Name: rapid evaluation of toxicity of chemical compounds using zebrafish embryos
Uploaded: 2019-08-25T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Rapid Evaluation of Toxicity of Chemical Compounds Using Zebrafish Embryos at JoVE.com

Verket stöddes av bidrag från Sigrid Juselius Foundation (SP, MP), Finlands Kulturstiftelse (AA, MH), Finlands Akademi (SP, MP), Orion Farmos Foundation (MH), Tammerfors Tuberkulosstiftelse (SP, MH och MP) samt Jane och Aatos Erkkos stiftelse (SP och MP ). Vi tackar våra italienska och franska medarbetare, Prof. Supuran, och prof. Winum, för att tillhandahålla karbanhydrashämmare för säkerhet och toxicitet utvärdering för anti-TB och anti-cancerläkemedel utvecklingsändamål. Vi tackar Aulikki Lehmus och Marianne Kuuslahti för det tekniska biståndet. Vi tackar också Leena Mäkinen och Hannaleena Piippo för deras hjälp med sebrafiskuppfödning och insamling av embryon. Vi tackar uppriktigt Harlan Barker för kritisk utvärdering av manuskriptet och insiktsfulla kommentarer.

Zebrafiskar Core Facility vid Tammerfors universitet har beviljats tillstånd av det nationella djur experiment nämnden (esavi/7975/04.10.05/2016). Alla experiment med zebrafiskar embryon utfördes enligt Länsstyrelsen i östra Finland, social-och hälsodepartementet i Tammerfors regionala Service Unit Protocol # lslh-2007-7254/YM-23.
1. inställning av övernattande Zebrafish parnings tankar
<ol><li>Placera 2-5 vuxna manliga zebrafiskar och 3-5 vuxna kvinnlig zebrafiskar i parnings tankar...

<ol>
	<li>Amaouche, N., Casaert Salome, H., Collignon, O., Santos, M. R., Ziogas, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Marketing+authorization+applications+submitted+to+the+European+Medicines+Agency+by+small+and+medium-sized+enterprises:+an+analysis+of+major+objections+and+their+impact+on+outcomes.">Marketing authorization applications submitted to the European Medicines Agency by small and medium-sized enterprises: an analysis of major objections and their impact on outcomes.</a> Drug Discovery Today. 23 (10), 1801-1805 (2018).</li><li>Garg, R. C., Bracken, W. M., Hoberman, A. M., Gupta, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reproductive+and+developmental+safety+evaluation+of+new+pharmaceutical+compounds.">Reproductive and developmental safety evaluation of new pharmaceutical compounds.</a> Reproductive and Developmental Toxicology. , 89-109 (2011).</li><li>Lee, H. Y., Inselman, A. L., Kanungo, J., Hansen, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+models+in+developmental+toxicology.">Alternative models in developmental toxicology.</a> Systems Biology in Reproductive Medicine. 58 (1), 10-22 (2012).</li><li>Gao, G., Chen, L., Huang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-cancer+drug+discovery:+update+and+comparisons+in+yeast,+Drosophila,+and+zebrafish.">Anti-cancer drug discovery: update and comparisons in yeast, Drosophila, and zebrafish.</a> Current Molecular Pharmacology. 7 (1), 44-51 (2014).</li><li>Brown, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+of+test+chemicals+for+the+ECVAM+international+validation+study+on+in+vitro+embryotoxicity+tests.+European+Centre+for+the+Validation+of+Alternative+Methods.">Selection of test chemicals for the ECVAM international validation study on in vitro embryotoxicity tests. European Centre for the Validation of Alternative Methods.</a> Alternatives to Laboratory Animals. 30 (2), 177-198 (2002).</li><li>Selderslaghs, I. W., Van Rompay, A. R., De Coen, W., Witters, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+screening+assay+to+identify+teratogenic+and+embryotoxic+chemicals+using+the+zebrafish+embryo.">Development of a screening assay to identify teratogenic and embryotoxic chemicals using the zebrafish embryo.</a> Reproductive Toxicology. 28 (3), 308-320 (2009).</li><li>Brannen, K. C., Panzica-Kelly, J. M., Danberry, T. L., Augustine-Rauch, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+zebrafish+embryo+teratogenicity+assay+and+quantitative+prediction+model.">Development of a zebrafish embryo teratogenicity assay and quantitative prediction model.</a> Birth Defects Research Part B Developmental and Reproductive Toxicology. 89 (1), 66-77 (2010).</li><li>Hermsen, S. A., van den Brandhof, E. J., van der Ven, L. T., Piersma, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relative+embryotoxicity+of+two+classes+of+chemicals+in+a+modified+zebrafish+embryotoxicity+test+and+comparison+with+their+in+vivo+potencies.">Relative embryotoxicity of two classes of chemicals in a modified zebrafish embryotoxicity test and comparison with their in vivo potencies.</a> Toxicology in Vitro. 25 (3), 745-753 (2011).</li><li>Lessman, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+developing+zebrafish+(Danio+rerio):+a+vertebrate+model+for+high-throughput+screening+of+chemical+libraries.">The developing zebrafish (Danio rerio): a vertebrate model for high-throughput screening of chemical libraries.</a> Birth Defects Research. Part C, Embryo Today: Reviews. 93 (3), 268-280 (2011).</li><li>Lantz-McPeak, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+toxicity+assay+using+high+content+screening+of+zebrafish+embryos.">Developmental toxicity assay using high content screening of zebrafish embryos.</a> Journal of Applied Toxicology. 35 (3), 261-272 (2015).</li><li>Truong, L., Harper, S. L., Tanguay, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+embryotoxicity+using+the+zebrafish+model.">Evaluation of embryotoxicity using the zebrafish model.</a> Methods in Molecular Biology. 691, 271-279 (2011).</li><li>Rodrigues, G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design,+synthesis,+and+evaluation+of+hydroxamic+acid+derivatives+as+promising+agents+for+the+management+of+Chagas+disease.">Design, synthesis, and evaluation of hydroxamic acid derivatives as promising agents for the management of Chagas disease.</a> Journal of Medicinal Chemistry. 57 (2), 298-308 (2014).</li><li>Kanungo, J., Cuevas, E., Ali, S. F., Paule, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+model+in+drug+safety+assessment.">Zebrafish model in drug safety assessment.</a> Current Pharmaceutical Design. 20 (34), 5416-5429 (2014).</li><li>Peterson, R. T., Link, B. A., Dowling, J. E., Schreiber, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+molecule+developmental+screens+reveal+the+logic+and+timing+of+vertebrate+development.">Small molecule developmental screens reveal the logic and timing of vertebrate development.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (24), 12965-12969 (2000).</li><li>Stainier, D. Y., Fishman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+as+a+model+system+to+study+cardiovascular+development.">The zebrafish as a model system to study cardiovascular development.</a> Trends in Cardiovascular Medicine. 4 (5), 207-212 (1994).</li><li>Aspatwar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitroimidazole-based+inhibitors+DTP338+and+DTP348+are+safe+for+zebrafish+embryos+and+efficiently+inhibit+the+activity+of+human+CA+IX+in+Xenopus+oocytes.">Nitroimidazole-based inhibitors DTP338 and DTP348 are safe for zebrafish embryos and efficiently inhibit the activity of human CA IX in Xenopus oocytes.</a> Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry. 33 (1), 1064-1073 (2018).</li><li>Rami, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia-targeting+carbonic+anhydrase+IX+inhibitors+by+a+new+series+of+nitroimidazole-sulfonamides/sulfamides/sulfamates.">Hypoxia-targeting carbonic anhydrase IX inhibitors by a new series of nitroimidazole-sulfonamides/sulfamides/sulfamates.</a> Journal of Medicinal Chemistry. 56 (21), 8512-8520 (2013).</li><li>Spitsbergen, J. M., Kent, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+state+of+the+art+of+the+zebrafish+model+for+toxicology+and+toxicologic+pathology+research--advantages+and+current+limitations.">The state of the art of the zebrafish model for toxicology and toxicologic pathology research--advantages and current limitations.</a> Toxicologic Pathology. , 62-87 (2003).</li><li>Teraoka, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+cytochrome+P450+1A+is+required+for+circulation+failure+and+edema+by+2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin+in+zebrafish.">Induction of cytochrome P450 1A is required for circulation failure and edema by 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin in zebrafish.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 304 (2), 223-228 (2003).</li><li>Zon, L. I., Peterson, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+drug+discovery+in+the+zebrafish.">In vivo drug discovery in the zebrafish.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 4 (1), 35-44 (2005).</li><li>Hill, A. J., Teraoka, H., Heideman, W., Peterson, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+as+a+model+vertebrate+for+investigating+chemical+toxicity.">Zebrafish as a model vertebrate for investigating chemical toxicity.</a> Toxicological Sciences. 86 (1), 6-19 (2005).</li><li>Kari, G., Rodeck, U., Dicker, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish:+an+emerging+model+system+for+human+disease+and+drug+discovery.">Zebrafish: an emerging model system for human disease and drug discovery.</a> Clinical Pharmacology and Therapeutics. 82 (1), 70-80 (2007).</li><li>Gourmelon, A., Delrue, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+in+Support+of+Internationally+Harmonised+OECD+Test+Guidelines+for+Assessing+the+Safety+of+Chemicals.">Validation in Support of Internationally Harmonised OECD Test Guidelines for Assessing the Safety of Chemicals.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 856, 9-32 (2016).</li><li>Aspatwar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=beta-CA-specific+inhibitor+dithiocarbamate+Fc14-584B:+a+novel+antimycobacterial+agent+with+potential+to+treat+drug-resistant+tuberculosis.">beta-CA-specific inhibitor dithiocarbamate Fc14-584B: a novel antimycobacterial agent with potential to treat drug-resistant tuberculosis.</a> Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry. 32 (1), 832-840 (2017).</li><li>Kazokaite, J., Aspatwar, A., Kairys, V., Parkkila, S., Matulis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorinated+benzenesulfonamide+anticancer+inhibitors+of+carbonic+anhydrase+IX+exhibit+lower+toxic+effects+on+zebrafish+embryonic+development+than+ethoxzolamide.">Fluorinated benzenesulfonamide anticancer inhibitors of carbonic anhydrase IX exhibit lower toxic effects on zebrafish embryonic development than ethoxzolamide.</a> Drug and Chemical Toxicology. 40 (3), 309-319 (2017).</li><li>Howe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+reference+genome+sequence+and+its+relationship+to+the+human+genome.">The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome.</a> Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).</li><li>Granato, M., Nusslein-Volhard, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fishing+for+genes+controlling+development.">Fishing for genes controlling development.</a> Current Opinion in Genetics &amp; Development. 6 (4), 461-468 (1996).</li><li>Bambino, K., Chu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+in+Toxicology+and+Environmental+Health.">Zebrafish in Toxicology and Environmental Health.</a> Current Topics in Developmental Biology. 124, 331-367 (2017).</li><li>Goldsmith, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+as+a+pharmacological+tool:+the+how,+why+and+when.">Zebrafish as a pharmacological tool: the how, why and when.</a> Current Opinion in Pharmacology. 4 (5), 504-512 (2004).</li></ol>

In vitro toxicitetstest med odlade celler kan detektera överlevnad och morfologiska studier av cellerna som ger begränsad information om toxiciteten som induceras av testsubstansen. Fördelen med toxicitet screening av kemiska föreningar med hjälp av zebrafiskar embryon är snabb detektion av kemiskt inducerade fenotypiska förändringar i ett helt djur under embryonal utveckling i en relevant modellorganism. Cirka 70% av de protein-kodning mänskliga gener har ortologgar motsvarigheter i zebrafiskar Genome<...

Läkemedelsutveckling är en dyr process. Innan en enda kemisk förening är godkänd av Food and Drug Administration (FDA) och Europeiskaläkemedelsmyndigheten (EMA) flera tusen föreningar screenas till en kostnad av över 1 000 000 000 dollar1. Under den prekliniska utvecklingen krävs den största delen av denna kostnad för djurförsök2. För att begränsa kostnaderna behöver forskare inom området läkemedelsutveckling alternativa modeller för säkerhets screening av kemiska föreningar3. Därför, i den tidiga fasen av läkemedelsutveckling, det skulle vara mycket fördelaktigt att använda en metod som snabbt kan utvärdera säkerheten och toxiciteten av föreningarna i en lämplig modell. Det finns flera protokoll som har använts för toxicitet screening av kemiska föreningar med djur-och cellkulturer kultur modeller men det finns inte ett enda protokoll som är validerade och är i allmänt bruk4,5. Befintliga protokoll som använder zebrafiskar varierar i längd och har använts av enskilda forskare som utvärderat toxiciteten enligt deras bekvämlighets krav6,7,8,9, 10 , elva , 12.
Under den senaste tiden har zebrafiskar vuxit fram som en praktisk modell för utvärdering av toxiciteten hos kemiska föreningar under embryonal utveckling6,7. Zebrafiskar har många inbyggda fördelar för utvärderingen av kemiska föreningar13. Även storskaliga experiment är mottagliga, som en zebrafiskar hona kan lägga partier av 200-300 ägg, som utvecklas snabbt ex vivo, behöver inte extern matning i upp till en vecka och är transparenta. Föreningarna kan tillsättas direkt i vattnet, där de kan (beroende på vilken typ av förening) diffus genom chorion, och efter kläckning, genom huden, gälar och munnen av larver. Experimenten kräver inte kopiösa mängder av kemiska föreningar14 på grund av den lilla storleken på embryot. Utveckla zebrafiskar embryon uttrycka de flesta av de proteiner som krävs för att uppnå det normala utvecklings utfall. Därför är en zebrafiskar embryo en känslig modell för att bedöma om en potentiell drog kan störa funktionen av ett protein eller signalering molekyl som är utvecklingsmässigt betydande. Zebrafiskar organ blir funktionella mellan 2-5 DPF15, och föreningar som är giftiga under denna känsliga period av embryonal utveckling inducera fenotypiska defekter i zebrafiskar larver. Dessa fenotypiska förändringar kan lätt detekteras med hjälp av ett enkelt Mikroskop utan invasiva tekniker11. Zebrafish embryon används ofta i toxikologisk forskning på grund av deras mycket större biologiska komplexitet jämfört med in vitro -Drug screening med hjälp av cellkultur modeller16,17.  Som ryggradsdjur är den genetiska och fysiologiska makeupen hos zebrafiskar jämförbar med människan, och därför är toxiciteter av kemiska föreningar likartade mellan zebrafiskar och människor8,18,19, 20 , 21 , 22. Zebrafish är således ett värdefullt verktyg i den tidiga fasen av läkemedels upptäckt för utvärdering av toxiciteten och säkerheten hos de kemiska föreningarna.
I den här artikeln, ger vi en detaljerad beskrivning av den metod som används för att utvärdera säkerheten och toxiciteten av karbanhydras (ca) hämmare föreningar med 1-5-dagars post fertilisering (DPF) zebrafiskar embryon av en enda forskare. Protokollet omfattar att exponera zebrafiskar embryon för olika koncentrationer av kemiska hämmare föreningar och studera dödlighet och fenotypiska förändringar under embryonal utveckling. Vid slutet av exponeringen för kemiska föreningar, LC50 dosen av kemikalien bestäms. Metoden gör det möjligt för en individ att utföra effektiv screening av 1-5 test föreningar och tar ca 8-10 h beroende på erfarenheten av den person med metoden (figur 1). Var och en av de steg som krävs för att bedöma toxiciteten av föreningarna beskrivs i figur 2. Utvärderingen av toxicitet av CA-hämmare kräver 8 dagar, och inkluderar inrättande av parning par (dag 1); insamling av embryon från avels tankar, rengöring och förflyttning av dem till inkubator för 28,5 ° c (dag 2). spridningen av embryona till brunnarna i en 24-brunnsplatta och tillsats av utspädda CA-hämmare (dag 3). fenotypisk analys och avbildning av larver (dag 4-8), och bestämning av LC50 -dos (day8).  Denna metod är snabb och effektiv, kräver en liten mängd av den kemiska föreningen och endast grundläggande anläggningar av laboratoriet.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:972px;" width="972">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:342px;">24-well plates</td>
			<td style="width:185px;">Nunc</td>
			<td style="width:260px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:185px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:342px;">Balance (Weighing scale)</td>
			<td style="width:185px;">KERN</td>
			<td style="width:260px;">PLJ3000-2CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:342px;">Balance (Weighing scale)</td>
			<td style="width:185px;">Mettler Toledo</td>
			<td style="width:260px;">AB104-S/PH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:342px;">CaCl2</td>
			<td style="width:185px;">JT.Baker</td>
			<td style="width:260px;">RS421910024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:342px;">Disecting Probe</td>
			<td style="width:185px;">Thermo Scientific</td>
			<td>17-467-604&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:342px;">DMSO</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich, Germany</td>
			<td style="width:260px;">D4540</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:342px;">Falcon tubes 15 mL</td>
			<td style="width:185px;">Greiner bio-one</td>
			<td style="width:260px;">188271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:342px;">High molecular weight methylcellulose</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich, Germany</td>
			<td style="width:260px;">M0262&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:342px;">Incubator for zebrafish larvae</td>
			<td style="width:185px;">Termaks</td>
			<td style="width:260px;">B8000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:342px;">KCL</td>
			<td style="width:185px;">Merck</td>
			<td style="width:260px;">1.04936.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:342px;">Methyl Blue</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich, Germany</td>
			<td style="width:260px;">28983-56-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:342px;">MgSO4</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich, Germany</td>
			<td style="width:260px;">M7506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:342px;">Microcentrifuge tubes</td>
			<td style="width:185px;">Starlab</td>
			<td style="width:260px;">S1615-5500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:342px;">NaCl</td>
			<td style="width:185px;">VWR Chemicals</td>
			<td style="width:260px;">27810.295</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:342px;">Paraffin Histoplast IM</td>
			<td style="width:185px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:260px;">8331</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:342px;">Pasteur pipette&#160;</td>
			<td style="width:185px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:260px;">86.1171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:342px;">Petri dish</td>
			<td style="width:185px;">Thermo Scientific</td>
			<td>101R20&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:342px;">Petri plates</td>
			<td style="width:185px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:260px;">82.1473</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:342px;">Pipette (1 mL and 200 &#956;L)</td>
			<td style="width:185px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:260px;">4641230N, 4641210N&#160;&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:342px;">Plates 24-Well</td>
			<td style="width:185px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:260px;">142485</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:342px;">Steriomicroscope/Camera</td>
			<td style="width:185px;">Zeiss</td>
			<td style="width:260px;">Stemi 2000-C/Axiocam 105 color</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:342px;">Vials (1.5 mL)</td>
			<td style="width:185px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:260px;">11569914</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:342px;">Zebrafish AB strains</td>
			<td style="width:185px;">ZIRC&#160;</td>
			<td style="width:260px;">&#160; ZL1&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid evaluation of toxicity of chemical compounds using zebrafish embryos

Zebrafiskar är en allmänt använd ryggradsdjur modellorganism för sjukdomen och fenotyp-baserade drogen upptäckt. Zebrafiskar genererar många avkomman, har transparenta embryon och snabb extern utveckling. Zebrafish embryon kan därför också användas för en snabb utvärdering av toxiciteten hos de läkemedel som är värdefulla och finns i små mängder. I denna artikel beskrivs en metod för effektiv screening av toxiciteten av kemiska föreningar med hjälp av 1-5-dagars post fertilisering embryon. Embryona övervakas av stereomikroskopet för att undersöka fenotypiska defekter orsakade av exponering för olika koncentrationer av föreningar. Halva maximala dödliga koncentrationer (LC50) av föreningarna bestäms också. Den nuvarande studien krävde 3-6 mg en inhibitor förening, och hela experimentet tar ca 8-10 h som skall fyllas i av en individ i ett laboratorium med grundläggande faciliteter. Det nuvarande protokollet är lämplig för att testa någon förening för att identifiera oacceptabla toxiska eller off-Target effekter av föreningen i den tidiga fasen av Drug discovery och att upptäcka subtila toxiska effekter som kan missas i cellkulturen eller andra djurmodeller. Metoden minskar förseningarna i förfarandet och kostnaderna för läkemedelsutveckling.

Den kritiska delen av utvärderingen av toxicitet testar olika koncentrationer av en eller flera kemiska föreningar i ett enda experiment. I början väljer föreningarna för utvärdering av toxicitet, antalet koncentrationer för att testa för varje förening, och därmed göra ett diagram (figur 3). Vi använde en unik färg för varje förening för att organisera proverna (figur 3). Användning av lösningsmedelsresistenta...

Watch this Scientific Journal Video about Rapid Evaluation of Toxicity of Chemical Compounds Using Zebrafish Embryos at JoVE.com

Rapid Evaluation of Toxicity of Chemical Compounds Using Zebrafish Embryos

Zebrafish embryon används för att utvärdera toxiciteten av kemiska föreningar. De utvecklas externt och är känsliga för kemikalier, vilket möjliggör detektion av subtila fenotypiska förändringar. Experimentet kräver endast en liten mängd av sammansatta, som direkt tillsätts till plattan som innehåller embryon, vilket gör testsystemet effektivt och kostnadseffektivt.

Snabb utvärdering av toxiciteten hos kemiska föreningar med hjälp av Zebrafish embryon

The zebrafish is a widely used vertebrate model organism for the disease and phenotype-based drug discovery. The zebrafish generates many offspring, has ...

De toxicitetstestförfaranden kommer att demonstreras av Dr.Ashok Aspatwar, en senior forskare från mitt laboratorium. Vårt protokoll identifierar off-target effekter och upptäcker subtila toxiska effekter av kemikalier i den tidiga fasen av upptäckten som kan missas i cellodling eller andra djurmodeller. De viktigaste fördelarna med vår teknik är:det är snabbt och effektivt, kräver mycket liten mängd av kemiska, och de grundläggande anläggningarna i laboratoriet.Toxicitet screening kommer att hjälpa oss att bestämma koncentrationen för att studera dess effektivitet mot mycobacterium som orsakar tuberkulos och för ytterligare preklinisk beräkning. Denna metod använder insikter i off-target effekter av kemikalier, och därmed denna metod kan användas i något område av forskning där toxiciteten av kemiska är av primär betydelse. Denna metod är mycket enkel och kan utföras av vem som helst utan tidigare erfarenhet.Individer utan erfarenhet bör planera experimentet noggrant och använda bara en förening. Denna metod ger toxiska effekter av kemikalierna i form av fenotypiska förändringar i utvecklande zebrafisk embryon och därmed säkerhet av de föreningar som testats. Till att börja med placera två till fem vuxna manliga zebrafiskar och tre till fem vuxna kvinnliga zebrafiskar i parningstankar över natten.På morgonen, slå på ljuset som avel framkallas av den automatiska mörka och efterföljande ljuscykeln. För att undvika att hantera stress till djuren, låt djuren vila i två veckor innan du använder samma individer för avel. Nästa dag före middagstid, samla embryon med hjälp av ett fint nät sil, och överföra dem till en petriskål som innehåller E3 embryo medium.Placera petriskålen under ett stereomikroskop för att undersöka varje parti av embryon. Identifiera det ogenomskinliga utseendet och ta bort dem som obefruktade eller döda embryon. Håll embryona på 28,5 grader Celsius i en inkubator över natten.Nästa morgon, undersöka embryon under ett stereomikroskop och ta bort alla ohälsosamma eller döda embryon. Använd försiktigt en pasteurpipett för att överföra ett embryo till varje brunn av en 24 brunnsplatta. Se till att varje brunn innehåller tillräckligt med E3-medium för att täcka embryona.Ta ut injektionsflaskan innehållande hämmare föreningar som förvaras vid 4 grader Celsius i ett kylskåp. Använd en analytisk balans för att väga lämplig mängd av föreningen, och bered 250 mikroliter av 100 millimolar stamlösning för varje förening i E3 medium eller ett annat lämpligt lösningsmedel. Använd sedan E3-medium för att göra serieutspädningar av stamlösningarna baserat på toxicitetsnivåer i 15 milliliter centrifugrör.Från brunnarna som var och en innehåller ett DPF-embryo använder du en pasteurpipett och 1 milliliterpipett för att ta bort E3-vattnet en rad i taget. Omedelbart fördela 1 milliliter av varje spädningsvätska av beståndet lösningar i brunnarna i 24 väl plattan med början från lägre och flytta till högre koncentration. För kontrollgrupperna, tillsätt E3 vatten eller ett annat relevant lösningsmedel.Märk 24 brunnsplattor med föreningens namn och koncentration och håll plåtarna på 28,5 grader Celsius i en inkubator. Var försiktig så att kemikaliernas utspädningsmedel i brunnarna inte förångas i inkubatorn genom att sidorna av 24 brunnsplåt förseglas. Tjugofyra timmar efter exponering av de kemiska föreningarna, använd en pasteurpipett för att överföra larverna som exponeras för varje koncentration av föreningen i en liten petriskål som innehåller 3%hög molekylvikt metylcellulosa.Med en metallsond, lägg den i sidled. Placera petriskålen under ett stereomikroskop som är fäst vid en kamera. Ta bilderna, och spara bilderna i en separat mapp varje dag fram till slutet av experimentet.Ange alla observationer i en tabell varje dag antingen i en online-tabell eller på ett tryckt ark. För neurotoxisk sammansatt exponering kan de fyra till fem DPF-larverna visa onormalt simmönster. I så fall gör ett rekord av sådana förändringar genom att fånga en kort 30 sekunder till en minut video av larverna.Efter fem dagars exponering för de kemiska föreningarna, notera den koncentration vid vilken hälften av embryon dör som halv maximal dödlig koncentration 50 av varje kemikalie. Konstruera en kurva för dödlighet av embryon för alla koncentrationer med hjälp av ett lämpligt program. I detta protokoll, den kritiska delen av utvärderingen av toxicitet testar olika koncentrationer av en eller flera kemiska föreningar i ett enda experiment.För de föreningar som inducerar eventuella fenotypiska defekter i larverna registrerades defekterna var 24:e timme under en till fem dagars tid efter exponeringen för kemikalien. De embryon som behandlats med beta-CA-hämmare vid koncentrationerna av 250 mikromolar och 125 mikromolar uppvisar olika fenotypiska defekter jämfört med kontrollen. Till exempel okläckta embryon även vid dag 3, böjd kroppsstruktur, outnyttjad gulesäck och perikardial ödem, och avsaknad av otolitsäckar i larverna vid fem dagar efter behandling.I en annan studie visade embryona som behandlades med CA-hämmare frånvaron av otolitsäckar och simma urinblåsan. Experimenten identifierade en representativ sammansatt kolsyrande anhydras 9, som inducerade minimala eller inga fenotypiska förändringar under den embryonala utvecklingen på 500 mikromolar. Föreningen visade en hög LC50 koncentration.I en jämförelse med en kontroll konstaterades dock samma förening vid 300 mikromolar vara neurotoxiska och inducerad ataxi i larverna efter fem dagars exponering. God kvalitet på embryon är viktiga för toxicitet screening av kemikalier. För att erhålla embryon av god kvalitet, använd ungt par av vuxna zebrafiskar för avel.De föreningar som framträder som säkra kan ytterligare karakteriseras genom att utföra relevanta in vitro- och in vivo-experiment. Inom området antituberkulos läkemedelsutveckling, denna teknik bidragit till att inrätta ytterligare experiment för in vivo hämning av mycobacterium marinum i zebrafish embryon. Protokollet innebär användning av kemikalier som kan vara giftiga för människor.Personer som deltar i experimenten bör vara ordentligt omhändertagna vid hantering av kemikalierna.

Research

JoVE Journal

Medicine

Evaluation of Nanoparticle Uptake in Tumors in Real Time Using Intravital Imaging

Utvärdering av nanopartiklar Upptag i tumörer i realtid med hjälp Intravital Imaging

Current technologies for tumor imaging, such as ultrasound, MRI, PET and CT, are unable to yield high-resolution images for the assessment of nanoparticle ...

Accurate and Simple Evaluation of Vascular Anastomoses in Monochorionic Placenta using Colored Dye

Noggrann och enkel utvärdering av Vascular anastomoser i monochorionic Placenta med hjälp av färgade Dye

The presence of placental vascular anastomoses is a conditio sine qua non for the development of twin-to-twin transfusion syndrome (TTTS) and twin anemia ...

Induction of Myocardial Infarction in Adult Zebrafish Using Cryoinjury

Induktion av hjärtinfarkt hos vuxna Zebrafish Använda Cryoinjury

The mammalian heart is incapable of significant regeneration following an acute injury such as myocardial infarction1. By contrast, urodele amphibians and ...

The &alpha;-test: Rapid Cell-free CD4 Enumeration Using Whole Saliva

The ÃƒÅ½Ã‚Â±-test: Rapid Cell-free CD4 Enumeration Using Whole Saliva

Den α-test: Snabb Cell-free CD4 Enumeration Använda Hela Saliva

There is an urgent need for affordable CD4 enumeration to monitor HIV disease. CD4 enumeration is out of reach in resource-limited regions due to the time ...

Screening for Melanoma Modifiers using a Zebrafish Autochthonous Tumor Model

Screening för melanom Modifieringar med en Zebrafish Autoktont tumörmodell

Genomic studies of  human cancers have yielded a wealth of information about genes that are altered  in tumors1,2,3. A challenge arising from these ...

Chemotherapy-induced Vascular Toxicity - Real-time In vivo Imaging of Vessel Impairment

Chemotherapy-induced Vascular Toxicity - Real-time In vivo Imaging of Vessel Impairment

Kemoterapi-inducerad vaskulär toxicitet - Realtids<em&gt; In vivo</em&gt; Avbildning av Vessel Nedskrivningar

Certain classes of chemotherapies may exert acute vascular changes that may progress into long-term conditions that may predispose the patient to an ...

Quantification of the Immunosuppressant Tacrolimus on Dried Blood Spots Using LC-MS/MS

Kvantifiering av Immunsuppressivum takrolimus på torkade blodfläckar Använda LC-MS / MS

The calcineurin inhibitor tacrolimus is the cornerstone of most immunosuppressive treatment protocols after solid organ transplantation in the United ...

Diffuse Optical Spectroscopy for the Quantitative Assessment of Acute Ionizing Radiation Induced Skin Toxicity Using a Mouse Model

Diffus optisk spektroskopi för kvantitativ bedömning av akut joniserande strålning inducerad Skin toxicitet med hjälp av en musmodell

Acute skin toxicities from ionizing radiation (IR) are a common side effect from therapeutic courses of external beam radiation therapy (RT) and ...

Solubility of Hydrophobic Compounds in Aqueous Solution Using Combinations of Self-assembling Peptide and Amino Acid

Löslighet av hydrofoba föreningar i vattenlösning med kombinationer av självmonterande peptid och aminosyra

Self-assembling peptides (SAPs) are promising vehicles for the delivery of hydrophobic therapeutics for clinical applications; their amphipathic ...

Evaluation of Cerebral Blood Flow Autoregulation in the Rat Using Laser Doppler Flowmetry

Utvärdering av cerebral blodflöde Autoregulation hos råtta med Laser Doppler Flowmetry

When investigating the body&#39;s mechanisms for regulating cerebral blood flow, a relative measurement of microcirculatory blood flow can be obtained ...