 독성 평가는 8 일이 필요하며, 짝짓기 쌍의 설정 (1 일째)을 포함한다; 사육 탱크에서 배아의 수집, 청소 및 28.5 °C 인큐베이터로 전송 (2 일); 24 웰 플레이트의 우물에 배아의 분포와 희석 CA 억제제 화합물의 추가 (3 일째); 유충의 phenotypic 분석 및 이미징 (일 4-8), LC의 결정50 투여량 (day8).  이 방법은 신속하고 효율적이며 소량의 화학 화합물과 실험실의 기본 시설만 필요합니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:972px;" width="972">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:342px;">24-well plates</td>
			<td style="width:185px;">Nunc</td>
			<td style="width:260px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:185px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:342px;">Balance (Weighing scale)</td>
			<td style="width:185px;">KERN</td>
			<td style="width:260px;">PLJ3000-2CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:342px;">Balance (Weighing scale)</td>
			<td style="width:185px;">Mettler Toledo</td>
			<td style="width:260px;">AB104-S/PH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:342px;">CaCl2</td>
			<td style="width:185px;">JT.Baker</td>
			<td style="width:260px;">RS421910024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:342px;">Disecting Probe</td>
			<td style="width:185px;">Thermo Scientific</td>
			<td>17-467-604&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:342px;">DMSO</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich, Germany</td>
			<td style="width:260px;">D4540</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:342px;">Falcon tubes 15 mL</td>
			<td style="width:185px;">Greiner bio-one</td>
			<td style="width:260px;">188271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:342px;">High molecular weight methylcellulose</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich, Germany</td>
			<td style="width:260px;">M0262&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:342px;">Incubator for zebrafish larvae</td>
			<td style="width:185px;">Termaks</td>
			<td style="width:260px;">B8000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:342px;">KCL</td>
			<td style="width:185px;">Merck</td>
			<td style="width:260px;">1.04936.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:342px;">Methyl Blue</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich, Germany</td>
			<td style="width:260px;">28983-56-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:342px;">MgSO4</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich, Germany</td>
			<td style="width:260px;">M7506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:342px;">Microcentrifuge tubes</td>
			<td style="width:185px;">Starlab</td>
			<td style="width:260px;">S1615-5500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:342px;">NaCl</td>
			<td style="width:185px;">VWR Chemicals</td>
			<td style="width:260px;">27810.295</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:342px;">Paraffin Histoplast IM</td>
			<td style="width:185px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:260px;">8331</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:342px;">Pasteur pipette&#160;</td>
			<td style="width:185px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:260px;">86.1171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:342px;">Petri dish</td>
			<td style="width:185px;">Thermo Scientific</td>
			<td>101R20&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:342px;">Petri plates</td>
			<td style="width:185px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:260px;">82.1473</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:342px;">Pipette (1 mL and 200 &#956;L)</td>
			<td style="width:185px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:260px;">4641230N, 4641210N&#160;&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:342px;">Plates 24-Well</td>
			<td style="width:185px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:260px;">142485</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:342px;">Steriomicroscope/Camera</td>
			<td style="width:185px;">Zeiss</td>
			<td style="width:260px;">Stemi 2000-C/Axiocam 105 color</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:342px;">Vials (1.5 mL)</td>
			<td style="width:185px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:260px;">11569914</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:342px;">Zebrafish AB strains</td>
			<td style="width:185px;">ZIRC&#160;</td>
			<td style="width:260px;">&#160; ZL1&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid evaluation of toxicity of chemical compounds using zebrafish embryos

제브라피쉬는 질병 및 표현형 기반 약물 발견을 위해 널리 사용되는 척추동물 모델 유기체이다. 얼룩말 물고기는 많은 자손을 생성, 투명 한 배아와 빠른 외부 개발. 따라서 Zebrafish 배아는 소중하고 소량으로 사용할 수 있는 약물의 독성을 신속하게 평가하는 데에도 사용할 수 있습니다. 본 기사에서는, 1-5일 후 수정 배아를 이용한 화학 화합물의 독성을 효율적으로 스크리닝하는 방법에 대해 설명한다. 배아는 화합물의 다른 농도에 노출에 기인한 현상형 결함을 조사하기 위하여 입체 현미경에 의해 감시됩니다. 화합물의 반 최대 치명적인농도 (LC 50)도 결정 됩니다. 본 연구는 억제제 화합물의 3-6 mg을 요구했으며, 전체 실험은 기본 시설을 갖는 실험실에서 개인에 의해 완료되기까지 약 8-10 시간이 소요됩니다. 현재 프로토콜은 약물 발견의 초기 단계에서 화합물의 참을 수 없는 독성 또는 오프 타겟 효과를 식별하고 세포 배양 또는 다른 동물 모델에서 놓칠 수 있는 미묘한 독성 효과를 검출하기 위해 임의의 화합물을 테스트하는 데 적합하다. 이 방법은 절차 지연 및 약물 개발 비용을 줄입니다.

독성 평가의 중요한 부분은 단일 실험에서 하나 또는 여러 화학 화합물의 서로 다른 농도를 테스트하는 것입니다. 처음에는, 독성평가를 위한 화합물을 선택하고, 각 화합물에 대해 시험할 농도의 수를, 그에 따라, 차트를 만든다(도 3). 우리는 샘플을 구성하기 위해 각 화합물에대한 고유 한 색상을 사용했다 (그림 3). 나중에 혼...

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Rapid Evaluation of Toxicity of Chemical Compounds Using Zebrafish Embryos

Zebrafish 배아는 화학 화합물의 독성을 평가하는 데 사용됩니다. 그들은 외부에서 개발하고 미묘한 자형기능 변화의 검출을 허용, 화학 물질에 민감하다. 실험은 배아를 함유하는 플레이트에 직접 첨가되는 소량의 화합물만을 필요로 하므로 테스트 시스템이 효율적이고 비용 효율적입니다.

Zebrafish 배아를 이용한 화학 화합물의 독성에 대한 신속한 평가

The zebrafish is a widely used vertebrate model organism for the disease and phenotype-based drug discovery. The zebrafish generates many offspring, has ...

독성 검사 절차는 박사에 의해 입증될 것입니다.Ashok Aspatwar, 내 실험실에서 수석 연구원. 우리의 프로토콜은 오프 타겟 효과를 식별하고 세포 배양 또는 기타 동물 모델에서 놓칠 수있는 발견의 초기 단계에서 화학 물질의 미묘한 독성 효과를 감지합니다. 우리의 기술의 주요 장점은 : 그것은 신속하고 효율적이며, 매우 적은 양의 화학 물질이 필요하며 실험실의 기본 시설이 필요합니다.독성 검사는 결핵을 일으키는 원인이 되는 진균에 대하여 그것의 효율성을 공부하고 추가 전임상 계산을 위한 그것의 효율성을 결정하기위한 집중을 결정하는 저희를 도울 것입니다. 이 방법은 화학 물질의 오프 타겟 효과에 대한 통찰력을 사용하므로이 방법은 화학 물질의 독성이 주요 중요한 연구의 모든 영역에서 사용될 수 있습니다. 이 방법은 매우 간단하고 사전 경험없이 누구에 의해 수행 될 수있다.경험이없는 개인은 실험을 신중하게 계획하고 하나의 화합물을 사용해야합니다. 이 방법은 개발 제브라피시 배아의 현상 적 변화의 형태로 화학 물질의 독성 효과를 제공하고 따라서 테스트 화합물의 안전. 우선, 성인 남성 얼룩말 물고기 2~5개와 성인 암컷 제브라피쉬 3~5개를 하룻밤 동안 짝짓기 탱크에 넣습니다.아침에는 자동 어둡고 후속 광사이클에 의해 사육이 유도됨에 따라 빛을 켭니다. 동물에 대한 스트레스를 처리하지 않으려면 사육을 위해 동일한 개인을 사용하기 전에 동물이 2 주 동안 휴식을 취하도록하십시오. 다음날 정오에 미세 메쉬 스트레이너를 사용하여 배아를 수집하고 E3 배아 배지가 들어있는 페트리 접시에 옮기습니다.페트리 접시를 스테레오 현미경 아래에 놓고 각 배아 배치를 검사합니다. 불투명한 외관을 확인하고 수정되지 않은 또는 죽은 배아로 제거합니다. 배아는 하룻밤 동안 인큐베이터에서 섭씨 28.5도에서 유지하십시오.다음 날 아침, 스테레오 현미경의 밑에 태아를 검토하고 어떤 건강에 해로운 또는 죽은 태아든지 제거합니다. 정중하의 파스퇴 파이펫을 사용하여 24웰 플레이트의 각 우물로 하나의 배아를 옮기는 다. 각 우물이 배아를 덮을 충분한 E3 배지를 포함하고 있는지 확인하십시오.냉장고에 섭씨 4도에 저장된 억제제 화합물을 함유한 바이알을 꺼내라. 분석 균형을 사용하여 적절한 양의 화합물을 계량하고 E3 배지 또는 다른 적절한 용매의 각 화합물에 대해 100 밀리머 스톡 솔루션의 250 마이크로리터를 준비합니다. 그런 다음 E3 배지를 사용하여 15 밀리리터 원심 분리기 튜브의 독성 수준에 따라 재고 용액의 직렬 희석을 합니다.각각 하나의 DPF 배아를 포함하는 우물에서, 파스퇴르 파이펫과 1 밀리리터 파이펫을 사용하여 한 번에 하나의 행E3 물을 제거합니다. 즉시 낮은 에서 더 높은 농도로 이동 24 웰 플레이트의 우물에 재고 솔루션의 각 희석제의 1 밀리리터를 배포합니다. 대조군의 경우 E3 물 또는 다른 관련 용매를 추가합니다.화합물의 이름과 농도가 있는 24개의 잘 플레이트를 라벨로 표시하고 배양기에서 섭씨 28.5도에서 플레이트를 유지합니다. 우물내 의 화학 물질의 희석제는 24 웰 플레이트의 측면을 밀봉하여 인큐베이터에서 증발되지 않도록주의하십시오. 화학 화합물의 노출 후 24 시간, 3 %의 높은 분자량 메틸 셀룰로오스를 포함하는 작은 페트리 접시에 화합물의 각 농도에 노출 된 애벌레를 전송하기 위해 파스퇴르 파이펫을 사용합니다.금속 프로브를 사용하면 옆으로 놓습니다. 카메라에 부착된 스테레오 현미경 아래에 페트리 접시를 놓습니다. 이미지를 가져 와서 실험이 끝날 때까지 매일 별도의 폴더에 이미지를 저장합니다.온라인 테이블이나 인쇄된 시트에 매일 테이블에 있는 모든 관측을 입력합니다. 신경 독성 화합물 노출의 경우, 4~5개의 DPF 애벌레는 비정상적인 수영 패턴을 나타낼 수 있다. 이 경우 유충의 짧은 30초에서 1분 분량의 비디오를 캡처하여 이러한 변경 사항을 기록합니다.화학 화합물에 노출된 5일 후에, 배아의 절반이 각 화학 물질의 절반 최대 치명적인 농도로 죽는 농도를 주의하십시오. 적합한 프로그램을 사용하여 모든 농도에 대한 배아의 사망률에 대한 곡선을 구성한다. 이 프로토콜에서, 독성 의 평가의 중요한 부분은 단일 실험에서 하나 또는 다중 화학 화합물의 상이한 농도를 테스트한다.유충에서 어떤 현상 불량 결함을 유도하는 화합물의 경우, 결함은 화학 물질에 대한 노출 후 1~5일 동안 24시간마다 기록되었다. 250 마이크로몰러 및 125 마이크로몰러의 농도에서 베타 CA 억제제로 치료된 배아는 대조군과 비교하여 다양한 현상 적 결함을 나타낸다. 예를 들어, 3일째에도 해치되지 않은 배아, 구부러진 신체 구조, 활용되지 않은 노른자 낭 및 심근 부종, 치료 후 5일 후에 애벌레에 이스톨리스 주머니가 없다.또 다른 연구에서는 CA 억제제로 치료된 배아는 이토리스 주머니와 수영 방광의 부재를 보여주었습니다. 실험은 500 마이크로몰러에서 배아 발달 중에 최소한의 또는 현상이 없는 변화를 유도한 대표적인 화합물 탄산 anhydrase 9를 확인했습니다. 화합물은 높은 LC50 농도를 보였다.그러나, 대조군과 비교하여, 300 마이크로몰러에서 동일한 화합물은 5일간의 노출 후 애벌레에서 신경독성및 유도된 운동실조인 것으로 밝혀졌다. 배아의 좋은 품질은 화학 물질의 독성 검사에 중요합니다. 양질의 배아를 얻기 위해, 번식성인 제브라피쉬의 젊은 쌍을 사용합니다.안전한 것으로 나타나는 화합물은 시험관 내 및 생체 내 실험에서 관련성을 발휘함으로써 더욱 특징지을 수 있다. 항결핵 약물 개발 분야에서, 이 기술은 제브라피시 배아에서 진균 마리넘의 생체 내 억제를 위한 추가 실험을 설정하는 것을 도왔습니다. 프로토콜은 인간에게 유독할 지도 모르다 화학제품의 사용을 관련시킵니다.실험에 관여하는 사람은 화학 물질을 취급할 때 적절한 주의를 기울여야 합니다.

Research

JoVE Journal

Medicine

Evaluation of Nanoparticle Uptake in Tumors in Real Time Using Intravital Imaging

Intravital 이미징을 사용하여 실시간으로 종양의 Nanoparticle의 이해 평가

Current technologies for tumor imaging, such as ultrasound, MRI, PET and CT, are unable to yield high-resolution images for the assessment of nanoparticle ...

연구

의학

Accurate and Simple Evaluation of Vascular Anastomoses in Monochorionic Placenta using Colored Dye

유색 염료를 사용하여 Monochorionic 태반의 혈관 Anastomoses의 정확하고 간단한 평가

The presence of placental vascular anastomoses is a conditio sine qua non for the development of twin-to-twin transfusion syndrome (TTTS) and twin anemia ...

Induction of Myocardial Infarction in Adult Zebrafish Using Cryoinjury

성인 Zebrafish에서 심근 경색의 유도는 Cryoinjury 사용

The mammalian heart is incapable of significant regeneration following an acute injury such as myocardial infarction1. By contrast, urodele amphibians and ...

The &alpha;-test: Rapid Cell-free CD4 Enumeration Using Whole Saliva

The ÃƒÅ½Ã‚Â±-test: Rapid Cell-free CD4 Enumeration Using Whole Saliva

α-테스트 : 전체 타액을 사용하여 빠른 셀 프리 CD4의 열거

There is an urgent need for affordable CD4 enumeration to monitor HIV disease. CD4 enumeration is out of reach in resource-limited regions due to the time ...

Screening for Melanoma Modifiers using a Zebrafish Autochthonous Tumor Model

Zebrafish Autochthonous 종양 모델을 사용하여 흑종 조절을위한 검사

Genomic studies of  human cancers have yielded a wealth of information about genes that are altered  in tumors1,2,3. A challenge arising from these ...

Chemotherapy-induced Vascular Toxicity - Real-time In vivo Imaging of Vessel Impairment

Chemotherapy-induced Vascular Toxicity - Real-time In vivo Imaging of Vessel Impairment

화학 요법에 의한 혈관 독성 - 실시간<em&gt; 생체 내</em&gt; 선박 손상의 영상

Certain classes of chemotherapies may exert acute vascular changes that may progress into long-term conditions that may predispose the patient to an ...

Quantification of the Immunosuppressant Tacrolimus on Dried Blood Spots Using LC-MS/MS

LC-MS / MS를 사용하여 건조 혈액 명소에 면역 억제제 타 크롤리 무스의 정량화

The calcineurin inhibitor tacrolimus is the cornerstone of most immunosuppressive treatment protocols after solid organ transplantation in the United ...

Diffuse Optical Spectroscopy for the Quantitative Assessment of Acute Ionizing Radiation Induced Skin Toxicity Using a Mouse Model

마우스 모델을 사용하여 급성 이온화 방사선 유발 피부 독성의 정량적 평가를위한 광학 분광학 확산

Acute skin toxicities from ionizing radiation (IR) are a common side effect from therapeutic courses of external beam radiation therapy (RT) and ...

Solubility of Hydrophobic Compounds in Aqueous Solution Using Combinations of Self-assembling Peptide and Amino Acid

자기 조립 펩타이드와 아미노산의 조합을 사용 하 여 수 용액에서 소수 성 화합물의 용 해도

Self-assembling peptides (SAPs) are promising vehicles for the delivery of hydrophobic therapeutics for clinical applications; their amphipathic ...

Evaluation of Cerebral Blood Flow Autoregulation in the Rat Using Laser Doppler Flowmetry

레이저 도플러 흐름 측정을 사용하여 쥐에 대뇌 혈액 흐름 자동 조절의 평가

When investigating the body&#39;s mechanisms for regulating cerebral blood flow, a relative measurement of microcirculatory blood flow can be obtained ...