Name: rapid evaluation of toxicity of chemical compounds using zebrafish embryos
Uploaded: 2019-08-25T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Rapid Evaluation of Toxicity of Chemical Compounds Using Zebrafish Embryos at JoVE.com

Arbeidet ble støttet av tilskudd fra Sigrid Juselius Foundation (SP, MP), finsk Cultural Foundation (AA, MH), Academy of Finland (SP, MP), Orion Farmos Foundation (MH), Tampere tuberkulose Foundation (SP, MH og MP) og Jane og langgong Erkko Foundation (SP og MP ). Vi takker våre italienske og franske samarbeidspartnere, Prof Supuran, og Prof Grønsdal, for å gi Karbons karboanhydrasehemmere hemmere for sikkerhet og toksisitet evaluering for anti-TB og anti-kreft narkotika utvikling formål. Vi takker Aulikki Lehmus og Marianne Kuuslahti for teknisk assistanse. Vi takker også Leena Mäkinen og Hannaleena utslått for deres hjelp med sebrafisk avl og samling av embryo. Vi oppriktig takker Harlan Barker for kritisk vurdering av manuskriptet og innsiktsfulle kommentarer.

Sebrafisk kjerne anlegg ved Tampere University har en etablerings autorisasjon gitt av det nasjonale dyre eksperiment kortet (ESAVI/7975/04.10.05/2016). Alle eksperimentene bruker sebrafisk embryo ble utført i henhold til provinsielle regjeringen i øst-Finland, sosial og helse Department of Tampere Regional Service Unit Protocol # LSLH-2007-7254/YM-23.
1. oppsett av overnight sebrafisk mating tanker
<ol><li>Plasser 2-5 voksne mannlige sebrafisk og 3-5 voksen kvinnelig sebrafisk inn i par R...

<ol>
	<li>Amaouche, N., Casaert Salome, H., Collignon, O., Santos, M. R., Ziogas, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Marketing+authorization+applications+submitted+to+the+European+Medicines+Agency+by+small+and+medium-sized+enterprises:+an+analysis+of+major+objections+and+their+impact+on+outcomes.">Marketing authorization applications submitted to the European Medicines Agency by small and medium-sized enterprises: an analysis of major objections and their impact on outcomes.</a> Drug Discovery Today. 23 (10), 1801-1805 (2018).</li><li>Garg, R. C., Bracken, W. M., Hoberman, A. M., Gupta, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reproductive+and+developmental+safety+evaluation+of+new+pharmaceutical+compounds.">Reproductive and developmental safety evaluation of new pharmaceutical compounds.</a> Reproductive and Developmental Toxicology. , 89-109 (2011).</li><li>Lee, H. Y., Inselman, A. L., Kanungo, J., Hansen, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+models+in+developmental+toxicology.">Alternative models in developmental toxicology.</a> Systems Biology in Reproductive Medicine. 58 (1), 10-22 (2012).</li><li>Gao, G., Chen, L., Huang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-cancer+drug+discovery:+update+and+comparisons+in+yeast,+Drosophila,+and+zebrafish.">Anti-cancer drug discovery: update and comparisons in yeast, Drosophila, and zebrafish.</a> Current Molecular Pharmacology. 7 (1), 44-51 (2014).</li><li>Brown, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+of+test+chemicals+for+the+ECVAM+international+validation+study+on+in+vitro+embryotoxicity+tests.+European+Centre+for+the+Validation+of+Alternative+Methods.">Selection of test chemicals for the ECVAM international validation study on in vitro embryotoxicity tests. European Centre for the Validation of Alternative Methods.</a> Alternatives to Laboratory Animals. 30 (2), 177-198 (2002).</li><li>Selderslaghs, I. W., Van Rompay, A. R., De Coen, W., Witters, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+screening+assay+to+identify+teratogenic+and+embryotoxic+chemicals+using+the+zebrafish+embryo.">Development of a screening assay to identify teratogenic and embryotoxic chemicals using the zebrafish embryo.</a> Reproductive Toxicology. 28 (3), 308-320 (2009).</li><li>Brannen, K. C., Panzica-Kelly, J. M., Danberry, T. L., Augustine-Rauch, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+zebrafish+embryo+teratogenicity+assay+and+quantitative+prediction+model.">Development of a zebrafish embryo teratogenicity assay and quantitative prediction model.</a> Birth Defects Research Part B Developmental and Reproductive Toxicology. 89 (1), 66-77 (2010).</li><li>Hermsen, S. A., van den Brandhof, E. J., van der Ven, L. T., Piersma, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relative+embryotoxicity+of+two+classes+of+chemicals+in+a+modified+zebrafish+embryotoxicity+test+and+comparison+with+their+in+vivo+potencies.">Relative embryotoxicity of two classes of chemicals in a modified zebrafish embryotoxicity test and comparison with their in vivo potencies.</a> Toxicology in Vitro. 25 (3), 745-753 (2011).</li><li>Lessman, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+developing+zebrafish+(Danio+rerio):+a+vertebrate+model+for+high-throughput+screening+of+chemical+libraries.">The developing zebrafish (Danio rerio): a vertebrate model for high-throughput screening of chemical libraries.</a> Birth Defects Research. Part C, Embryo Today: Reviews. 93 (3), 268-280 (2011).</li><li>Lantz-McPeak, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+toxicity+assay+using+high+content+screening+of+zebrafish+embryos.">Developmental toxicity assay using high content screening of zebrafish embryos.</a> Journal of Applied Toxicology. 35 (3), 261-272 (2015).</li><li>Truong, L., Harper, S. L., Tanguay, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+embryotoxicity+using+the+zebrafish+model.">Evaluation of embryotoxicity using the zebrafish model.</a> Methods in Molecular Biology. 691, 271-279 (2011).</li><li>Rodrigues, G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design,+synthesis,+and+evaluation+of+hydroxamic+acid+derivatives+as+promising+agents+for+the+management+of+Chagas+disease.">Design, synthesis, and evaluation of hydroxamic acid derivatives as promising agents for the management of Chagas disease.</a> Journal of Medicinal Chemistry. 57 (2), 298-308 (2014).</li><li>Kanungo, J., Cuevas, E., Ali, S. F., Paule, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+model+in+drug+safety+assessment.">Zebrafish model in drug safety assessment.</a> Current Pharmaceutical Design. 20 (34), 5416-5429 (2014).</li><li>Peterson, R. T., Link, B. A., Dowling, J. E., Schreiber, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+molecule+developmental+screens+reveal+the+logic+and+timing+of+vertebrate+development.">Small molecule developmental screens reveal the logic and timing of vertebrate development.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (24), 12965-12969 (2000).</li><li>Stainier, D. Y., Fishman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+as+a+model+system+to+study+cardiovascular+development.">The zebrafish as a model system to study cardiovascular development.</a> Trends in Cardiovascular Medicine. 4 (5), 207-212 (1994).</li><li>Aspatwar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitroimidazole-based+inhibitors+DTP338+and+DTP348+are+safe+for+zebrafish+embryos+and+efficiently+inhibit+the+activity+of+human+CA+IX+in+Xenopus+oocytes.">Nitroimidazole-based inhibitors DTP338 and DTP348 are safe for zebrafish embryos and efficiently inhibit the activity of human CA IX in Xenopus oocytes.</a> Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry. 33 (1), 1064-1073 (2018).</li><li>Rami, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia-targeting+carbonic+anhydrase+IX+inhibitors+by+a+new+series+of+nitroimidazole-sulfonamides/sulfamides/sulfamates.">Hypoxia-targeting carbonic anhydrase IX inhibitors by a new series of nitroimidazole-sulfonamides/sulfamides/sulfamates.</a> Journal of Medicinal Chemistry. 56 (21), 8512-8520 (2013).</li><li>Spitsbergen, J. M., Kent, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+state+of+the+art+of+the+zebrafish+model+for+toxicology+and+toxicologic+pathology+research--advantages+and+current+limitations.">The state of the art of the zebrafish model for toxicology and toxicologic pathology research--advantages and current limitations.</a> Toxicologic Pathology. , 62-87 (2003).</li><li>Teraoka, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+cytochrome+P450+1A+is+required+for+circulation+failure+and+edema+by+2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin+in+zebrafish.">Induction of cytochrome P450 1A is required for circulation failure and edema by 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin in zebrafish.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 304 (2), 223-228 (2003).</li><li>Zon, L. I., Peterson, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+drug+discovery+in+the+zebrafish.">In vivo drug discovery in the zebrafish.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 4 (1), 35-44 (2005).</li><li>Hill, A. J., Teraoka, H., Heideman, W., Peterson, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+as+a+model+vertebrate+for+investigating+chemical+toxicity.">Zebrafish as a model vertebrate for investigating chemical toxicity.</a> Toxicological Sciences. 86 (1), 6-19 (2005).</li><li>Kari, G., Rodeck, U., Dicker, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish:+an+emerging+model+system+for+human+disease+and+drug+discovery.">Zebrafish: an emerging model system for human disease and drug discovery.</a> Clinical Pharmacology and Therapeutics. 82 (1), 70-80 (2007).</li><li>Gourmelon, A., Delrue, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+in+Support+of+Internationally+Harmonised+OECD+Test+Guidelines+for+Assessing+the+Safety+of+Chemicals.">Validation in Support of Internationally Harmonised OECD Test Guidelines for Assessing the Safety of Chemicals.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 856, 9-32 (2016).</li><li>Aspatwar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=beta-CA-specific+inhibitor+dithiocarbamate+Fc14-584B:+a+novel+antimycobacterial+agent+with+potential+to+treat+drug-resistant+tuberculosis.">beta-CA-specific inhibitor dithiocarbamate Fc14-584B: a novel antimycobacterial agent with potential to treat drug-resistant tuberculosis.</a> Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry. 32 (1), 832-840 (2017).</li><li>Kazokaite, J., Aspatwar, A., Kairys, V., Parkkila, S., Matulis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorinated+benzenesulfonamide+anticancer+inhibitors+of+carbonic+anhydrase+IX+exhibit+lower+toxic+effects+on+zebrafish+embryonic+development+than+ethoxzolamide.">Fluorinated benzenesulfonamide anticancer inhibitors of carbonic anhydrase IX exhibit lower toxic effects on zebrafish embryonic development than ethoxzolamide.</a> Drug and Chemical Toxicology. 40 (3), 309-319 (2017).</li><li>Howe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+reference+genome+sequence+and+its+relationship+to+the+human+genome.">The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome.</a> Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).</li><li>Granato, M., Nusslein-Volhard, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fishing+for+genes+controlling+development.">Fishing for genes controlling development.</a> Current Opinion in Genetics &amp; Development. 6 (4), 461-468 (1996).</li><li>Bambino, K., Chu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+in+Toxicology+and+Environmental+Health.">Zebrafish in Toxicology and Environmental Health.</a> Current Topics in Developmental Biology. 124, 331-367 (2017).</li><li>Goldsmith, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+as+a+pharmacological+tool:+the+how,+why+and+when.">Zebrafish as a pharmacological tool: the how, why and when.</a> Current Opinion in Pharmacology. 4 (5), 504-512 (2004).</li></ol>

I vitro toksisitet test ved hjelp av kulturperler celler kan oppdage overlevelse og morfologiske studier av cellene gir begrenset informasjon om toksisitet indusert av testen sammensatte. Fordelen med toksisitet screening av kjemiske forbindelser ved hjelp sebrafisk embryo er rask påvisning av kjemisk indusert fenotypiske endringer i et helt dyr under embryonale utviklingen i en relevant modell organisme. Ca 70% av protein-koding menneskelige gener har orthologs kolleger i sebrafisk Genova25</...

Drug utvikling er en kostbar prosess. Før en enkelt kjemisk sammensatt er godkjent av Food and Drug Administration (FDA) og European legemiddel Agency (EMA) flere tusen forbindelser er vist til en kostnad på over 1 000 000 000 dollar1. Under prekliniske utvikling, er den største delen av denne kostnaden som kreves for dyret testing2. For å begrense kostnadene, forskere innen narkotika utvikling trenger alternative modeller for sikkerhet screening av kjemiske forbindelser3. Derfor, i den tidlige fasen av stoffet utvikling, det ville være svært gunstig å bruke en metode som raskt kan evaluere sikkerhet og toksisitet av forbindelsene i en passende modell. Det er flere protokoller som har blitt brukt for toksisitet screening av kjemiske forbindelser som involverer dyr og cellekultur modeller, men det er ikke en enkelt protokoll som er validert og er i felles bruk4,5. Eksisterende protokoller som bruker sebrafisk varierer i lengde og har blitt brukt av individuelle forskere som evaluerte toksisitet som per deres bekvemmelighet kravet6,7,8,9, 10 andre , 11 flere , Det er 12.
I den siste tiden har sebrafisk dukket opp som en praktisk modell for evaluering av toksisitet av kjemiske forbindelser under embryonale utviklingen6,7. Sebrafisk har mange innebygde fordeler for evalueringen av kjemiske forbindelser13. Selv store eksperimenter er mottagelig, som en sebrafisk kvinne kan legge grupper av 200-300 egg, som utvikler raskt ex vivo, trenger ikke ekstern fôring i opptil en uke og er gjennomsiktige. Forbindelsene kan legges direkte i vannet, hvor de kan (avhengig av arten av sammensatte) diffus gjennom chorionic, og etter klekking, gjennom huden, gjellene og munningen av larver. Eksperimentene krever ikke store mengder kjemiske forbindelser14 på grunn av den lille størrelsen på fosteret. Utvikle sebrafisk embryo uttrykker det meste av proteiner som kreves for å oppnå normal utviklingsmessige utfallet. Derfor er et sebrafisk embryo en følsom modell for å vurdere om et potensielt legemiddel kan forstyrre funksjonen til et protein eller signaliserer molekyl som er developmentally signifikant. Organene i sebrafisk blir funksjonelle mellom 2-5 DPF15, og forbindelser som er giftige i løpet av denne sensitive perioden av embryonale utviklingen induserer fenotypiske defekter i sebrafisk larver. Disse fenotypiske endringene kan lett oppdages ved hjelp av et enkelt mikroskop uten invasive teknikker11. Sebrafisk embryo er mye brukt i toksikologiske undersøkelser på grunn av deres mye større biologisk kompleksitet sammenlignet med in vitro Drug screening ved hjelp av cellekultur modeller16,17.  Som virveldyr, genetisk og fysiologiske makeup av sebrafisk er sammenlignbare med mennesker og dermed toksisitet av kjemiske forbindelser er lik mellom sebrafisk og mennesker8,18,19, 20 priser og , 21 priser og , 22. sebrafisk er således et verdifullt redskap i den tidlige fasen av narkotika funnet for evalueringen av toksisitet og sikkerheten til de kjemiske forbindelsene.
I denne artikkelen gir vi en detaljert beskrivelse av metoden som brukes for å evaluere sikkerhet og toksisitet av Karbons karboanhydrasehemmere (CA) inhibitor forbindelser med 1-5-dagers post befruktning (DPF) sebrafisk embryo av en enkelt forsker. Protokollen innebærer å utsette sebrafisk embryo til ulike konsentrasjoner av kjemisk inhibitor forbindelser og studere dødelighet og fenotypiske endringer i løpet av embryoutvikling. På slutten av eksponeringen til kjemiske forbindelser, er LC50 dose av kjemiske bestemmes. Metoden gjør det mulig for en person å utføre effektiv screening av 1-5 test forbindelser og tar ca 8-10 h avhengig av opplevelsen av personen med metoden (figur 1). Hvert av trinnene som kreves for å vurdere toksisitet av forbindelsene er skissert i figur 2. Evalueringen av toksisitet av CA-hemmere krever 8 dager, og omfatter oppsett av parring par (dag 1); samling av embryo fra avl tanker, rengjøring og overføre dem til 28,5 ° c inkubator (dag 2); distribusjon av embryo inn i brønnene av en 24-brønn plate og tillegg av utvannet CA inhibitor forbindelser (dag 3); fenotypiske analyse og bilde av larver (dag 4-8), og bestemmelse av LC50 dose (day8).  Denne metoden er rask og effektiv, krever en liten mengde av den kjemiske forbindelsen og bare grunnleggende fasiliteter i laboratoriet.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:972px;" width="972">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:342px;">24-well plates</td>
			<td style="width:185px;">Nunc</td>
			<td style="width:260px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:185px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:342px;">Balance (Weighing scale)</td>
			<td style="width:185px;">KERN</td>
			<td style="width:260px;">PLJ3000-2CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:342px;">Balance (Weighing scale)</td>
			<td style="width:185px;">Mettler Toledo</td>
			<td style="width:260px;">AB104-S/PH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:342px;">CaCl2</td>
			<td style="width:185px;">JT.Baker</td>
			<td style="width:260px;">RS421910024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:342px;">Disecting Probe</td>
			<td style="width:185px;">Thermo Scientific</td>
			<td>17-467-604&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:342px;">DMSO</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich, Germany</td>
			<td style="width:260px;">D4540</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:342px;">Falcon tubes 15 mL</td>
			<td style="width:185px;">Greiner bio-one</td>
			<td style="width:260px;">188271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:342px;">High molecular weight methylcellulose</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich, Germany</td>
			<td style="width:260px;">M0262&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:342px;">Incubator for zebrafish larvae</td>
			<td style="width:185px;">Termaks</td>
			<td style="width:260px;">B8000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:342px;">KCL</td>
			<td style="width:185px;">Merck</td>
			<td style="width:260px;">1.04936.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:342px;">Methyl Blue</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich, Germany</td>
			<td style="width:260px;">28983-56-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:342px;">MgSO4</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich, Germany</td>
			<td style="width:260px;">M7506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:342px;">Microcentrifuge tubes</td>
			<td style="width:185px;">Starlab</td>
			<td style="width:260px;">S1615-5500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:342px;">NaCl</td>
			<td style="width:185px;">VWR Chemicals</td>
			<td style="width:260px;">27810.295</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:342px;">Paraffin Histoplast IM</td>
			<td style="width:185px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:260px;">8331</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:342px;">Pasteur pipette&#160;</td>
			<td style="width:185px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:260px;">86.1171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:342px;">Petri dish</td>
			<td style="width:185px;">Thermo Scientific</td>
			<td>101R20&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:342px;">Petri plates</td>
			<td style="width:185px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:260px;">82.1473</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:342px;">Pipette (1 mL and 200 &#956;L)</td>
			<td style="width:185px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:260px;">4641230N, 4641210N&#160;&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:342px;">Plates 24-Well</td>
			<td style="width:185px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:260px;">142485</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:342px;">Steriomicroscope/Camera</td>
			<td style="width:185px;">Zeiss</td>
			<td style="width:260px;">Stemi 2000-C/Axiocam 105 color</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:342px;">Vials (1.5 mL)</td>
			<td style="width:185px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:260px;">11569914</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:342px;">Zebrafish AB strains</td>
			<td style="width:185px;">ZIRC&#160;</td>
			<td style="width:260px;">&#160; ZL1&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid evaluation of toxicity of chemical compounds using zebrafish embryos

Sebrafisk er en mye brukt virveldyr modell organisme for sykdommen og fenotype-baserte narkotika funn. Sebrafisk genererer mange avkom, har transparent embryo og rask ekstern utvikling. Sebrafisk embryo kan derfor også brukes til rask evaluering av toksisitet av legemidler som er dyrebare og tilgjengelige i små mengder. I denne artikkelen er en metode for effektiv screening av toksisitet av kjemiske forbindelser med 1-5-dagers post befruktning embryo beskrevet. Embryo overvåkes av stereomikroskopet å undersøke fenotypiske defekter forårsaket av eksponering for ulike konsentrasjoner av forbindelser. Halv-maksimal dødelige konsentrasjoner (LC50) av forbindelsene er også bestemt. Den nåværende studien krevde 3-6 mg av en inhibitor sammensatt, og hele eksperimentet tar ca 8-10 h skal fylles ut av en person i et laboratorium har grunnleggende fasiliteter. Den nåværende protokollen er egnet for å teste alle sammensatte å identifisere uutholdelig giftig eller off-Target effekter av sammensatt i den tidlige fasen av stoffet funnet og å oppdage subtile toksiske effekter som kan være savnet i cellen kultur eller andre dyremodeller. Metoden reduserer prosessuelle forsinkelser og kostnader ved narkotika utvikling.

Den kritiske delen av evalueringen av toksisitet er å teste ulike konsentrasjoner av en eller flere kjemiske forbindelser i et enkelt eksperiment. I begynnelsen, Velg forbindelsene for evaluering av toksisitet, antall konsentrasjoner å teste for hver sammensatte, og følgelig lage et diagram (Figur 3). Vi brukte en unik farge for hver sammensatte å organisere prøvene (Figur 3). Bruk av løsemiddelbestandig markør og merking ...

Watch this Scientific Journal Video about Rapid Evaluation of Toxicity of Chemical Compounds Using Zebrafish Embryos at JoVE.com

Rapid Evaluation of Toxicity of Chemical Compounds Using Zebrafish Embryos

Sebrafisk embryo brukes for å evaluere toksisitet av kjemiske forbindelser. De utvikler seg eksternt og er følsomme for kjemikalier, slik at påvisning av subtile fenotypiske endringer. Eksperimentet krever bare en liten mengde sammensatte, som er direkte lagt til platen som inneholder embryo, noe som gjør testingen systemet effektiv og kostnadseffektiv.

Rask evaluering av toksisitet av kjemiske forbindelser bruke sebrafisk embryo

The zebrafish is a widely used vertebrate model organism for the disease and phenotype-based drug discovery. The zebrafish generates many offspring, has ...

Toksisitetstestprosedyrene vil bli demonstrert av Dr.Ashok Aspatwar, en seniorforsker fra laboratoriet mitt. Vår protokoll identifiserer off-target effekter og oppdager subtile toksiske effekter av kjemikalier i den tidlige fasen av oppdagelsen som kan gå glipp av i cellekultur eller andre dyremodeller. De viktigste fordelene med vår teknikk er: det er raskt og effektivt, krever svært liten mengde kjemisk, og de grunnleggende fasilitetene i laboratoriet.Toksisitetsscreening vil hjelpe oss med å bestemme konsentrasjonen for å studere effektiviteten mot mykobakterie som forårsaker tuberkulose og for videre preklinisk beregning. Denne metoden bruker innsikt i off-target effekter av kjemikalier, og dermed denne metoden kan brukes i alle områder av forskning der toksisitet av kjemiske er av primær betydning. Denne metoden er veldig enkel og kan utføres av noen uten forutgående erfaring.Personer uten erfaring bør planlegge eksperimentet nøye og bruke bare en forbindelse. Denne metoden gir toksiske effekter av kjemikaliene i form av fenotypiske endringer i de utviklende sebrafiskembryoene og dermed sikkerheten til forbindelsene som er testet. Til å begynne med plasserer du to til fem voksne hann sebrafisk og tre til fem voksne kvinnelige sebrafisk i parringstanker over natten.Om morgenen slår du på lyset etter hvert som avl induseres av den automatiske mørke og påfølgende lyssyklusen. For å unngå å håndtere stress til dyrene, la dyrene hvile i to uker før du bruker de samme personene til avl. Neste dag før middag samler du embryoene ved hjelp av en finmasket sil, og overfør dem til en petriskål som inneholder E3 embryomedium.Plasser petriskålen under et stereomikroskop for å undersøke hver gruppe embryoer. Identifiser det ugjennomsiktige utseendet og fjern dem som ufruktbare eller døde embryoer. Hold embryoene på 28,5 grader Celsius i en inkubator over natten.Neste morgen, undersøk embryoene under et stereomikroskop og fjern eventuelle usunne eller døde embryoer. Bruk forsiktig en pasteurpipette for å overføre ett embryo til hver brønn av en 24 brønnplate. Pass på at hver brønn inneholder nok E3 medium til å dekke embryoene.Ta ut hetteglassene som inneholder inhibitorforbindelser som er lagret ved 4 grader Celsius i kjøleskap. Bruk en analytisk balanse for å veie riktig mengde av forbindelsen, og forberede 250 mikroliter på 100 millimolar lagerløsning for hver forbindelse i E3 medium eller et annet passende løsningsmiddel. Deretter bruker du E3 medium til å lage seriell fortynning av lagerløsningene basert på toksisitetsnivåer i 15 milliliter sentrifugerør.Fra brønnene som hver inneholder ett DPF-embryo, bruk en pasteurpipette og 1 milliliter pipette for å fjerne E3-vannet én rad om gangen. Fordel umiddelbart 1 milliliter av hvert fortynningsmiddel av lagerløsningene i brønnene på 24-brønnplaten fra lavere og beveger seg til høyere konsentrasjon. For kontrollgruppene, tilsett E3 vann eller et annet relevant løsningsmiddel.Merk 24 brønnplater med navnet og konsentrasjonen av forbindelsen og hold platene på 28,5 grader Celsius i en inkubator. Vær forsiktig så fortynnende av kjemikaliene i brønnene ikke fordampes i inkubatoren ved å forsegle sidene av 24 brønnplate. Tjuefire timer etter eksponering av de kjemiske forbindelsene, bruk en pasteurpipett for å overføre larver utsatt for hver konsentrasjon av forbindelsen i en liten petriskål som inneholder 3% høy molekylvektmetylcellulose.Legg den sidelengs med en metallsonde. Plasser petriskålen under et stereomikroskop festet til et kamera. Ta bildene, og lagre bildene i en egen mappe hver dag til slutten av eksperimentet.Skriv inn alle observasjonene i en tabell hver dag enten i en elektronisk tabell eller på et utskrevet ark. For nevrotoksisk sammensatt eksponering kan de fire til fem DPF larver vise unormal svømmemønster. I så fall gjør du en oversikt over slike endringer ved å fange en kort 30 sekunder til ett minutts video av larver.Etter fem dager med eksponering for de kjemiske forbindelsene, legg merke til konsentrasjonen der halvparten av embryoene dør som halvparten maksimal dødelig konsentrasjon 50 av hvert kjemikalie. Konstruer en kurve for dødelighet av embryoer for alle konsentrasjoner ved hjelp av et passende program. I denne protokollen tester den kritiske delen av evalueringen av toksisitet ulike konsentrasjoner av en eller flere kjemiske forbindelser i et enkelt eksperiment.For forbindelsene som induserer fenotypiske defekter i larver, ble feilene registrert hver 24. Embryoene behandlet med beta CA-hemmere ved konsentrasjonene av 250 mikromolar og 125 mikromolar viser ulike fenotypiske defekter sammenlignet med kontrollen. For eksempel, uhatede embryoer selv på dag 3, buet kroppsstruktur, uutnyttet eggeplommesek og perikardødem, og fravær av otolittsekker i larver på fem dager etter behandling.I en annen studie viste embryoene behandlet med CA-hemmere fraværet av otolittsekker og svømmeblære. Forsøkene identifiserte en representativ sammensatt karbonanhydrase 9, som induserte minimale eller ingen fenotypiske endringer under embryonal utvikling ved 500 mikromolar. Forbindelsen viste en høy LC50 konsentrasjon.Men i en sammenligning med en kontroll ble den samme forbindelsen ved 300 mikromolar funnet å være nevrotoksisk og indusert ataksi i larver etter fem dagers eksponering. God kvalitet på embryoer er viktig for toksisitetsscreening av kjemikalier. For å oppnå embryoer av god kvalitet, bruk unge par voksne sebrafisk til avl.Forbindelsene som fremstår som trygge kan være ytterligere preget av å utføre relevante in vitro- og in vivo-eksperimenter. Innen utvikling av antituberkulose bidro denne teknikken til å sette opp ytterligere eksperimenter for in vivo hemming av mycobacterium marinum i sebrafiskembryoer. Protokollen innebærer bruk av kjemikalier som kan være giftige for mennesker.Personer som er involvert i forsøkene bør være skikkelig forsiktige når de håndterer kjemikaliene.

Research

JoVE Journal

Medicine

Evaluation of Nanoparticle Uptake in Tumors in Real Time Using Intravital Imaging

Current technologies for tumor imaging, such as ultrasound, MRI, PET and CT, are unable to yield high-resolution images for the assessment of nanoparticle ...

Accurate and Simple Evaluation of Vascular Anastomoses in Monochorionic Placenta using Colored Dye

The presence of placental vascular anastomoses is a conditio sine qua non for the development of twin-to-twin transfusion syndrome (TTTS) and twin anemia ...

Induction of Myocardial Infarction in Adult Zebrafish Using Cryoinjury

Induksjon av hjerteinfarkt hos Adult sebrafisk Bruke Cryoinjury

The mammalian heart is incapable of significant regeneration following an acute injury such as myocardial infarction1. By contrast, urodele amphibians and ...

The &alpha;-test: Rapid Cell-free CD4 Enumeration Using Whole Saliva

The ÃƒÅ½Ã‚Â±-test: Rapid Cell-free CD4 Enumeration Using Whole Saliva

Den α-test: Rapid Cell-free CD4 Enumeration Bruke Hele Spytt

There is an urgent need for affordable CD4 enumeration to monitor HIV disease. CD4 enumeration is out of reach in resource-limited regions due to the time ...

Screening for Melanoma Modifiers using a Zebrafish Autochthonous Tumor Model

Screening for Melanom Modifiers ved hjelp av en Sebrafisk stedegen Tumor Model

Genomic studies of  human cancers have yielded a wealth of information about genes that are altered  in tumors1,2,3. A challenge arising from these ...

Chemotherapy-induced Vascular Toxicity - Real-time In vivo Imaging of Vessel Impairment

Chemotherapy-induced Vascular Toxicity - Real-time In vivo Imaging of Vessel Impairment

Cytostatikaindusert Vaskulær Toxicity - Real-time<em&gt; In vivo</em&gt; Imaging av Vessel Nedskrivning

Certain classes of chemotherapies may exert acute vascular changes that may progress into long-term conditions that may predispose the patient to an ...

Quantification of the Immunosuppressant Tacrolimus on Dried Blood Spots Using LC-MS/MS

Kvantifisering av den immunsuppressive Tacrolimus på tørket blod Spots Bruke LC-MS / MS

The calcineurin inhibitor tacrolimus is the cornerstone of most immunosuppressive treatment protocols after solid organ transplantation in the United ...

Diffuse Optical Spectroscopy for the Quantitative Assessment of Acute Ionizing Radiation Induced Skin Toxicity Using a Mouse Model

Diffuse optisk spektroskopi for kvantitativ vurdering av akutt Ioniserende stråling Induced Skin Toxicity bruke en mus modell

Acute skin toxicities from ionizing radiation (IR) are a common side effect from therapeutic courses of external beam radiation therapy (RT) and ...

Solubility of Hydrophobic Compounds in Aqueous Solution Using Combinations of Self-assembling Peptide and Amino Acid

Løseligheten av hydrofobe forbindelser i vandig løsning ved hjelp av kombinasjoner av selvstendig montering peptid og aminosyre

Self-assembling peptides (SAPs) are promising vehicles for the delivery of hydrophobic therapeutics for clinical applications; their amphipathic ...

Evaluation of Cerebral Blood Flow Autoregulation in the Rat Using Laser Doppler Flowmetry

Evaluering av cerebral Blood Flow Autoregulation i Rat bruke laser Doppler Flowmetry

When investigating the body&#39;s mechanisms for regulating cerebral blood flow, a relative measurement of microcirculatory blood flow can be obtained ...