Name: rapid evaluation of toxicity of chemical compounds using zebrafish embryos
Uploaded: 2019-08-25T14:00:00
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O trabalho foi apoiado por subsídios da Fundação Sigrid Juselius (SP, MP), da Fundação Cultural finlandesa (AA, MH), da Academia da Finlândia (SP, MP), da Fundação Orion Farmos (MH), da Fundação Tampere tuberculosis (SP, MH e MP) e da Fundação Jane e Aatos Erkko (SP e MP ). Agradecemos aos nossos colaboradores italianos e franceses, Prof. Supuran, e ao Prof. Winum, por fornecer inibidores de anidrase carbônica para avaliação de segurança e toxicidade para fins de desenvolvimento de drogas ANTITUBERCULOSE e anticancerígenos. Agradecemos a Aulikki Lehmus e Marianne Kuuslahti pela assistência técnica. Agradecemos também Leena Mäkinen e Hannaleena Piippo por sua ajuda com a criação de zebrafish e coleta de embriões. Agradecemos sinceramente Harlan Barker para a avaliação crítica do manuscrito e comentários perspicazes.

A unidade principal da zebrafish na Universidade de Tampere tem uma autorização de estabelecimento concedida pelo Conselho Nacional de experimentação animal (ESAVI/7975/04.10.05/2016). Todos os experimentos com embriões de zebrafish foram realizados de acordo com o governo provincial da Finlândia Oriental, departamento social e de saúde do protocolo da unidade de serviço regional de Tampere # LSLH-2007-7254/YM-23.
1. criação de tanques de acasalamento zebrafish overnight
<ol><li>Co...

<ol>
	<li>Amaouche, N., Casaert Salome, H., Collignon, O., Santos, M. R., Ziogas, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Marketing+authorization+applications+submitted+to+the+European+Medicines+Agency+by+small+and+medium-sized+enterprises:+an+analysis+of+major+objections+and+their+impact+on+outcomes.">Marketing authorization applications submitted to the European Medicines Agency by small and medium-sized enterprises: an analysis of major objections and their impact on outcomes.</a> Drug Discovery Today. 23 (10), 1801-1805 (2018).</li><li>Garg, R. C., Bracken, W. M., Hoberman, A. M., Gupta, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reproductive+and+developmental+safety+evaluation+of+new+pharmaceutical+compounds.">Reproductive and developmental safety evaluation of new pharmaceutical compounds.</a> Reproductive and Developmental Toxicology. , 89-109 (2011).</li><li>Lee, H. Y., Inselman, A. L., Kanungo, J., Hansen, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+models+in+developmental+toxicology.">Alternative models in developmental toxicology.</a> Systems Biology in Reproductive Medicine. 58 (1), 10-22 (2012).</li><li>Gao, G., Chen, L., Huang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-cancer+drug+discovery:+update+and+comparisons+in+yeast,+Drosophila,+and+zebrafish.">Anti-cancer drug discovery: update and comparisons in yeast, Drosophila, and zebrafish.</a> Current Molecular Pharmacology. 7 (1), 44-51 (2014).</li><li>Brown, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+of+test+chemicals+for+the+ECVAM+international+validation+study+on+in+vitro+embryotoxicity+tests.+European+Centre+for+the+Validation+of+Alternative+Methods.">Selection of test chemicals for the ECVAM international validation study on in vitro embryotoxicity tests. European Centre for the Validation of Alternative Methods.</a> Alternatives to Laboratory Animals. 30 (2), 177-198 (2002).</li><li>Selderslaghs, I. W., Van Rompay, A. R., De Coen, W., Witters, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+screening+assay+to+identify+teratogenic+and+embryotoxic+chemicals+using+the+zebrafish+embryo.">Development of a screening assay to identify teratogenic and embryotoxic chemicals using the zebrafish embryo.</a> Reproductive Toxicology. 28 (3), 308-320 (2009).</li><li>Brannen, K. C., Panzica-Kelly, J. M., Danberry, T. L., Augustine-Rauch, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+zebrafish+embryo+teratogenicity+assay+and+quantitative+prediction+model.">Development of a zebrafish embryo teratogenicity assay and quantitative prediction model.</a> Birth Defects Research Part B Developmental and Reproductive Toxicology. 89 (1), 66-77 (2010).</li><li>Hermsen, S. A., van den Brandhof, E. J., van der Ven, L. T., Piersma, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relative+embryotoxicity+of+two+classes+of+chemicals+in+a+modified+zebrafish+embryotoxicity+test+and+comparison+with+their+in+vivo+potencies.">Relative embryotoxicity of two classes of chemicals in a modified zebrafish embryotoxicity test and comparison with their in vivo potencies.</a> Toxicology in Vitro. 25 (3), 745-753 (2011).</li><li>Lessman, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+developing+zebrafish+(Danio+rerio):+a+vertebrate+model+for+high-throughput+screening+of+chemical+libraries.">The developing zebrafish (Danio rerio): a vertebrate model for high-throughput screening of chemical libraries.</a> Birth Defects Research. Part C, Embryo Today: Reviews. 93 (3), 268-280 (2011).</li><li>Lantz-McPeak, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+toxicity+assay+using+high+content+screening+of+zebrafish+embryos.">Developmental toxicity assay using high content screening of zebrafish embryos.</a> Journal of Applied Toxicology. 35 (3), 261-272 (2015).</li><li>Truong, L., Harper, S. L., Tanguay, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+embryotoxicity+using+the+zebrafish+model.">Evaluation of embryotoxicity using the zebrafish model.</a> Methods in Molecular Biology. 691, 271-279 (2011).</li><li>Rodrigues, G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design,+synthesis,+and+evaluation+of+hydroxamic+acid+derivatives+as+promising+agents+for+the+management+of+Chagas+disease.">Design, synthesis, and evaluation of hydroxamic acid derivatives as promising agents for the management of Chagas disease.</a> Journal of Medicinal Chemistry. 57 (2), 298-308 (2014).</li><li>Kanungo, J., Cuevas, E., Ali, S. F., Paule, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+model+in+drug+safety+assessment.">Zebrafish model in drug safety assessment.</a> Current Pharmaceutical Design. 20 (34), 5416-5429 (2014).</li><li>Peterson, R. T., Link, B. A., Dowling, J. E., Schreiber, S. 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C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+as+a+model+system+to+study+cardiovascular+development.">The zebrafish as a model system to study cardiovascular development.</a> Trends in Cardiovascular Medicine. 4 (5), 207-212 (1994).</li><li>Aspatwar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitroimidazole-based+inhibitors+DTP338+and+DTP348+are+safe+for+zebrafish+embryos+and+efficiently+inhibit+the+activity+of+human+CA+IX+in+Xenopus+oocytes.">Nitroimidazole-based inhibitors DTP338 and DTP348 are safe for zebrafish embryos and efficiently inhibit the activity of human CA IX in Xenopus oocytes.</a> Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry. 33 (1), 1064-1073 (2018).</li><li>Rami, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia-targeting+carbonic+anhydrase+IX+inhibitors+by+a+new+series+of+nitroimidazole-sulfonamides/sulfamides/sulfamates.">Hypoxia-targeting carbonic anhydrase IX inhibitors by a new series of nitroimidazole-sulfonamides/sulfamides/sulfamates.</a> Journal of Medicinal Chemistry. 56 (21), 8512-8520 (2013).</li><li>Spitsbergen, J. M., Kent, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+state+of+the+art+of+the+zebrafish+model+for+toxicology+and+toxicologic+pathology+research--advantages+and+current+limitations.">The state of the art of the zebrafish model for toxicology and toxicologic pathology research--advantages and current limitations.</a> Toxicologic Pathology. , 62-87 (2003).</li><li>Teraoka, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+cytochrome+P450+1A+is+required+for+circulation+failure+and+edema+by+2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin+in+zebrafish.">Induction of cytochrome P450 1A is required for circulation failure and edema by 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin in zebrafish.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 304 (2), 223-228 (2003).</li><li>Zon, L. I., Peterson, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+drug+discovery+in+the+zebrafish.">In vivo drug discovery in the zebrafish.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 4 (1), 35-44 (2005).</li><li>Hill, A. J., Teraoka, H., Heideman, W., Peterson, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+as+a+model+vertebrate+for+investigating+chemical+toxicity.">Zebrafish as a model vertebrate for investigating chemical toxicity.</a> Toxicological Sciences. 86 (1), 6-19 (2005).</li><li>Kari, G., Rodeck, U., Dicker, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish:+an+emerging+model+system+for+human+disease+and+drug+discovery.">Zebrafish: an emerging model system for human disease and drug discovery.</a> Clinical Pharmacology and Therapeutics. 82 (1), 70-80 (2007).</li><li>Gourmelon, A., Delrue, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+in+Support+of+Internationally+Harmonised+OECD+Test+Guidelines+for+Assessing+the+Safety+of+Chemicals.">Validation in Support of Internationally Harmonised OECD Test Guidelines for Assessing the Safety of Chemicals.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 856, 9-32 (2016).</li><li>Aspatwar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=beta-CA-specific+inhibitor+dithiocarbamate+Fc14-584B:+a+novel+antimycobacterial+agent+with+potential+to+treat+drug-resistant+tuberculosis.">beta-CA-specific inhibitor dithiocarbamate Fc14-584B: a novel antimycobacterial agent with potential to treat drug-resistant tuberculosis.</a> Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry. 32 (1), 832-840 (2017).</li><li>Kazokaite, J., Aspatwar, A., Kairys, V., Parkkila, S., Matulis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorinated+benzenesulfonamide+anticancer+inhibitors+of+carbonic+anhydrase+IX+exhibit+lower+toxic+effects+on+zebrafish+embryonic+development+than+ethoxzolamide.">Fluorinated benzenesulfonamide anticancer inhibitors of carbonic anhydrase IX exhibit lower toxic effects on zebrafish embryonic development than ethoxzolamide.</a> Drug and Chemical Toxicology. 40 (3), 309-319 (2017).</li><li>Howe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+reference+genome+sequence+and+its+relationship+to+the+human+genome.">The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome.</a> Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).</li><li>Granato, M., Nusslein-Volhard, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fishing+for+genes+controlling+development.">Fishing for genes controlling development.</a> Current Opinion in Genetics &amp; Development. 6 (4), 461-468 (1996).</li><li>Bambino, K., Chu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+in+Toxicology+and+Environmental+Health.">Zebrafish in Toxicology and Environmental Health.</a> Current Topics in Developmental Biology. 124, 331-367 (2017).</li><li>Goldsmith, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+as+a+pharmacological+tool:+the+how,+why+and+when.">Zebrafish as a pharmacological tool: the how, why and when.</a> Current Opinion in Pharmacology. 4 (5), 504-512 (2004).</li></ol>

O teste de toxicidade in vitro utilizando células cultivadas pode detectar a sobrevivência e os estudos morfológicos das células que fornecem informações limitadas sobre a toxicidade induzida pelo composto de teste. A vantagem da seleção da toxicidade de compostos químicos que usam embriões do zebrafish é deteção rápida de mudanças fenotípicas quimicamente induzidas em um animal inteiro durante o desenvolvimento embrionário em um organismo modelo relevante. Aproximadamente 70% dos genes humanos ...

O desenvolvimento de drogas é um processo caro. Antes de um único composto químico é aprovado pela Food and Drug Administration (FDA) e Agência Europeia de medicamentos (EMA) vários milhares de compostos são rastreados a um custo de mais de 1.000.000.000 dólares1. Durante o desenvolvimento pré-clínico, a maior parte deste custo é necessária para o teste de animais2. Para limitar os custos, os pesquisadores no campo do desenvolvimento de fármacos necessitam de modelos alternativos para a triagem de segurança de compostos químicos3. Portanto, na fase inicial do desenvolvimento da droga, seria muito benéfico usar um método que possa avaliar rapidamente a segurança e a toxicidade dos compostos em um modelo adequado. Existem vários protocolos que têm sido utilizados para a triagem de toxicidade de compostos químicos envolvendo modelos de cultura animal e celular, mas não há um único protocolo que é validado e está em uso comum4,5. Protocolos existentes usando zebrafish variam de comprimento e têm sido utilizados por pesquisadores individuais que avaliaram a toxicidade de acordo com sua exigência de conveniência6,7,8,9, 10 de , 11 anos de , doze anos.
No passado recente, o zebrafish surgiu como um modelo conveniente para a avaliação da toxicidade de compostos químicos durante o desenvolvimento embrionário6,7. O zebrafish tem muitas vantagens incorporadas para a avaliação de compostos químicos13. Mesmo experimentos em grande escala são amenable, como uma fêmea zebrafish pode colocar lotes de 200-300 ovos, que se desenvolvem rapidamente ex vivo, não precisa de alimentação externa para até uma semana e são transparentes. Os compostos podem ser adicionados diretamente na água, onde podem (dependendo da natureza do composto) difusa através do Chorion, e após a eclosão, através da pele, brânquias e boca de larvas. Os experimentos não necessitam de quantidades copiosas de compostos químicos14 devido ao pequeno tamanho do embrião. O desenvolvimento de embriões de zebrafish expressa a maioria das proteínas necessárias para atingir o desfecho normal do desenvolvimento. Portanto, um embrião zebrafish é um modelo sensível para avaliar se um potencial fármaco pode perturbar a função de uma proteína ou molécula de sinalização que é desenvolvimental significativo. Os órgãos do zebrafish tornam-se funcionais entre 2-5 DPF15, e os compostos que são tóxicos durante este período sensível do desenvolvimento embrionário induzem defeitos fenotípicos em larvas do zebrafish. Estas mudanças fenotípicas podem prontamente ser detectadas usando um microscópio simples sem técnicas invasoras11. Os embriões de zebrafish são amplamente utilizados na pesquisa toxicológica devido à sua complexidade biológica muito maior em comparação com a triagem de fármacos in vitro utilizando modelos de cultura celular16,17.  Como um vertebrado, a composição genética e fisiológica de zebrafish é comparável aos seres humanos e, portanto, toxicidades de compostos químicos são semelhantes entre zebrafish e seres humanos8,18,19, 20 anos de , 21 anos de , 22. zebrafish é, portanto, uma ferramenta valiosa na fase inicial de descoberta de drogas para a avaliação da toxicidade e segurança dos compostos químicos.
No presente artigo, fornecemos uma descrição detalhada do método utilizado para avaliar a segurança e a toxicidade de compostos inibidores da anidrase carbônica (CA) usando embriões de zebrafish de 1-5 dias pós-fertilização (DPF) por um único pesquisador. O protocolo envolve expor embriões de zebrafish a diferentes concentrações de compostos inibidores químicos e estudar a mortalidade e as alterações fenotípicas durante o desenvolvimento embrionário. No final da exposição aos compostos químicos, a dose de LC50 do produto químico é determinada. O método permite que um indivíduo realize uma triagem eficiente de 1-5 compostos de teste e leva cerca de 8-10 h, dependendo da experiência da pessoa com o método (Figura 1). Cada uma das etapas necessárias para avaliar a toxicidade dos compostos é descrita na Figura 2. A avaliação da toxicidade dos inibidores da CA requer 8 dias, e inclui a criação de pares de acasalamento (dia 1); recolha de embriões de tanques reprodutores, limpeza e transferência para a incubadora de 28,5 ° c (dia 2); distribuição dos embriões nos poços de uma placa de 24 poços e adição de compostos inibidores de CA diluídos (dia 3); análise fenotípica e imagem de larvas (dia 4-8) e determinação da dose de LC50 (dia8).  Este método é rápido e eficiente, requer uma pequena quantidade do composto químico e apenas instalações básicas do laboratório.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:972px;" width="972">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:342px;">24-well plates</td>
			<td style="width:185px;">Nunc</td>
			<td style="width:260px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:185px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:342px;">Balance (Weighing scale)</td>
			<td style="width:185px;">KERN</td>
			<td style="width:260px;">PLJ3000-2CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:342px;">Balance (Weighing scale)</td>
			<td style="width:185px;">Mettler Toledo</td>
			<td style="width:260px;">AB104-S/PH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:342px;">CaCl2</td>
			<td style="width:185px;">JT.Baker</td>
			<td style="width:260px;">RS421910024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:342px;">Disecting Probe</td>
			<td style="width:185px;">Thermo Scientific</td>
			<td>17-467-604&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:342px;">DMSO</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich, Germany</td>
			<td style="width:260px;">D4540</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:342px;">Falcon tubes 15 mL</td>
			<td style="width:185px;">Greiner bio-one</td>
			<td style="width:260px;">188271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:342px;">High molecular weight methylcellulose</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich, Germany</td>
			<td style="width:260px;">M0262&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:342px;">Incubator for zebrafish larvae</td>
			<td style="width:185px;">Termaks</td>
			<td style="width:260px;">B8000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:342px;">KCL</td>
			<td style="width:185px;">Merck</td>
			<td style="width:260px;">1.04936.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:342px;">Methyl Blue</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich, Germany</td>
			<td style="width:260px;">28983-56-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:342px;">MgSO4</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich, Germany</td>
			<td style="width:260px;">M7506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:342px;">Microcentrifuge tubes</td>
			<td style="width:185px;">Starlab</td>
			<td style="width:260px;">S1615-5500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:342px;">NaCl</td>
			<td style="width:185px;">VWR Chemicals</td>
			<td style="width:260px;">27810.295</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:342px;">Paraffin Histoplast IM</td>
			<td style="width:185px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:260px;">8331</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:342px;">Pasteur pipette&#160;</td>
			<td style="width:185px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:260px;">86.1171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:342px;">Petri dish</td>
			<td style="width:185px;">Thermo Scientific</td>
			<td>101R20&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:342px;">Petri plates</td>
			<td style="width:185px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:260px;">82.1473</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:342px;">Pipette (1 mL and 200 &#956;L)</td>
			<td style="width:185px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:260px;">4641230N, 4641210N&#160;&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:342px;">Plates 24-Well</td>
			<td style="width:185px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:260px;">142485</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:342px;">Steriomicroscope/Camera</td>
			<td style="width:185px;">Zeiss</td>
			<td style="width:260px;">Stemi 2000-C/Axiocam 105 color</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:342px;">Vials (1.5 mL)</td>
			<td style="width:185px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:260px;">11569914</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:342px;">Zebrafish AB strains</td>
			<td style="width:185px;">ZIRC&#160;</td>
			<td style="width:260px;">&#160; ZL1&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid evaluation of toxicity of chemical compounds using zebrafish embryos

O zebrafish é um organismo modelo vertebrado extensamente usado para a descoberta da doença e do phenotype-baseado da droga. O zebrafish gera muitos descendentes, tem embriões transparentes e desenvolvimento externo rápido. Os embriões de zebrafish podem, conseqüentemente, ser usados igualmente para a avaliação rápida da toxicidade das drogas que são preciosas e disponíveis em quantidades pequenas. No presente artigo, descreve-se um método para a triagem eficiente da toxicidade de compostos químicos utilizando embriões de adubação pós-fertilização de 1-5 dias. Os embriões são monitorados por estereomicroscópio para investigar os defeitos fenotípicos causados pela exposição a diferentes concentrações de compostos. Concentrações letais semimáximas (LC50) dos compostos também são determinadas. O presente estudo exigiu 3-6 mg de um composto inibidor, e todo o experimento leva cerca de 8-10 h para ser completado por um indivíduo em um laboratório com instalações básicas. O protocolo atual é apropriado para testar todo o composto para identificar efeitos tóxicos ou fora-alvo intolerável do composto na fase adiantada da descoberta da droga e para detectar os efeitos tóxicos sutis que podem ser faltado na cultura de pilha ou em outros modelos animais. O método reduz os atrasos processuais e os custos do desenvolvimento de fármacos.

A parte crítica da avaliação da toxicidade é testar diferentes concentrações de um ou vários compostos químicos em um único experimento. No início, selecione os compostos para avaliação da toxicidade, o número de concentrações a testar para cada composto e, consequentemente, faça um gráfico (Figura 3). Utilizamos uma cor única para cada composto para organizar as amostras (Figura 3). O uso do marcador e da rotul...

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Rapid Evaluation of Toxicity of Chemical Compounds Using Zebrafish Embryos

Embriões de zebrafish são utilizados para avaliar a toxicidade de compostos químicos. Desenvolvem-se externamente e são sensíveis aos produtos químicos, permitindo a deteção de mudanças fenotípicas sutis. O experimento requer apenas uma pequena quantidade de composto, que é diretamente adicionado à placa contendo embriões, tornando o sistema de teste eficiente e rentável.

Avaliação rápida da toxicidade de compostos químicos usando embriões de zebrafish

The zebrafish is a widely used vertebrate model organism for the disease and phenotype-based drug discovery. The zebrafish generates many offspring, has ...

Os procedimentos de teste de toxicidade serão demonstrados pelo Dr. Ashok Aspatwar, um pesquisador sênior do meu laboratório. Nosso protocolo identifica efeitos fora do alvo e detecta efeitos tóxicos sutis de produtos químicos na fase inicial da descoberta que podem ser perdidos na cultura celular ou outros modelos animais. As principais vantagens de nossa técnica são: é rápida e eficiente, requer uma quantidade muito pequena de produtos químicos, e as instalações básicas do laboratório.O rastreamento de toxicidade nos ajudará a decidir a concentração para estudar sua eficiência contra a micobacterium que causa a tuberculose e para um cálculo pré-clínico. Este método utiliza insights sobre efeitos fora do alvo de produtos químicos e, portanto, este método pode ser usado em qualquer área de pesquisa onde a toxicidade da química é de importância primária. Este método é muito simples e pode ser realizado por qualquer pessoa sem experiência prévia.Indivíduos sem experiência devem planejar o experimento cuidadosamente e usar apenas um composto. Este método fornece efeitos tóxicos dos produtos químicos na forma de alterações fenotípicas nos embriões de zebrafish em desenvolvimento e, portanto, a segurança dos compostos testados. Para começar, coloque de dois a cinco zebrafish machos adultos e três a cinco zebrafish fêmeas adultas em tanques de acasalamento durante a noite.Pela manhã, acenda a luz à medida que a reprodução é induzida pelo ciclo automático de luz escura e subsequente. Para evitar o tratamento do estresse aos animais, permita que os animais descansem por duas semanas antes de usar os mesmos indivíduos para reprodução. No dia seguinte antes do meio-dia, colete os embriões usando um coador de malha fino, e transfira-os para uma placa de petri contendo meio de embrião E3.Coloque a placa de petri sob um microscópio estéreo para examinar cada lote de embriões. Identifique a aparência opaca e remova-as como embriões não fertilizados ou mortos. Mantenha os embriões a 28,5 graus Celsius em uma incubadora durante a noite.Na manhã seguinte, examine os embriões sob um microscópio estéreo e remova quaisquer embriões insalubres ou mortos. Use cuidadosamente uma pipeta pasteur para transferir um embrião para cada poço de uma placa de 24 poços. Certifique-se de que cada poço contém meio E3 suficiente para cobrir os embriões.Tire os frascos que contêm compostos inibidores armazenados a 4 graus Celsius em uma geladeira. Use um equilíbrio analítico para pesar a quantidade apropriada do composto e prepare 250 microliters de 100 mililitros de solução de estoque para cada composto em meio E3 ou outro solvente apropriado. Em seguida, use o meio E3 para fazer diluições seriais das soluções de estoque baseadas em níveis de toxicidade em tubos de centrífuga de 15 mililitros.Dos poços que cada um contém um embrião DPF, use uma pipeta pasteur e uma pipeta de 1 mililitro para remover a água E3 uma linha de cada vez. Distribua imediatamente 1 mililitro de cada diluído das soluções de estoque nos poços da placa de 24 poços a partir do baixo e movendo-se para maior concentração. Para os grupos de controle, adicione água E3 ou outro solvente relevante.Rotule 24 placas de poço com o nome e concentração do composto e mantenha as placas a 28,5 graus Celsius em uma incubadora. Tome cuidado para que os diluentes dos produtos químicos nos poços não seja evaporado na incubadora selando as laterais de 24 placas de poço. Vinte e quatro horas após a exposição dos compostos químicos, use uma pipeta pasteur para transferir as larvas expostas a cada concentração do composto em uma pequena placa de petri contendo celulose de metila de 3% de alto peso molecular.Com uma sonda de metal, coloque-a de lado. Coloque a placa de petri sob um microscópio estéreo ligado a uma câmera. Tire as imagens e salve as imagens em uma pasta separada a cada dia até o final do experimento.Digite todas as observações em uma tabela todos os dias, seja em uma mesa online ou em uma folha impressa. Para exposição a compostos neurotóxicos, as quatro a cinco larvas DPF podem mostrar padrão de natação anormal. Nesse caso, faça um registro de tais mudanças capturando um curto vídeo de 30 segundos a um minuto das larvas.Após cinco dias de exposição aos compostos químicos, note a concentração em que metade dos embriões morrem como a concentração letal meio máxima 50 de cada produto químico. Construa uma curva para mortalidade de embriões para todas as concentrações utilizando um programa adequado. Neste protocolo, a parte crítica da avaliação da toxicidade é testar diferentes concentrações de um ou múltiplos compostos químicos em um único experimento.Para os compostos que induzem quaisquer defeitos fenotípicos nas larvas, os defeitos foram registrados a cada 24 horas durante o período de um a cinco dias após a exposição ao produto químico. Os embriões tratados com inibidores beta CA nas concentrações de 250 micromolares e 125 micromolars apresentam vários defeitos fenotípicos em comparação com o controle. Por exemplo, embriões não-esques mesmo no dia 3, estrutura corporal curva, saco de gema não usado e edema pericárdico, e ausência de sacos de otolito nas larvas cinco dias após o tratamento.Em outro estudo, os embriões tratados com inibidores de CA mostraram a ausência de sacos de otolito e bexiga de natação. Os experimentos identificaram um composto representativo de anidrato 9, que induziu alterações fenotípicas mínimas ou não durante o desenvolvimento embrionário a 500 micromolar. O composto mostrou alta concentração de LC50.No entanto, em comparação com um controle, o mesmo composto em 300 micromolar foi encontrado como neurotóxico e induziu ataxia nas larvas após cinco dias de exposição. Boa qualidade dos embriões são importantes para a triagem de toxicidade de produtos químicos. Para obter embriões de boa qualidade, use um par jovem de zebrafish adulto para reprodução.Os compostos que emergem como seguros podem ser ainda mais caracterizados pela realização de experimentos in vitro e in vivo relevantes. No campo do desenvolvimento de drogas antituberculose, essa técnica ajudou a criar mais experimentos para incobadão in vivo de mycobacterium marinum em embriões de zebrafish. O protocolo envolve o uso de produtos químicos que podem ser tóxicos para os humanos.As pessoas envolvidas nos experimentos devem tomar os devidos cuidados ao manusear os produtos químicos.

Research

JoVE Journal

Medicine

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Avaliação de Captação de nanopartículas em tumores em tempo real usando imagens intravital

Current technologies for tumor imaging, such as ultrasound, MRI, PET and CT, are unable to yield high-resolution images for the assessment of nanoparticle ...

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The presence of placental vascular anastomoses is a conditio sine qua non for the development of twin-to-twin transfusion syndrome (TTTS) and twin anemia ...

Induction of Myocardial Infarction in Adult Zebrafish Using Cryoinjury

Indução de Infarto do Miocárdio em Zebrafish adultos usando Cryoinjury

The mammalian heart is incapable of significant regeneration following an acute injury such as myocardial infarction1. By contrast, urodele amphibians and ...

The &alpha;-test: Rapid Cell-free CD4 Enumeration Using Whole Saliva

The ÃƒÅ½Ã‚Â±-test: Rapid Cell-free CD4 Enumeration Using Whole Saliva

O α-teste: Rapid livre de células CD4 enumeração Utilizando saliva total

There is an urgent need for affordable CD4 enumeration to monitor HIV disease. CD4 enumeration is out of reach in resource-limited regions due to the time ...

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Triagem para Modificadores Melanoma usando um modelo de tumor Zebrafish autóctone

Genomic studies of  human cancers have yielded a wealth of information about genes that are altered  in tumors1,2,3. A challenge arising from these ...

Chemotherapy-induced Vascular Toxicity - Real-time In vivo Imaging of Vessel Impairment

Chemotherapy-induced Vascular Toxicity - Real-time In vivo Imaging of Vessel Impairment

Induzida pela quimioterapia Vascular Toxicidade - em tempo real<em&gt; In vivo</em&gt; Imagem de Impairment Vessel

Certain classes of chemotherapies may exert acute vascular changes that may progress into long-term conditions that may predispose the patient to an ...

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