Name: rapid evaluation of toxicity of chemical compounds using zebrafish embryos
Uploaded: 2019-08-25T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Rapid Evaluation of Toxicity of Chemical Compounds Using Zebrafish Embryos at JoVE.com

Çalışma Sigrid Juselius Vakfı (SP, MP), Finlandiya Kültür Vakfı (AA, MH), Finlandiya Akademisi (SP, MP), Orion Farmos Vakfı (MH), Tampere Tüberküloz Vakfı (SP, MH ve MP) ve Jane ve Aatos Erkko Vakfı (SP ve MP) hibe ile desteklendi ). İtalyan ve Fransız işbirlikçilerimiz Prof. Supuran ve Prof. Winum'a anti-TB ve anti-kanser ilaç geliştirme amaçları için güvenlik ve toksisite değerlendirmesi için karbonik anhidraz inhibitörleri sağladıklarından dolayı teşekkür ederiz. Aulikki Lehmus ve Marianne Kuuslahti'ye teknik yardımları için teşekkür ederiz. Ayrıca Leena Mäkinen ve Hannaleena Piippo'ya zebra balığı üremesi ve embriyo toplama konusunda yardımcı olmaları için teşekkür ederiz. Harlan Barker'a el yazmasının eleştirel değerlendirmesi ve anlayışlı yorumları için içtenlikle teşekkür ederiz.

Tampere Üniversitesi'ndeki zebra balığı çekirdek tesisi, Ulusal Hayvan Deney Kurulu tarafından verilen bir kuruluş iznine sahiptir (ESAVI/7975/04.10.05/2016). Zebra balığı embriyosu kullanılarak yapılan tüm deneyler, Doğu Finlandiya İl Hükümeti, Tampere Bölgesel Hizmet Birimi Protokolü Sosyal ve Sağlık Bakanlığı 'lSLH-2007-7254/Ym-23'e göre yapılmıştır.
1. Gecelik Zebrabalığı Çiftertanklarının Kurulumu
<ol><li>Bir gecede çiftleme tanklarına 2-5 yetişkin ...

<ol>
	<li>Amaouche, N., Casaert Salome, H., Collignon, O., Santos, M. R., Ziogas, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Marketing+authorization+applications+submitted+to+the+European+Medicines+Agency+by+small+and+medium-sized+enterprises:+an+analysis+of+major+objections+and+their+impact+on+outcomes.">Marketing authorization applications submitted to the European Medicines Agency by small and medium-sized enterprises: an analysis of major objections and their impact on outcomes.</a> Drug Discovery Today. 23 (10), 1801-1805 (2018).</li><li>Garg, R. C., Bracken, W. M., Hoberman, A. M., Gupta, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reproductive+and+developmental+safety+evaluation+of+new+pharmaceutical+compounds.">Reproductive and developmental safety evaluation of new pharmaceutical compounds.</a> Reproductive and Developmental Toxicology. , 89-109 (2011).</li><li>Lee, H. Y., Inselman, A. L., Kanungo, J., Hansen, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+models+in+developmental+toxicology.">Alternative models in developmental toxicology.</a> Systems Biology in Reproductive Medicine. 58 (1), 10-22 (2012).</li><li>Gao, G., Chen, L., Huang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-cancer+drug+discovery:+update+and+comparisons+in+yeast,+Drosophila,+and+zebrafish.">Anti-cancer drug discovery: update and comparisons in yeast, Drosophila, and zebrafish.</a> Current Molecular Pharmacology. 7 (1), 44-51 (2014).</li><li>Brown, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+of+test+chemicals+for+the+ECVAM+international+validation+study+on+in+vitro+embryotoxicity+tests.+European+Centre+for+the+Validation+of+Alternative+Methods.">Selection of test chemicals for the ECVAM international validation study on in vitro embryotoxicity tests. European Centre for the Validation of Alternative Methods.</a> Alternatives to Laboratory Animals. 30 (2), 177-198 (2002).</li><li>Selderslaghs, I. W., Van Rompay, A. R., De Coen, W., Witters, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+screening+assay+to+identify+teratogenic+and+embryotoxic+chemicals+using+the+zebrafish+embryo.">Development of a screening assay to identify teratogenic and embryotoxic chemicals using the zebrafish embryo.</a> Reproductive Toxicology. 28 (3), 308-320 (2009).</li><li>Brannen, K. C., Panzica-Kelly, J. M., Danberry, T. L., Augustine-Rauch, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+zebrafish+embryo+teratogenicity+assay+and+quantitative+prediction+model.">Development of a zebrafish embryo teratogenicity assay and quantitative prediction model.</a> Birth Defects Research Part B Developmental and Reproductive Toxicology. 89 (1), 66-77 (2010).</li><li>Hermsen, S. A., van den Brandhof, E. J., van der Ven, L. T., Piersma, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relative+embryotoxicity+of+two+classes+of+chemicals+in+a+modified+zebrafish+embryotoxicity+test+and+comparison+with+their+in+vivo+potencies.">Relative embryotoxicity of two classes of chemicals in a modified zebrafish embryotoxicity test and comparison with their in vivo potencies.</a> Toxicology in Vitro. 25 (3), 745-753 (2011).</li><li>Lessman, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+developing+zebrafish+(Danio+rerio):+a+vertebrate+model+for+high-throughput+screening+of+chemical+libraries.">The developing zebrafish (Danio rerio): a vertebrate model for high-throughput screening of chemical libraries.</a> Birth Defects Research. Part C, Embryo Today: Reviews. 93 (3), 268-280 (2011).</li><li>Lantz-McPeak, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+toxicity+assay+using+high+content+screening+of+zebrafish+embryos.">Developmental toxicity assay using high content screening of zebrafish embryos.</a> Journal of Applied Toxicology. 35 (3), 261-272 (2015).</li><li>Truong, L., Harper, S. L., Tanguay, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+embryotoxicity+using+the+zebrafish+model.">Evaluation of embryotoxicity using the zebrafish model.</a> Methods in Molecular Biology. 691, 271-279 (2011).</li><li>Rodrigues, G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design,+synthesis,+and+evaluation+of+hydroxamic+acid+derivatives+as+promising+agents+for+the+management+of+Chagas+disease.">Design, synthesis, and evaluation of hydroxamic acid derivatives as promising agents for the management of Chagas disease.</a> Journal of Medicinal Chemistry. 57 (2), 298-308 (2014).</li><li>Kanungo, J., Cuevas, E., Ali, S. F., Paule, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+model+in+drug+safety+assessment.">Zebrafish model in drug safety assessment.</a> Current Pharmaceutical Design. 20 (34), 5416-5429 (2014).</li><li>Peterson, R. T., Link, B. A., Dowling, J. E., Schreiber, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+molecule+developmental+screens+reveal+the+logic+and+timing+of+vertebrate+development.">Small molecule developmental screens reveal the logic and timing of vertebrate development.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (24), 12965-12969 (2000).</li><li>Stainier, D. Y., Fishman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+as+a+model+system+to+study+cardiovascular+development.">The zebrafish as a model system to study cardiovascular development.</a> Trends in Cardiovascular Medicine. 4 (5), 207-212 (1994).</li><li>Aspatwar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitroimidazole-based+inhibitors+DTP338+and+DTP348+are+safe+for+zebrafish+embryos+and+efficiently+inhibit+the+activity+of+human+CA+IX+in+Xenopus+oocytes.">Nitroimidazole-based inhibitors DTP338 and DTP348 are safe for zebrafish embryos and efficiently inhibit the activity of human CA IX in Xenopus oocytes.</a> Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry. 33 (1), 1064-1073 (2018).</li><li>Rami, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia-targeting+carbonic+anhydrase+IX+inhibitors+by+a+new+series+of+nitroimidazole-sulfonamides/sulfamides/sulfamates.">Hypoxia-targeting carbonic anhydrase IX inhibitors by a new series of nitroimidazole-sulfonamides/sulfamides/sulfamates.</a> Journal of Medicinal Chemistry. 56 (21), 8512-8520 (2013).</li><li>Spitsbergen, J. M., Kent, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+state+of+the+art+of+the+zebrafish+model+for+toxicology+and+toxicologic+pathology+research--advantages+and+current+limitations.">The state of the art of the zebrafish model for toxicology and toxicologic pathology research--advantages and current limitations.</a> Toxicologic Pathology. , 62-87 (2003).</li><li>Teraoka, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+cytochrome+P450+1A+is+required+for+circulation+failure+and+edema+by+2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin+in+zebrafish.">Induction of cytochrome P450 1A is required for circulation failure and edema by 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin in zebrafish.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 304 (2), 223-228 (2003).</li><li>Zon, L. I., Peterson, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+drug+discovery+in+the+zebrafish.">In vivo drug discovery in the zebrafish.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 4 (1), 35-44 (2005).</li><li>Hill, A. J., Teraoka, H., Heideman, W., Peterson, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+as+a+model+vertebrate+for+investigating+chemical+toxicity.">Zebrafish as a model vertebrate for investigating chemical toxicity.</a> Toxicological Sciences. 86 (1), 6-19 (2005).</li><li>Kari, G., Rodeck, U., Dicker, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish:+an+emerging+model+system+for+human+disease+and+drug+discovery.">Zebrafish: an emerging model system for human disease and drug discovery.</a> Clinical Pharmacology and Therapeutics. 82 (1), 70-80 (2007).</li><li>Gourmelon, A., Delrue, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+in+Support+of+Internationally+Harmonised+OECD+Test+Guidelines+for+Assessing+the+Safety+of+Chemicals.">Validation in Support of Internationally Harmonised OECD Test Guidelines for Assessing the Safety of Chemicals.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 856, 9-32 (2016).</li><li>Aspatwar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=beta-CA-specific+inhibitor+dithiocarbamate+Fc14-584B:+a+novel+antimycobacterial+agent+with+potential+to+treat+drug-resistant+tuberculosis.">beta-CA-specific inhibitor dithiocarbamate Fc14-584B: a novel antimycobacterial agent with potential to treat drug-resistant tuberculosis.</a> Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry. 32 (1), 832-840 (2017).</li><li>Kazokaite, J., Aspatwar, A., Kairys, V., Parkkila, S., Matulis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorinated+benzenesulfonamide+anticancer+inhibitors+of+carbonic+anhydrase+IX+exhibit+lower+toxic+effects+on+zebrafish+embryonic+development+than+ethoxzolamide.">Fluorinated benzenesulfonamide anticancer inhibitors of carbonic anhydrase IX exhibit lower toxic effects on zebrafish embryonic development than ethoxzolamide.</a> Drug and Chemical Toxicology. 40 (3), 309-319 (2017).</li><li>Howe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+reference+genome+sequence+and+its+relationship+to+the+human+genome.">The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome.</a> Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).</li><li>Granato, M., Nusslein-Volhard, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fishing+for+genes+controlling+development.">Fishing for genes controlling development.</a> Current Opinion in Genetics &amp; Development. 6 (4), 461-468 (1996).</li><li>Bambino, K., Chu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+in+Toxicology+and+Environmental+Health.">Zebrafish in Toxicology and Environmental Health.</a> Current Topics in Developmental Biology. 124, 331-367 (2017).</li><li>Goldsmith, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+as+a+pharmacological+tool:+the+how,+why+and+when.">Zebrafish as a pharmacological tool: the how, why and when.</a> Current Opinion in Pharmacology. 4 (5), 504-512 (2004).</li></ol>

Kültürlü hücreler kullanılarak yapılan in vitro toksisite testi, test bileşiğinin neden olduğu toksisite hakkında sınırlı bilgi sağlayan hücrelerin hayatta kalma ve morfolojik çalışmalarını tespit edebilir. Zebra balığı embriyoları kullanılarak kimyasal bileşiklerin toksisite tarama avantajı ilgili bir model organizmada embriyonik gelişim sırasında bütün bir hayvankimyasal kaynaklı phenotik değişikliklerin hızlı tespitidir. Protein kodlayan insan genlerinin yaklaşık %70'ind...

İlaç geliştirme pahalı bir süreçtir. Tek bir kimyasal bileşik Gıda ve İlaç İdaresi (FDA) ve Avrupa İlaç Ajansı (EMA) tarafından onaylanmadan önce birkaç bin bileşikler bir milyar doların üzerinde bir maliyetle taranmaktadır1. Preklinik gelişim sırasında, bu maliyetin en büyük kısmı hayvantesti2 için gereklidir. Maliyetleri sınırlamak için, ilaç geliştirme alanında araştırmacılar kimyasal bileşiklerin güvenlik tarama için alternatif modeller gerekir3. Bu nedenle, ilaç gelişiminin erken aşamasında, hızlı bir şekilde uygun bir modelde bileşiklerin güvenlik ve toksisitesini değerlendirebilir bir yöntem kullanmak çok yararlı olacaktır. Hayvan ve hücre kültürü modellerini içeren kimyasal bileşiklerin toksisite taraması için kullanılan çeşitli protokoller vardır ama doğrulanır ve ortak kullanımda olan tek bir protokol yoktur4,5. Zebra balığı kullanarak mevcut protokoller uzunluğu değişir ve kendi kolaylık gereksinimi6,7,8,9 , olarak toksisite değerlendirildi bireysel araştırmacılar tarafından kullanılmıştır 10.000 , 11.11.20 , 12. Yıl.
Yakın geçmişte, zebra balığı embriyonik gelişim sırasında kimyasal bileşiklerin toksisite değerlendirilmesi için uygun bir model olarak ortaya çıkmıştır6,7. Zebra balığı kimyasal bileşiklerin değerlendirilmesi için birçok dahili avantajları vardır13. Hatta büyük ölçekli deneyler münasip, bir zebra balığı dişi hızla ex vivogeliştirmek 200-300 yumurta, toplu koyabilirsiniz gibi, bir haftakadar dış besleme gerekmez ve şeffaf. Bileşikler doğrudan suya eklenebilir, nerede (bileşiğin doğasına bağlı olarak) chorion yoluyla yayılır, ve yumurtadan sonra, deri yoluyla, solungaçları ve larvaağız. Deneyler, embriyonun küçük boyutu nedeniyle14 kimyasal bileşiklerin bol miktarda gerektirmez. Zebra balığı embriyolarının geliştirilmesi, normal gelişimsel sonuca ulaşmak için gereken proteinlerin çoğunu ifade eder. Bu nedenle, bir zebra balığı embriyopotansiyel bir ilaç bir protein veya sinyal molekülünün işlevini bozabilir olup olmadığını değerlendirmek için hassas bir modeldir. Zebra balığının organları 2-5 dpf15arasında işlevsel hale gelir ve embriyonik gelişimin bu hassas döneminde toksik olan bileşikler zebra balığı larvalarında henotik bozukluklara neden olur. Bu fenotipik değişiklikler kolayca invaziv teknikler olmadan basit bir mikroskop kullanılarak tespit edilebilir11. Zebrabalığı embriyoları yaygın hücre kültürü modelleri kullanarak in vitro ilaç tarama göre çok daha büyük biyolojik karmaşıklığı nedeniyle toksikolojik araştırmalarda kullanılır16,17.  Bir omurgalı olarak, zebra balığı genetik ve fizyolojik makyaj insanlar ve dolayısıyla kimyasal bileşiklerin toksisite zebra balığı ve insanlar arasında benzer karşılaştırılabilir8,18,19, 20.000 , 21.000 , 22. Zebrabalığı, böylece, kimyasal bileşiklerin toksisite ve güvenlik değerlendirmesi için ilaç keşif erken aşamasında değerli bir araçtır.
Bu makalede, tek bir araştırmacı tarafından 1-5 günlük post fertilizasyon (dpf) zebra balığı embriyoları kullanılarak karbonik anhidraz (CA) inhibitör bileşiklerinin güvenliğini ve toksisitesini değerlendirmek için kullanılan yöntemin ayrıntılı bir açıklamasını salıyoruz. Protokol, zebra balığı embriyolarının farklı kimyasal inhibitör bileşiklerkonsantrasyonlarına maruz kalmalarını ve embriyonik gelişim sırasındaki mortalite ve henotik değişimleri incelemeyi içerir. Kimyasal bileşiklere maruz kalma sonunda, kimyasal LC50 doz belirlenir. Bu yöntem bireyin 1-5 test bileşiğinin verimli taramasını gerçekleştirmesini sağlar ve yöntemle kişinin deneyiminebağlı olarak yaklaşık 8-10 saat sürer (Şekil 1). Bileşiklerin toksisitesini değerlendirmek için gereken adımların her biri Şekil2'de özetlenmiştir. CA inhibitörlerinin toksisitesinin değerlendirilmesi 8 gün gerektirir ve çiftleşerek çiftleşerek çiftleşerek (1. gün) kurulmasını içerir; embriyoların üreme tanklarından toplanması, temizlenmesi ve 28,5 °C'ye aktarılması (2. gün); 24-iyi plaka kuyularına embriyoların dağılımı ve seyreltilmiş CA inhibitörü bileşiklerin eklenmesi (gün 3); larvaların fenotipik analizi ve görüntülemesi (gün 4-8) ve LC50 dozu (gün8) tayini.  Bu yöntem hızlı ve verimli, kimyasal bileşik ve laboratuvar sadece temel tesisleri küçük bir miktar gerektirir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:972px;" width="972">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:342px;">24-well plates</td>
			<td style="width:185px;">Nunc</td>
			<td style="width:260px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:185px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:342px;">Balance (Weighing scale)</td>
			<td style="width:185px;">KERN</td>
			<td style="width:260px;">PLJ3000-2CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:342px;">Balance (Weighing scale)</td>
			<td style="width:185px;">Mettler Toledo</td>
			<td style="width:260px;">AB104-S/PH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:342px;">CaCl2</td>
			<td style="width:185px;">JT.Baker</td>
			<td style="width:260px;">RS421910024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:342px;">Disecting Probe</td>
			<td style="width:185px;">Thermo Scientific</td>
			<td>17-467-604&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:342px;">DMSO</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich, Germany</td>
			<td style="width:260px;">D4540</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:342px;">Falcon tubes 15 mL</td>
			<td style="width:185px;">Greiner bio-one</td>
			<td style="width:260px;">188271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:342px;">High molecular weight methylcellulose</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich, Germany</td>
			<td style="width:260px;">M0262&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:342px;">Incubator for zebrafish larvae</td>
			<td style="width:185px;">Termaks</td>
			<td style="width:260px;">B8000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:342px;">KCL</td>
			<td style="width:185px;">Merck</td>
			<td style="width:260px;">1.04936.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:342px;">Methyl Blue</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich, Germany</td>
			<td style="width:260px;">28983-56-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:342px;">MgSO4</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich, Germany</td>
			<td style="width:260px;">M7506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:342px;">Microcentrifuge tubes</td>
			<td style="width:185px;">Starlab</td>
			<td style="width:260px;">S1615-5500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:342px;">NaCl</td>
			<td style="width:185px;">VWR Chemicals</td>
			<td style="width:260px;">27810.295</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:342px;">Paraffin Histoplast IM</td>
			<td style="width:185px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:260px;">8331</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:342px;">Pasteur pipette&#160;</td>
			<td style="width:185px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:260px;">86.1171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:342px;">Petri dish</td>
			<td style="width:185px;">Thermo Scientific</td>
			<td>101R20&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:342px;">Petri plates</td>
			<td style="width:185px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:260px;">82.1473</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:342px;">Pipette (1 mL and 200 &#956;L)</td>
			<td style="width:185px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:260px;">4641230N, 4641210N&#160;&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:342px;">Plates 24-Well</td>
			<td style="width:185px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:260px;">142485</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:342px;">Steriomicroscope/Camera</td>
			<td style="width:185px;">Zeiss</td>
			<td style="width:260px;">Stemi 2000-C/Axiocam 105 color</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:342px;">Vials (1.5 mL)</td>
			<td style="width:185px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:260px;">11569914</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:342px;">Zebrafish AB strains</td>
			<td style="width:185px;">ZIRC&#160;</td>
			<td style="width:260px;">&#160; ZL1&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid evaluation of toxicity of chemical compounds using zebrafish embryos

Zebra balığı hastalık ve fenotip bazlı ilaç keşfi için yaygın olarak kullanılan omurgalı modeli organizmadır. Zebra balığı birçok yavru üretir, şeffaf embriyolar ve hızlı dış gelişim vardır. Zebra balığı embriyoları, bu nedenle, aynı zamanda değerli ve küçük miktarlarda mevcut ilaçların toksisite hızlı değerlendirilmesi için kullanılabilir. Bu makalede, 1-5 günlük gübreleme sonrası embriyolar kullanılarak kimyasal bileşiklerin toksisitesinin etkin bir şekilde taranması için bir yöntem tanımlanmıştır. Embriyolar, farklı bileşik konsantrasyonlarına maruz kalmanın neden olduğu henotipik kusurları araştırmak için stereomikroskop la izlenir. Bileşiklerin yarı maksimal öldürücü konsantrasyonları (LC50)de belirlenir. Bu çalışma bir inhibitör bileşik 3-6 mg gerekli, ve tüm deney temel tesisleri olan bir laboratuvarda bir birey tarafından tamamlanması için yaklaşık 8-10 saat sürer. Mevcut protokol, ilacın keşfinin erken evresinde bileşiğin dayanılmaz toksik veya hedef dışı etkilerini belirlemek ve hücre kültürü veya diğer hayvan modellerinde gözden kaçmış olabilecek ince toksik etkileri tespit etmek için herhangi bir bileşiği test etmek için uygundur. Yöntem, prosedürdeki gecikmeleri ve ilaç geliştirme maliyetlerini azaltır.

Toksisite değerlendirmesinin kritik kısmı, tek bir deneyde bir veya birden fazla kimyasal bileşiğin farklı konsantrasyonlarını test etmektir. Başlangıçta, toksisite nin değerlendirilmesi için bileşikleri seçin, her bileşik için test etmek için konsantrasyonsayısı, ve buna göre, bir grafik yapmak (Şekil 3). Örnekleri düzenlemek için her bileşik için benzersiz bir renk kullandık (Şekil 3). Daha sonra ka...

Watch this Scientific Journal Video about Rapid Evaluation of Toxicity of Chemical Compounds Using Zebrafish Embryos at JoVE.com

Rapid Evaluation of Toxicity of Chemical Compounds Using Zebrafish Embryos

Zebra balığı embriyoları kimyasal bileşiklerin toksisitesini değerlendirmek için kullanılır. Onlar harici geliştirmek ve kimyasallara duyarlı, ince phenotik değişikliklerin tespitine izin. Deney sadece doğrudan embriyo içeren plaka eklenir bileşik küçük bir miktar gerektirir, test sistemi verimli ve maliyet-etkin hale.

Zebrabalığı Embriyoları Kullanılarak Kimyasal Bileşiklerin Toksisitesinin Hızlı Değerlendirilmesi

The zebrafish is a widely used vertebrate model organism for the disease and phenotype-based drug discovery. The zebrafish generates many offspring, has ...

Toksisite testi prosedürleri Dr.Ashok Aspatwar tarafından gösterilecek. Protokolümüz hedef dışı etkileri tanımlar ve hücre kültürü veya diğer hayvan modellerinde gözden kaçırılabilir keşif erken aşamasında kimyasalların ince toksik etkileri algılar. Tekniğimizin başlıca avantajları şunlardır: hızlı ve verimli, çok az miktarda kimyasal ve laboratuvardaki temel olanaklar gerektirir.Toksisite taraması tüberküloza neden olan mikobacteriuma karşı etkinliğini incelemek için konsantrasyon belirlemede ve daha fazla klinik öncesi hesaplama için bize yardımcı olacaktır. Bu yöntem kimyasalların hedef dışı etkilerine ilişkin içgörüler kullanır ve bu nedenle bu yöntem kimyasalın toksisitesinin birincil öneme sahip olduğu herhangi bir araştırma alanında kullanılabilir. Bu yöntem çok basittir ve önceden deneyimi olmayan herkes tarafından yapılabilir.Hiçbir deneyimi olan bireyler dikkatle deney planlamak ve sadece bir bileşik kullanmalısınız. Bu yöntem, gelişmekte olan zebra balığı embriyolarında ve dolayısıyla test edilen bileşiklerin güvenliğinde phenotik değişiklikler şeklinde kimyasalların toksik etkilerini sağlar. Başlamak için, çiftleme tankları içine bir gecede iki ila beş yetişkin erkek zebra balığı ve üç ila beş yetişkin dişi zebra balığı yerleştirin.Üreme otomatik karanlık ve sonraki ışık döngüsü tarafından indüklenen olarak sabah, ışık açın. Hayvanlara stres le başa çıkmaktan kaçınmak için, hayvanların üreme için aynı bireyleri kullanmadan önce iki hafta dinlenmesine izin verin. Ertesi gün öğlenden önce, ince bir örgü süzgeç kullanarak embriyolar toplamak ve E3 embriyo orta içeren bir petri kabına aktarın.Petri kabını her bir embriyo partisini incelemek için stereo mikroskop altına yerleştirin. Opak görünümünü belirleyin ve döllenmemiş veya ölü embriyolar olarak kaldırın. Embriyoları bir gece kuvözde 28.5 derecede tutun.Ertesi sabah, bir stereo mikroskop altında embriyolar incelemek ve herhangi bir sağlıksız veya ölü embriyoları kaldırın. Dikkatle bir 24 kuyu plaka her kuyuya bir embriyo aktarmak için bir pasteur pipet kullanın. Her kuyunun embriyoları kapsayacak kadar E3 ortamı içerdiğinden emin olun.Bir buzdolabında 4 santigrat derecede depolanan inhibitör bileşikleri içeren şişeleri dışarı atın. Bileşimin uygun miktarda tartmak için analitik bir denge kullanın ve E3 orta veya başka bir uygun çözücü her bileşik için 100 milimolar stok çözeltisi 250 mikrolitre hazırlamak. Daha sonra, 15 mililitrelik santrifüj tüplertiflik düzeylerine dayalı stok çözeltilerinin seri seyreltme yapmak için E3 orta kullanın.Her biri bir DPF embriyosu içeren kuyulardan, E3 suyunu bir sıra tek er tek sıra çıkarmak için bir pasteur pipeti ve 1 mililitrelik pipet kullanın. Stok çözeltilerinin her bir dilüentinin 1 mililitresini, alttan başlayıp daha yüksek konsantrasyona doğru hareket eden 24 kuyu plakasının kuyularına hemen dağıtın. Kontrol grupları için, E3 su veya başka bir ilgili çözücü ekleyin.İsmi ve konsantrasyonu ile 24 kuyu plakasını etiketle ve plakaları bir kuvözde 28,5 santigrat derecede tutun. Kuyularda bulunan kimyasalların seyrelticilerinin 24 kuyu plakasının kenarlarını kapatarak kuvözde buharlaşmayana dikkat edin. Kimyasal bileşiklerin maruz kalmasından yirmi dört saat sonra, %3 yüksek molekül ağırlıklı metil selüloz içeren küçük bir petri kabında bileşiğin her konsantrasyonuna maruz kalan larvaları aktarmak için pasteur pipet kullanın.Metal bir sondayla, yana doğru yatırın. Petri kabını kameraya bağlı bir stereo mikroskobun altına yerleştirin. Görüntüleri alın ve denemenin sonuna kadar her gün görüntüleri ayrı bir klasöre kaydedin.Tüm gözlemleri her gün bir tabloya çevrimiçi bir tabloya veya basılı bir sayfaya girin. Nörotoksik bileşik maruziyeti için, dört ila beş DPF larvaları anormal yüzme paterni gösterebilir. Bu durumda, larvaların 30 saniye ile bir dakikalık videosunu çekerek bu tür değişikliklerin kaydını yapın.Kimyasal bileşiklere maruz beş gün sonra, embriyoların yarısı yarım maksimal öldürücü konsantrasyon 50 her kimyasal olarak ölmek konsantrasyonu unutmayın. Uygun bir program kullanarak tüm konsantrasyonları için embriyoların mortalite için bir eğri oluşturmak. Bu protokolde, toksisite değerlendirmesinin kritik kısmı tek bir deneyde bir veya birden fazla kimyasal bileşiğin farklı konsantrasyonlarını test etmektir.Larvalarda herhangi bir henotipik kusura neden olan bileşikler için, defektler kimyasala maruz kaldıktan sonra bir ila beş günlük bir süre içinde her 24 saatte bir kaydedildi. 250 mikromolar ve 125 mikromolar konsantrasyonlarında beta CA inhibitörleri ile tedavi edilen embriyolar kontrol ile karşılaştırıldığında çeşitli henotypik defektler sergilerler. Örneğin, 3.Başka bir çalışmada, CA inhibitörleri ile tedavi edilen embriyolar otolit keseleri ve yüzme mesane yokluğu gösterdi. Deneyler, 500 mikromolar embriyonik gelişim sırasında minimal veya hiç fenotipik değişikliklere neden olan temsili bir bileşik karbonik anhidraz 9 tespit etti. Bileşik yüksek LC50 konsantrasyonu gösterdi.Ancak, bir kontrol ile karşılaştırıldığında, aynı bileşik 300 mikromolar maruz kalma beş gün sonra larvalarda nörotoksik ve indüklenen ataksi bulundu. Embriyoların kalitesi kimyasalların toksisite taraması için önemlidir. Kaliteli embriyolar elde etmek için, üreme için yetişkin zebra balığı genç çifti kullanın.Güvenli olarak ortaya çıkan bileşikler, ilgili in vitro ve in vivo deneyleri yaparak daha da karakterize edilebilir. Antitüberküloz ilaç geliştirme alanında, bu teknik zebra balığı embriyolarında micobacterium marinum in vivo inhibisyonu için daha fazla deney kurmak için yardımcı oldu. Protokol, insanlar için zehirli olabilecek kimyasalların kullanımını içeriyor.Deneylerde yer alan kişiler, kimyasalları kullanırken dikkatli olmalıdır.

Research

JoVE Journal

Medicine

Evaluation of Nanoparticle Uptake in Tumors in Real Time Using Intravital Imaging

Intravital Görüntüleme Gerçek Zamanlı tümörler Nanopartikül Alımı Değerlendirme

Current technologies for tumor imaging, such as ultrasound, MRI, PET and CT, are unable to yield high-resolution images for the assessment of nanoparticle ...

Accurate and Simple Evaluation of Vascular Anastomoses in Monochorionic Placenta using Colored Dye

Renkli Boya kullanarak Monokoryonik Plasenta vasküler anastomozlar doğru ve basit Değerlendirme

The presence of placental vascular anastomoses is a conditio sine qua non for the development of twin-to-twin transfusion syndrome (TTTS) and twin anemia ...

Induction of Myocardial Infarction in Adult Zebrafish Using Cryoinjury

Yetişkin Zebra balığı Myokard İnfarktüsü İndüksiyon Cryoinjury kullanma

The mammalian heart is incapable of significant regeneration following an acute injury such as myocardial infarction1. By contrast, urodele amphibians and ...

The &alpha;-test: Rapid Cell-free CD4 Enumeration Using Whole Saliva

The ÃƒÅ½Ã‚Â±-test: Rapid Cell-free CD4 Enumeration Using Whole Saliva

Α-testi: Tüm Tükürük Kullanarak Hızlı Hücre içermeyen CD4 sayımı

There is an urgent need for affordable CD4 enumeration to monitor HIV disease. CD4 enumeration is out of reach in resource-limited regions due to the time ...

Screening for Melanoma Modifiers using a Zebrafish Autochthonous Tumor Model

Bir Zebra balığı Otokton Tümör Modeli kullanılarak Melanom Değiştiricileri için Tarama

Genomic studies of  human cancers have yielded a wealth of information about genes that are altered  in tumors1,2,3. A challenge arising from these ...

Chemotherapy-induced Vascular Toxicity - Real-time In vivo Imaging of Vessel Impairment

Chemotherapy-induced Vascular Toxicity - Real-time In vivo Imaging of Vessel Impairment

Kemoterapi kaynaklı Vasküler Toksisite - Gerçek zamanlı<em&gt; In vivo</em&gt; Gemi Düşüklüğü Görüntüleme

Certain classes of chemotherapies may exert acute vascular changes that may progress into long-term conditions that may predispose the patient to an ...

Quantification of the Immunosuppressant Tacrolimus on Dried Blood Spots Using LC-MS/MS

LC-MS / MS kullanarak Kurutulmuş Kan Spotlar Immünosupresan Tacrolimus Niceleme

The calcineurin inhibitor tacrolimus is the cornerstone of most immunosuppressive treatment protocols after solid organ transplantation in the United ...

Diffuse Optical Spectroscopy for the Quantitative Assessment of Acute Ionizing Radiation Induced Skin Toxicity Using a Mouse Model

Bir fare Modeli Kullanılarak Akut Radyasyondan Bağlı Cilt zehirlilik Kantitatif Değerlendirme optik tayf Diffüz

Acute skin toxicities from ionizing radiation (IR) are a common side effect from therapeutic courses of external beam radiation therapy (RT) and ...

Solubility of Hydrophobic Compounds in Aqueous Solution Using Combinations of Self-assembling Peptide and Amino Acid

Çözünürlük sulu çözüm peptid ve Amino asit kendi kendine montaj bileşimlerini kullanarak hidrofobik bileşiklerin

Self-assembling peptides (SAPs) are promising vehicles for the delivery of hydrophobic therapeutics for clinical applications; their amphipathic ...

Evaluation of Cerebral Blood Flow Autoregulation in the Rat Using Laser Doppler Flowmetry

Lazer Doppler Flowmetry Kullanarak Sıçanserebral Kan Akımı Otoregülasyon Değerlendirilmesi

When investigating the body&#39;s mechanisms for regulating cerebral blood flow, a relative measurement of microcirculatory blood flow can be obtained ...