Name: rapid evaluation of toxicity of chemical compounds using zebrafish embryos
Uploaded: 2019-08-25T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Rapid Evaluation of Toxicity of Chemical Compounds Using Zebrafish Embryos at JoVE.com

Работа была поддержана грантами Фонда Сигрида Джузелиуса (SP, MP), Финского культурного фонда (AA, MH), Академии Финляндии (SP, MP), Фонда Ориона Фармоса (MH), Фонда тампере туберкулеза (SP, MH и MP) и Фонда Джейн и Аатоса Эркко (SP and MP ). Мы благодарим наших итальянских и французских коллег, профессора Супурана и профессора Винама, за предоставление ингибиторов углеродной анигидраззы для оценки безопасности и токсичности для целей разработки противотуберкулезных и противораковых препаратов. Мы благодарим Ауликки Лемуса и Марианну Кууслахти за техническую помощь. Мы также благодарим Лину Мякинен и Ханналину Пииппо за помощь в разведении зебры и сборе эмбрионов. Мы искренне благодарим Харлана Баркера за критическую оценку рукописи и глубокие комментарии.

Основной объект "Зебрафиш" в Университете Тампере имеет разрешение на создание, выдаваемый Национальным советом по эксперименту на животных (ESAVI/7975/04.10.05/2016). Все эксперименты с использованием эмбрионов зебры проводились в соответствии с провинциальным правительством Восточной Финлян?...

<ol>
	<li>Amaouche, N., Casaert Salome, H., Collignon, O., Santos, M. R., Ziogas, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Marketing+authorization+applications+submitted+to+the+European+Medicines+Agency+by+small+and+medium-sized+enterprises:+an+analysis+of+major+objections+and+their+impact+on+outcomes.">Marketing authorization applications submitted to the European Medicines Agency by small and medium-sized enterprises: an analysis of major objections and their impact on outcomes.</a> Drug Discovery Today. 23 (10), 1801-1805 (2018).</li><li>Garg, R. C., Bracken, W. M., Hoberman, A. M., Gupta, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reproductive+and+developmental+safety+evaluation+of+new+pharmaceutical+compounds.">Reproductive and developmental safety evaluation of new pharmaceutical compounds.</a> Reproductive and Developmental Toxicology. , 89-109 (2011).</li><li>Lee, H. Y., Inselman, A. L., Kanungo, J., Hansen, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+models+in+developmental+toxicology.">Alternative models in developmental toxicology.</a> Systems Biology in Reproductive Medicine. 58 (1), 10-22 (2012).</li><li>Gao, G., Chen, L., Huang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-cancer+drug+discovery:+update+and+comparisons+in+yeast,+Drosophila,+and+zebrafish.">Anti-cancer drug discovery: update and comparisons in yeast, Drosophila, and zebrafish.</a> Current Molecular Pharmacology. 7 (1), 44-51 (2014).</li><li>Brown, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+of+test+chemicals+for+the+ECVAM+international+validation+study+on+in+vitro+embryotoxicity+tests.+European+Centre+for+the+Validation+of+Alternative+Methods.">Selection of test chemicals for the ECVAM international validation study on in vitro embryotoxicity tests. European Centre for the Validation of Alternative Methods.</a> Alternatives to Laboratory Animals. 30 (2), 177-198 (2002).</li><li>Selderslaghs, I. W., Van Rompay, A. R., De Coen, W., Witters, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+screening+assay+to+identify+teratogenic+and+embryotoxic+chemicals+using+the+zebrafish+embryo.">Development of a screening assay to identify teratogenic and embryotoxic chemicals using the zebrafish embryo.</a> Reproductive Toxicology. 28 (3), 308-320 (2009).</li><li>Brannen, K. C., Panzica-Kelly, J. M., Danberry, T. L., Augustine-Rauch, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+zebrafish+embryo+teratogenicity+assay+and+quantitative+prediction+model.">Development of a zebrafish embryo teratogenicity assay and quantitative prediction model.</a> Birth Defects Research Part B Developmental and Reproductive Toxicology. 89 (1), 66-77 (2010).</li><li>Hermsen, S. A., van den Brandhof, E. J., van der Ven, L. T., Piersma, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relative+embryotoxicity+of+two+classes+of+chemicals+in+a+modified+zebrafish+embryotoxicity+test+and+comparison+with+their+in+vivo+potencies.">Relative embryotoxicity of two classes of chemicals in a modified zebrafish embryotoxicity test and comparison with their in vivo potencies.</a> Toxicology in Vitro. 25 (3), 745-753 (2011).</li><li>Lessman, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+developing+zebrafish+(Danio+rerio):+a+vertebrate+model+for+high-throughput+screening+of+chemical+libraries.">The developing zebrafish (Danio rerio): a vertebrate model for high-throughput screening of chemical libraries.</a> Birth Defects Research. Part C, Embryo Today: Reviews. 93 (3), 268-280 (2011).</li><li>Lantz-McPeak, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+toxicity+assay+using+high+content+screening+of+zebrafish+embryos.">Developmental toxicity assay using high content screening of zebrafish embryos.</a> Journal of Applied Toxicology. 35 (3), 261-272 (2015).</li><li>Truong, L., Harper, S. L., Tanguay, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+embryotoxicity+using+the+zebrafish+model.">Evaluation of embryotoxicity using the zebrafish model.</a> Methods in Molecular Biology. 691, 271-279 (2011).</li><li>Rodrigues, G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design,+synthesis,+and+evaluation+of+hydroxamic+acid+derivatives+as+promising+agents+for+the+management+of+Chagas+disease.">Design, synthesis, and evaluation of hydroxamic acid derivatives as promising agents for the management of Chagas disease.</a> Journal of Medicinal Chemistry. 57 (2), 298-308 (2014).</li><li>Kanungo, J., Cuevas, E., Ali, S. F., Paule, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+model+in+drug+safety+assessment.">Zebrafish model in drug safety assessment.</a> Current Pharmaceutical Design. 20 (34), 5416-5429 (2014).</li><li>Peterson, R. T., Link, B. A., Dowling, J. E., Schreiber, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+molecule+developmental+screens+reveal+the+logic+and+timing+of+vertebrate+development.">Small molecule developmental screens reveal the logic and timing of vertebrate development.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (24), 12965-12969 (2000).</li><li>Stainier, D. Y., Fishman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+as+a+model+system+to+study+cardiovascular+development.">The zebrafish as a model system to study cardiovascular development.</a> Trends in Cardiovascular Medicine. 4 (5), 207-212 (1994).</li><li>Aspatwar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitroimidazole-based+inhibitors+DTP338+and+DTP348+are+safe+for+zebrafish+embryos+and+efficiently+inhibit+the+activity+of+human+CA+IX+in+Xenopus+oocytes.">Nitroimidazole-based inhibitors DTP338 and DTP348 are safe for zebrafish embryos and efficiently inhibit the activity of human CA IX in Xenopus oocytes.</a> Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry. 33 (1), 1064-1073 (2018).</li><li>Rami, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia-targeting+carbonic+anhydrase+IX+inhibitors+by+a+new+series+of+nitroimidazole-sulfonamides/sulfamides/sulfamates.">Hypoxia-targeting carbonic anhydrase IX inhibitors by a new series of nitroimidazole-sulfonamides/sulfamides/sulfamates.</a> Journal of Medicinal Chemistry. 56 (21), 8512-8520 (2013).</li><li>Spitsbergen, J. M., Kent, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+state+of+the+art+of+the+zebrafish+model+for+toxicology+and+toxicologic+pathology+research--advantages+and+current+limitations.">The state of the art of the zebrafish model for toxicology and toxicologic pathology research--advantages and current limitations.</a> Toxicologic Pathology. , 62-87 (2003).</li><li>Teraoka, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+cytochrome+P450+1A+is+required+for+circulation+failure+and+edema+by+2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin+in+zebrafish.">Induction of cytochrome P450 1A is required for circulation failure and edema by 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin in zebrafish.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 304 (2), 223-228 (2003).</li><li>Zon, L. I., Peterson, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+drug+discovery+in+the+zebrafish.">In vivo drug discovery in the zebrafish.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 4 (1), 35-44 (2005).</li><li>Hill, A. J., Teraoka, H., Heideman, W., Peterson, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+as+a+model+vertebrate+for+investigating+chemical+toxicity.">Zebrafish as a model vertebrate for investigating chemical toxicity.</a> Toxicological Sciences. 86 (1), 6-19 (2005).</li><li>Kari, G., Rodeck, U., Dicker, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish:+an+emerging+model+system+for+human+disease+and+drug+discovery.">Zebrafish: an emerging model system for human disease and drug discovery.</a> Clinical Pharmacology and Therapeutics. 82 (1), 70-80 (2007).</li><li>Gourmelon, A., Delrue, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+in+Support+of+Internationally+Harmonised+OECD+Test+Guidelines+for+Assessing+the+Safety+of+Chemicals.">Validation in Support of Internationally Harmonised OECD Test Guidelines for Assessing the Safety of Chemicals.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 856, 9-32 (2016).</li><li>Aspatwar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=beta-CA-specific+inhibitor+dithiocarbamate+Fc14-584B:+a+novel+antimycobacterial+agent+with+potential+to+treat+drug-resistant+tuberculosis.">beta-CA-specific inhibitor dithiocarbamate Fc14-584B: a novel antimycobacterial agent with potential to treat drug-resistant tuberculosis.</a> Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry. 32 (1), 832-840 (2017).</li><li>Kazokaite, J., Aspatwar, A., Kairys, V., Parkkila, S., Matulis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorinated+benzenesulfonamide+anticancer+inhibitors+of+carbonic+anhydrase+IX+exhibit+lower+toxic+effects+on+zebrafish+embryonic+development+than+ethoxzolamide.">Fluorinated benzenesulfonamide anticancer inhibitors of carbonic anhydrase IX exhibit lower toxic effects on zebrafish embryonic development than ethoxzolamide.</a> Drug and Chemical Toxicology. 40 (3), 309-319 (2017).</li><li>Howe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+reference+genome+sequence+and+its+relationship+to+the+human+genome.">The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome.</a> Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).</li><li>Granato, M., Nusslein-Volhard, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fishing+for+genes+controlling+development.">Fishing for genes controlling development.</a> Current Opinion in Genetics &amp; Development. 6 (4), 461-468 (1996).</li><li>Bambino, K., Chu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+in+Toxicology+and+Environmental+Health.">Zebrafish in Toxicology and Environmental Health.</a> Current Topics in Developmental Biology. 124, 331-367 (2017).</li><li>Goldsmith, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+as+a+pharmacological+tool:+the+how,+why+and+when.">Zebrafish as a pharmacological tool: the how, why and when.</a> Current Opinion in Pharmacology. 4 (5), 504-512 (2004).</li></ol>

Тест на токсичность in vitro с использованием культивированных клеток может обнаружить выживаемость и морфологические исследования клеток, предоставляющих ограниченную информацию о токсичности, индуцированной испытательным соединением. Преимуществом скрининга токсичности химич...

Разработка лекарств является дорогостоящим процессом. Прежде чем одно химическое соединение одобрено Пищевых продуктов и медикаментов (FDA) и Европейского агентства по лекарственным средствам (EMA) несколько тысяч соединений проверяются на сумму более одного миллиарда долларов1. Во время доклинической разработки, большая часть этой стоимости требуется для тестирования на животных2. Чтобы ограничить затраты, исследователям в области разработки лекарств необходимы альтернативныемодели для скрининга безопасности химических соединений 3. Поэтому на ранней стадии разработки препарата было бы очень полезно использовать метод, который может быстро оценить безопасность и токсичность соединений в подходящей модели. Есть несколько протоколов, которые были использованы для скрининга токсичности химических соединений с участием животных и клеточных моделей культуры, но нет ни одного протокола, который проверяется и является общим использованием4,5. Существующие протоколы с использованием зебры различаются по длине и былииспользованы отдельными исследователями, которые оценили токсичность в соответствии с их требованиями удобства 6,7,8,9, 10 Лет , 11 Год , 12.
В недавнем прошлом, зебрафиш стала удобной моделью для оценки токсичностихимических соединений во время эмбрионального развития 6,7. Зебрафиш имеет много встроенных преимуществ для оценки химических соединений13. Даже крупномасштабные эксперименты поддаются, так как самка зебры может откладывать партии по 200-300 яиц, которые быстро развиваются ex vivo,не нуждаются во внешнем кормлении до недели и прозрачны. Соединения могут быть добавлены непосредственно в воду, где они могут (в зависимости от характера соединения) диффундировать через хорион, и после вылупления, через кожу, жабры и рот личинок. Эксперименты не требуют большого количества химических соединений14 из-за небольшого размера эмбриона. Развитие эмбрионов зебры выражает большинство белков, необходимых для достижения нормального результата развития. Таким образом, эмбрион зебры является чувствительной моделью для оценки того, может ли потенциальный препарат нарушить функцию белка или сигнальной молекулы, которая имеет важное значение для развития. Органы зебры становятся функциональными между 2-5 dpf15, и соединения, которые являются токсичными в этот чувствительный период эмбрионального развития вызывают фенотипические дефекты в личинки зебры. Эти фенотипические изменения могут быть легко обнаружены с помощью простого микроскопа без инвазивных методов11. Эмбрионы зебрафиш широко используются в токсикологических исследованиях из-за их гораздо большей биологической сложности по сравнению с скринингом наркотиков in vitro с использованием моделей клеточной культуры16,17.  Как позвоночных, генетический и физиологический состав зебры сопоставим с человеком и, следовательно, токсичность химических соединений похожи между зебрафиши и людей8,18,19, 20 , 21 год , 22. Зебрафиш, таким образом, является ценным инструментом на ранней стадии открытия наркотиков для оценки токсичности и безопасности химических соединений.
В настоящей статье мы предоставляем подробное описание метода, используемого для оценки безопасности и токсичности соединений ингибитора углеродной анигидразы (CA) с использованием 1-5-дневного послеоплодного оплодотворения (dpf) эмбрионов зебры одним исследователем. Протокол включает в себя подвергая эмбрионы зебры различным концентрациям химических ингибиторных соединений и изучая смертность и фенотипические изменения во время эмбрионального развития. В конце воздействия химических соединений, LC50 доза химического вещества определяется. Метод позволяет человеку проводить эффективный скрининг 1-5 испытательных соединений и занимает около 8-10 ч в зависимости от опыта человека с методом(рисунок 1). Каждый из шагов, необходимых для оценки токсичности соединений, изложен на рисунке 2. Оценка токсичности ингибиторов ЦА требует 8 дней и включает в себя настройку спаривающихпар (день 1); сбор эмбрионов из резервуаров для размножения, очистка и перенос их в инкубатор 28,5 градуса по Цельсию (день 2); распределение эмбрионов в колодцы 24-колодца пластины и добавление разбавленных ингибиторных соединений CA (день 3); фенотипический анализ и визуализация личинок (день 4-8), а также определение дозы LC50 (день8).  Этот метод является быстрым и эффективным, требует небольшого количества химического соединения и только основные средства лаборатории.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:972px;" width="972">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:342px;">24-well plates</td>
			<td style="width:185px;">Nunc</td>
			<td style="width:260px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:185px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:342px;">Balance (Weighing scale)</td>
			<td style="width:185px;">KERN</td>
			<td style="width:260px;">PLJ3000-2CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:342px;">Balance (Weighing scale)</td>
			<td style="width:185px;">Mettler Toledo</td>
			<td style="width:260px;">AB104-S/PH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:342px;">CaCl2</td>
			<td style="width:185px;">JT.Baker</td>
			<td style="width:260px;">RS421910024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:342px;">Disecting Probe</td>
			<td style="width:185px;">Thermo Scientific</td>
			<td>17-467-604&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:342px;">DMSO</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich, Germany</td>
			<td style="width:260px;">D4540</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:342px;">Falcon tubes 15 mL</td>
			<td style="width:185px;">Greiner bio-one</td>
			<td style="width:260px;">188271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:342px;">High molecular weight methylcellulose</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich, Germany</td>
			<td style="width:260px;">M0262&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:342px;">Incubator for zebrafish larvae</td>
			<td style="width:185px;">Termaks</td>
			<td style="width:260px;">B8000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:342px;">KCL</td>
			<td style="width:185px;">Merck</td>
			<td style="width:260px;">1.04936.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:342px;">Methyl Blue</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich, Germany</td>
			<td style="width:260px;">28983-56-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:342px;">MgSO4</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich, Germany</td>
			<td style="width:260px;">M7506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:342px;">Microcentrifuge tubes</td>
			<td style="width:185px;">Starlab</td>
			<td style="width:260px;">S1615-5500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:342px;">NaCl</td>
			<td style="width:185px;">VWR Chemicals</td>
			<td style="width:260px;">27810.295</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:342px;">Paraffin Histoplast IM</td>
			<td style="width:185px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:260px;">8331</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:342px;">Pasteur pipette&#160;</td>
			<td style="width:185px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:260px;">86.1171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:342px;">Petri dish</td>
			<td style="width:185px;">Thermo Scientific</td>
			<td>101R20&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:342px;">Petri plates</td>
			<td style="width:185px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:260px;">82.1473</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:342px;">Pipette (1 mL and 200 &#956;L)</td>
			<td style="width:185px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:260px;">4641230N, 4641210N&#160;&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:342px;">Plates 24-Well</td>
			<td style="width:185px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:260px;">142485</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:342px;">Steriomicroscope/Camera</td>
			<td style="width:185px;">Zeiss</td>
			<td style="width:260px;">Stemi 2000-C/Axiocam 105 color</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:342px;">Vials (1.5 mL)</td>
			<td style="width:185px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:260px;">11569914</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:342px;">Zebrafish AB strains</td>
			<td style="width:185px;">ZIRC&#160;</td>
			<td style="width:260px;">&#160; ZL1&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid evaluation of toxicity of chemical compounds using zebrafish embryos

Зебрафиш является широко используемой позвоночной модели организма для болезни и фенотипа основе открытия наркотиков. Зебрафиш генерирует много потомства, имеет прозрачные эмбрионы и быстрое внешнее развитие. Таким образом, эмбрионы зебры могут также использоваться для быстрой оценки токсичности препаратов, которые являются ценными и доступны в небольших количествах. В настоящей статье описан метод эффективного скрининга токсичности химических соединений с использованием 1-5-дневных эмбрионов после оплодотворения. Эмбрионы контролируются стереомикроскопом для исследования фенотипических дефектов, вызванных воздействием различных концентраций соединений. Половина максимальных концентраций летальных (LC50) соединений также определены. Настоящее исследование требует 3-6 мг ингибиторного соединения, и весь эксперимент занимает около 8-10 ч, чтобы быть завершена человеком в лаборатории, имеющей основные средства. Текущий протокол подходит для тестирования любого соединения для выявления невыносимых токсичных или вне целевых эффектов соединения на ранней стадии обнаружения наркотиков и для обнаружения тонких токсических эффектов, которые могут быть пропущены в культуре клеток или других животных моделей. Метод сокращает процедурные задержки и затраты на разработку лекарств.

Важнейшей частью оценки токсичности является тестирование различных концентраций одного или нескольких химических соединений в рамках одного эксперимента. В начале, выберите соединения для оценки токсичности, количество концентраций для проверки для каждого соеди...

Watch this Scientific Journal Video about Rapid Evaluation of Toxicity of Chemical Compounds Using Zebrafish Embryos at JoVE.com

Rapid Evaluation of Toxicity of Chemical Compounds Using Zebrafish Embryos

Эмбрионы зебры используются для оценки токсичности химических соединений. Они развиваются внешне и чувствительны к химическим веществам, что позволяет обнаруживать тонкие фенотипические изменения. Эксперимент требует лишь небольшого количества соединения, которое непосредственно добавляется в пластину, содержащую эмбрионы, что делает систему тестирования эффективной и рентабельной.

Быстрая оценка токсичности химических соединений с использованием эмбрионов зебры

The zebrafish is a widely used vertebrate model organism for the disease and phenotype-based drug discovery. The zebrafish generates many offspring, has ...

Процедуры тестирования токсичности продемонстрируют доктор Ашок Аспатвар, старший научный сотрудник моей лаборатории. Наш протокол определяет внецелетворные эффекты и обнаруживает тонкие токсичные эффекты химических веществ на ранней стадии открытия, которые могут быть пропущены в клеточной культуре или других животных моделях. Основные преимущества нашей техники: она быстрая и эффективная, требует очень небольшого количества химических веществ, а также основных объектов в лаборатории.Скрининг токсичности поможет нам определить концентрацию для изучения его эффективности против микобактерий, который вызывает туберкулез и для дальнейшего доклинциозного расчета. Этот метод использует понимание внецелегового воздействия химических веществ, и, следовательно, этот метод может быть использован в любой области исследований, где токсичность химических имеет первостепенное значение. Этот метод очень прост и может быть осуществлен кем угодно без предварительного опыта.Лица, не имеют опыта должны планировать эксперимент тщательно и использовать только одно соединение. Этот метод обеспечивает токсическое воздействие химических веществ в виде фенотипических изменений в развивающихся эмбрионах зебры и, следовательно, безопасность проверенных соединений. Для начала поместите от двух до пяти взрослых самцов зебры и от трех до пяти взрослых самок зебры в брачные резервуары на ночь.Утром включите свет, так как разведение вызвано автоматическим темным и последующим световым циклом. Чтобы избежать стресса для животных, позвольте животным отдохнуть в течение двух недель, прежде чем использовать те же лица для разведения. На следующий день до полудня, собирать эмбрионы с помощью тонкой сетки ситечко, и передать их на чашку Петри, содержащий E3 эмбриона среды.Поместите чашку Петри под стерео микроскоп для изучения каждой партии эмбрионов. Определите непрозрачный внешний вид и удалите их как неутилизованные или мертвые эмбрионы. Держите эмбрионы на уровне 28,5 градусов по Цельсию в инкубаторе на ночь.На следующее утро осмотрим эмбрионы под стерео микроскопом и удалите нездоровые или мертвые эмбрионы. Тщательно используйте пастер пипетку для передачи одного эмбриона в каждый колодец из 24 пластины хорошо. Убедитесь, что каждый хорошо содержит достаточно E3 среды для покрытия эмбрионов.Вынюхив флаконы, содержащие ингибирующие соединения, хранящиеся при 4 градусах по Цельсию в холодильнике. Используйте аналитический баланс, чтобы взвесить соответствующее количество соединения, и подготовить 250 микролитров 100 миллимолярный раствор для каждого соединения в E3 среднего или другого соответствующего растворителя. Затем используйте E3 medium для серийного разбавления фондовых растворов на основе уровней токсичности в 15 миллилитровых центрифугах.Из колодцев, каждый из которых содержит один эмбрион DPF, используйте пастерную пипетку и 1 миллилитровую пипетку для удаления воды E3 по одному ряду за раз. Немедленно распределите 1 миллилитр каждого разбомбительного раствора штока в скважины плиты 24 скважин, начиная с нижней и переходя к более высокой концентрации. Для контрольных групп добавьте воду E3 или другой соответствующий растворитель.Этикетка 24 хорошо пластин с названием и концентрацией соединения и держать пластины на 28,5 градусов по Цельсию в инкубаторе. Позаботьтесь о том, чтобы разбавляющие вещества в скважинах не испарялись в инкубаторе путем уплотнения сторон 24 пластины скважины. Двадцать четыре часа после воздействия химических соединений, использовать пастер пипетки для передачи личинок подвергаются каждой концентрации соединения в небольшой чашке Петри, содержащей 3%высокий молекулярный вес метил-целлюлозы.С металлическим зондом, положите его боком. Поместите чашку Петри под стерео микроскоп, прикрепленный к камере. Возьмите изображения и сохраните изображения в отдельной папке каждый день до конца эксперимента.Введите все наблюдения в таблице каждый день либо в онлайн-таблице, либо на печатном листе. Для нейротоксического воздействия соединения, от четырех до пяти личинок DPF может показать ненормальный характер плавания. В этом случае, сделать запись таких изменений, захватив короткие 30 секунд до одной минуты видео личинок.После пяти дней воздействия химических соединений, обратите внимание на концентрацию, при которой половина эмбрионов умирают, как половина максимальной смертельной концентрации 50 каждого химического вещества. Создайте кривую смертности эмбрионов для всех концентраций с помощью подходящей программы. В этом протоколе важной частью оценки токсичности является тестирование различных концентраций одного или нескольких химических соединений в одном эксперименте.Для соединений, которые вызывают любые фенотипические дефекты в личинках, дефекты были зарегистрированы каждые 24 часа в течение одного-пяти дней после воздействия химического вещества. Эмбрионы, обработанные ингибиторами бета-CA в концентрациях 250 микромоляров и 125 микромоляров, обладают различными фенотипическими дефектами по сравнению с контролем. Например, неохотные эмбрионы даже на 3-й день, изогнутая структура тела, непритязаемый желточный мешок и перикардиальный отек, а также отсутствие отолитовых мешков в личинках через пять дней после лечения.В другом исследовании эмбрионы, обработанные ингибиторами CA, показали отсутствие отолитных мешков и плавательного пузыря. Эксперименты выявили репрезентативное соединение углеродной ангидразы 9, которое индуцировало минимальные или нет фенотипических изменений во время эмбрионального развития на уровне 500 микромолей. Соединение показало высокую концентрацию LC50.Однако, по сравнению с контролем, то же соединение на 300 микромоляров было установлено, что нейротоксические и индуцированной атаксии в личинках после пяти дней воздействия. Хорошее качество эмбрионов имеет важное значение для скрининга токсичности химических веществ. Для получения эмбрионов хорошего качества используйте молодую пару взрослых зебр для размножения.Соединения, которые возникают как безопасные могут быть дополнительно охарактеризованы путем выполнения соответствующих in vitro и in vivo экспериментов. В области разработки антитуберкулезных препаратов, этот метод помог создать дальнейшие эксперименты для инвиво ингибирования микобактерий маринума в эмбрионах зебры. Протокол включает в себя использование химических веществ, которые могут быть токсичными для человека.Лица, участвующие в экспериментах, должны должным образом заботиться при обращении с химическими веществами.

Research

JoVE Journal

Medicine

Evaluation of Nanoparticle Uptake in Tumors in Real Time Using Intravital Imaging

Оценка наночастиц в опухоли в реальном времени с помощью Прижизненные изображения

Current technologies for tumor imaging, such as ultrasound, MRI, PET and CT, are unable to yield high-resolution images for the assessment of nanoparticle ...

Accurate and Simple Evaluation of Vascular Anastomoses in Monochorionic Placenta using Colored Dye

Точная и простая оценка сосудистых анастомозов в монохориальной Плацента использованием цветного Dye

The presence of placental vascular anastomoses is a conditio sine qua non for the development of twin-to-twin transfusion syndrome (TTTS) and twin anemia ...

Induction of Myocardial Infarction in Adult Zebrafish Using Cryoinjury

Индукции инфаркта миокарда у взрослых данио рерио использование Cryoinjury

The mammalian heart is incapable of significant regeneration following an acute injury such as myocardial infarction1. By contrast, urodele amphibians and ...

The &alpha;-test: Rapid Cell-free CD4 Enumeration Using Whole Saliva

The ÃƒÅ½Ã‚Â±-test: Rapid Cell-free CD4 Enumeration Using Whole Saliva

Α-тест: Быстрая бесклеточной CD4 Перечисление Использование Всего слюны

There is an urgent need for affordable CD4 enumeration to monitor HIV disease. CD4 enumeration is out of reach in resource-limited regions due to the time ...

Screening for Melanoma Modifiers using a Zebrafish Autochthonous Tumor Model

Скрининг на Меланома Модификаторы помощью рыбок данио автохтонные модели опухоли

Genomic studies of  human cancers have yielded a wealth of information about genes that are altered  in tumors1,2,3. A challenge arising from these ...

Chemotherapy-induced Vascular Toxicity - Real-time In vivo Imaging of Vessel Impairment

Chemotherapy-induced Vascular Toxicity - Real-time In vivo Imaging of Vessel Impairment

Химиотерапия индуцированных Сосудистая токсичность - в режиме реального времени<em&gt; В естественных условиях</em&gt; Изображений судна обесценение

Certain classes of chemotherapies may exert acute vascular changes that may progress into long-term conditions that may predispose the patient to an ...

Quantification of the Immunosuppressant Tacrolimus on Dried Blood Spots Using LC-MS/MS

Количественная оценка иммуносупрессором такролимуса на сухих пятен крови с использованием LC-MS / MS

The calcineurin inhibitor tacrolimus is the cornerstone of most immunosuppressive treatment protocols after solid organ transplantation in the United ...

Diffuse Optical Spectroscopy for the Quantitative Assessment of Acute Ionizing Radiation Induced Skin Toxicity Using a Mouse Model

Диффузный оптической спектроскопии для количественной оценки острой токсичности ионизирующей радиации, индуцированный кожи с помощью модели мыши

Acute skin toxicities from ionizing radiation (IR) are a common side effect from therapeutic courses of external beam radiation therapy (RT) and ...

Solubility of Hydrophobic Compounds in Aqueous Solution Using Combinations of Self-assembling Peptide and Amino Acid

Растворимость гидрофобные соединений в водном растворе, с использованием комбинаций самостоятельной сборки пептиды и аминокислоты

Self-assembling peptides (SAPs) are promising vehicles for the delivery of hydrophobic therapeutics for clinical applications; their amphipathic ...

Evaluation of Cerebral Blood Flow Autoregulation in the Rat Using Laser Doppler Flowmetry

Оценка саморегуляции мозгового кровного потока в Крысе с помощью лазерной доплеровской флоуметрии

When investigating the body&#39;s mechanisms for regulating cerebral blood flow, a relative measurement of microcirculatory blood flow can be obtained ...