Name: material formation of recombinant spider silks through aqueous solvation using heat and pressure
Uploaded: 2019-05-06T12:30:00
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作者感谢犹他州科学和技术研究 (USTAR) 倡议提供的资金。

1. 由冻干蛋白库存制备重组蜘蛛丝的混合物
<ol><li>确定所需的配方和材料形成所需的体积。典型配方的范围从 3% (w/v) 到 15% (w v) 不等。使用此选择, 计算适当的 rSSp、浓度和比率。<ol>
<li>使用以下各自的配方制备本议定书所述的每一种材料: 水凝胶/海绵/凝胶, 6% (w/v) 50:50 MaSp1:MaSp2;膜/涂层, 5% (w/v) 80:20 Masp1: masp2;胶粘剂, 12% (w/v) 50:50 Masp1: masp2;纤维, 12.5% (w/v) 80:20 masp1: Masp2。 注: 尽管大多数配方更适...

<ol>
	<li>Huemmerich, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+Structure+Elements+of+Spider+Dragline+Silks+and+Their+Contribution+to+Protein+Solubility.">Primary Structure Elements of Spider Dragline Silks and Their Contribution to Protein Solubility.</a> Biochemistry. 43 (42), 13604-13612 (2004).</li><li>Schacht, K., Scheibel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled+Hydrogel+Formation+of+a+Recombinant+Spider+Silk+Protein.">Controlled Hydrogel Formation of a Recombinant Spider Silk Protein.</a> Biomacromolecules. 12 (7), 2488-2495 (2011).</li><li>Jones, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=More+Than+Just+Fibers:+An+Aqueous+Method+for+the+Production+of+Innovative+Recombinant+Spider+Silk+Protein+Materials.">More Than Just Fibers: An Aqueous Method for the Production of Innovative Recombinant Spider Silk Protein Materials.</a> Biomacromolecules. 16 (4), 1418-1425 (2015).</li><li>Tucker, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+and+Physical+Properties+of+Recombinant+Spider+Silk+Films+Using+Organic+and+Aqueous+Solvents.">Mechanical and Physical Properties of Recombinant Spider Silk Films Using Organic and Aqueous Solvents.</a> Biomacromolecules. 15 (8), 3158-3170 (2014).</li><li>Harris, T. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Sticky+Situation:+An+Investigation+of+Robust+Aqueous-Based+Recombinant+Spider+Silk+Protein+Coatings+and+Adhesives.">A Sticky Situation: An Investigation of Robust Aqueous-Based Recombinant Spider Silk Protein Coatings and Adhesives.</a> Biomacromolecules. 17 (11), 3761-3772 (2016).</li><li>Jones, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Importance+of+Heat+and+Pressure+for+Solubilization+of+Recombinant+Spider+Silk+Proteins+in+Aqueous+Solution.">Importance of Heat and Pressure for Solubilization of Recombinant Spider Silk Proteins in Aqueous Solution.</a> International Journal of Molecular Sciences. 17 (11), 1955 (2016).</li><li>Copeland, C. G., Bell, B. E., Christensen, C. D., Lewis, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+Process+for+the+Spinning+of+Synthetic+Spider+Silk.">Development of a Process for the Spinning of Synthetic Spider Silk.</a> ACS Biomaterials Science and Engineering. 1 (7), 557-584 (2015).</li><li>Arcidiacono, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aqueous+Processing+and+Fiber+Spinning+of+Recombinant+Spider+Silks.">Aqueous Processing and Fiber Spinning of Recombinant Spider Silks.</a> Macromolecules. 35 (4), 1262-1266 (2002).</li><li>Work, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+Major+Ampullate+Silk+Fiber+Formation+by+Orb-Web-Spinning+Spiders.">Mechanisms of Major Ampullate Silk Fiber Formation by Orb-Web-Spinning Spiders.</a> Transactions of the American Microscopical Society. 96 (2), 170-189 (1977).</li><li>Decker, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+for+the+Destruction+of+Endotoxin+in+Synthetic+Spider+Silk+Proteins.">Method for the Destruction of Endotoxin in Synthetic Spider Silk Proteins.</a> Scientific Reports. 8 (12166), 1-6 (2018).</li></ol>

重组蜘蛛丝蛋白纯化后, 必须在可用于材料形成的溶液中制备。通过将冻干蜘蛛丝蛋白与水混合, 并将这种混合物暴露在微波照射下, 产生热量和压力, 可以制备 rSSp 溶液。这种简单有效的 rSSp 增溶方法可以产生各种各样的材料形式。每种材料都必须经过独特的准备和加工, 以达到所需的结果和性能。通过对初始配方、成型条件和/加工参数的轻微改变, 每种材料都可以很容易地使用这种方法进行调整...

蜘蛛丝绸以其令人印象深刻的强度、弹性和生物相容性的结合而引起了材料科学家的兴趣。传统上, 修复纤维一直是研究的重点。这一努力受到重组蜘蛛丝蛋白 (rSSp) 在水中的不溶解性以及传统的溶解技术 (各向异性剂和洗涤剂) 无法实现水溶的阻碍。此外, 为解决 rssp 版本而开发的技术并不能在所有的 rssp 变体上工作, 还需要大量的操作和时间, 这往往会导致蛋白质损失1,2。这在很大程度上导致利用 1, 1, 1, 3, 3, 3-六氟异丙醇 (HFIP) 作为形成纤维的溶剂, 以及其他有限的材料形式。其优点是所有已知的 rSSp 都可溶于 HFIP, 从而提供每个研究组之间的数据一致性。缺点是, HFIP 是一种有毒溶剂, 由于健康问题和环境考虑, 这种溶剂价格昂贵, 无法扩展。
提出了一种新的 rSSp 溶解方法, 弥补了苛刻的有机溶剂 HFIP 与其他有选择地用于 rSSp 溶解的技术之间的技术差距。将比热和压力结合起来, 对 rSSp 和水的悬浮液进行了应用。结果是 rSSp 的溶解和恢复接近 100%, 蛋白质浓度较高;从这些配方中确定了各种材料形式是可能的, 而这些配方并非都能使用 hfip 或其他有机溶剂3、4、5、6实现。这种方法的目的是高效和方便地溶解纯化和干燥的重组蜘蛛蛋白在水溶液中, 然后可用于生产各种材料形式。
使用这种方法, 纤维、薄膜、涂料、粘合剂、水凝胶、溶解胶、微球和海绵材料都很容易与相同的水 rSSp 溶液区分开来。这种方法的持续发展, 不仅与额外的 rSSp, 但与其他蛋白质, 可以导致新的材料形式和替代蛋白质纯化和增溶途径。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:697px;" width="698">
	<tbody>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">3 mL Syringe with Luer-Lok Tip</td>
			<td style="width:148px;">BD</td>
			<td style="width:119px;">309657</td>
			<td style="width:215px;">Other size syringes can be used but to keep the tips on, it is advised to use luer-lok tips</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">4 mL culture vial, clear with rubber lined cap</td>
			<td style="width:148px;">Wheaton</td>
			<td style="width:119px;">225142</td>
			<td style="width:215px;">Minimum dope volume is 1mL, max is 2mL</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">8 mL culture vial, clear with rubber lined cap</td>
			<td style="width:148px;">Wheaton</td>
			<td style="width:119px;">225144</td>
			<td style="width:215px;">Minimum dope volume is 2mL, max is 4mL</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">99% Isopropyl Alcohol, Reagent ACS/USP Grade</td>
			<td style="width:148px;">Pharmco-Aaper</td>
			<td style="width:119px;">231000099</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Freezone 4.5 Plus</td>
			<td style="width:148px;">Labconco</td>
			<td style="width:119px;">7386030</td>
			<td>Freeze Dryer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Luer Adapter Female Luer x 10-32 Female, Tefzel (ETFE)</td>
			<td style="width:148px;">IDEX</td>
			<td style="width:119px;">P-629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:216px;">Microwave</td>
			<td style="width:148px;">Magic Chef</td>
			<td style="width:119px;">HMD1110B</td>
			<td style="width:215px;">120V, 60Hz AC; 1000 watts; 1.1 cu. ft. capacity; with glass turn table</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">One-Piece Fingertight 10-32 Coned, for 1/16&#34; OD</td>
			<td style="width:148px;">IDEX</td>
			<td style="width:119px;">F-120X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">PEEK Tubing 1/16&#34; OD x 0.010&#34; ID</td>
			<td style="width:148px;">IDEX</td>
			<td style="width:119px;">1531B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Sprayer: Master Airbrush</td>
			<td style="width:148px;">Master Airbrush</td>
			<td style="width:119px;">TC-60</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

material formation of recombinant spider silks through aqueous solvation using heat and pressure

许多蜘蛛生产七种类型的丝绸。其中有六个丝绸是由蜘蛛生产的纤维。这些纤维不溶于水。为了再现蜘蛛丝的显著力学特性, 它们必须在异源寄主中产生, 因为蜘蛛既是领土的, 也是食人鱼的。蜘蛛丝的合成类似物也容易不溶于水溶液。因此, 重组蜘蛛丝的研究有很大一部分依赖于不利于大规模生产材料的有机溶剂。我们小组的方法迫使这些重组蜘蛛丝溶解到水中。值得注意的是, 当使用这种热和压力法制备这些蛋白质时, 可以从重组蜘蛛丝蛋白 (rSSp) 的相同溶液中制备出广泛的材料形式, 包括: 薄膜、纤维、海绵、水凝胶、溶解胶和粘合剂。本文演示了溶解 rSSp 和材料形式的生产方式, 比仅仅从书面材料和方法更容易理解。

从所描述的 rSSp 增利方法中可以实现各种材料形式, 如图 1所示。增溶的方法是将传统微波产生的热和压力施加到 rSSp 和水的悬浮液中。当达到临界温度和压力时, 蛋白质就会溶解。从这种溶解性 rSSp 解决方案中, 提出了七种材料形式所需的条件: 水凝胶、胶凝胶、海绵、粘合剂、涂料、薄膜和纤维。水凝胶是通过允许溶解性 rSSp 冷却和自然自联想准备...

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Material Formation of Recombinant Spider Silks through Aqueous Solvation using Heat and Pressure

热、压水固化重组蜘蛛丝的材料形成

在这里, 我们提出了一个协议, 以产生水溶性重组蜘蛛丝蛋白溶液和材料形式, 可以从这些解决方案形成。

Many spiders produce seven types of silks. Six of the silks are fiber in form when produced by the spiders. These fibers are not water soluble. In order ...

这种溶解重组蜘蛛丝的方法产生的材料形式是不可能使用传统的苛刻有机溶剂。此外，这个过程是谷物，导致一个简单的蛋白质溶液在水中。通过这种方法，形成或生产的材料保持了蜘蛛丝蛋白的可取特性。这种重组蜘蛛丝的溶解技术允许在一步一个过程中对重组蜘蛛丝进行溶解。这是可取的，因为这些众所周知的难以生产蛋白质不会通过广泛的加工丢失。此外，由于溶液只是水中的蛋白质，因此，如果应用需要，可以添加其他生物活性化合物。特别是蛋白质结构功能关系，这个系统是蜘蛛如何制造纤维的模因，因为它利用水和蛋白质的高浓度。通过使用这种溶解法和随后的材料形成，应该能够了解所形成的材料以及负责它们的结构。据认为，我们可以，我们已经使用这种技术溶解合成肽，否则将需要碱性或酸性环境溶解。这在这些肽的下游应用中是有利的。此外，一些已知蛋白质，当表达合成往往结束在不溶性的分数。再溶解，然后重新折叠这些蛋白质往往是一个费力的过程，导致巨大的损失。通过利用这种技术，有可能提高不溶性蛋白质的回收过程的效率。将密封小瓶放入微波炉有点令人生畏，具有过热的风险，从而过度加压小瓶。了解加热和压力的分阶段方法至关重要。其次，对于重组蜘蛛丝，特别是，有盐存在将不允许技术工作或工作有效取决于有多少盐存在。去除盐是关键。耐心小心，密切监控微波炉的时间和小瓶内的温度。这一点至关重要，因为有许多移动部件要运行，这些部件通常很难通过传统的书面材料和方法部分进行传达。鉴于有许多蛋白质存在溶解性问题，无法进行充分的研究，因此这种方法有可能应用于各种蛋白质空间，以改善，甚至允许分析技术和表征。首先，选择一个干净和新的八毫升可自用的可硅酸盐玻璃培养瓶与橡胶衬里螺丝帽，并放置空小瓶在分析平衡。撕开空小瓶的质量，使天平读取零质量。将所需的冻干重组蜘蛛丝蛋白粉添加到空小瓶中，用于特定材料。然后，在小瓶中加入所需的超纯水量，至少两毫升。密封小瓶盖，轻快地旋转内容物，形成分散和均匀的重组蜘蛛丝蛋白混合物。对小瓶盖进行最后检查，以确保其已牢固而牢固地拧紧。然后，将悬浮重组蜘蛛丝蛋白混合物转移到功率范围为700至1500瓦的传统微波炉中。通过手动打开和关闭，以五秒的突发设置全功率的微波开始运行。每次爆裂后，短暂打开门，小心地混合小瓶，以防止沉降，并保持悬浮的混合物。偶尔让小瓶和溶液冷却，并防止过热溶液接触密封件。使用红外温度计测量含有小瓶部分溶液的温度。重复微波过程，直到温度达到至少130摄氏度，所有固体颗粒都完全溶解。然后，让溶液和瓶盖的温度冷却到100摄氏度以下。在完全冷却此溶液之前，从小瓶中铸造到特定的几何形状中，形成水凝胶。水凝胶形成后，将其放入水浴中，并在零下20摄氏度时将其转移到冰柜中。等到浴缸完全结冰。从冰柜中取出冷冻水凝胶和水浴，并在 25 摄氏度下解冻，从而完成海绵形成过程。然后，从解冻的水中取出产生的海绵。要制备 Lyogel，请将冷冻水凝胶样品转移到冻干剂中。24 小时后，从容器中去除最终的冻干凝胶材料。为了生产重组蜘蛛丝蛋白的薄膜，将200微升的热溶解重组蜘蛛丝蛋白从小瓶中投射到所需形状的PDMS形式上。干燥后，将脱皮从 PDMS 基材上剥下来进行测试或处理。要准备无法从基材上去除的涂层，请使用喷枪喷雾器应用溶解重组蜘蛛丝蛋白，在选择基材上执行初始喷涂涂层。干燥后，将涂层基材浸入溶解重组的蜘蛛丝蛋白中，形成浸渍涂层。重复浸渍涂层以达到所需的厚度。要形成粘合剂，请使用移液器将溶解重组蜘蛛丝蛋白添加到基材上，然后在溶液顶部涂抹第二个基板。将碎片牢牢地夹在一起，然后在最低温度为 25 摄氏度的烤箱中干燥样品至少 16 小时。要生成湿旋转纤维，请使用 19 量表滑翔针，并使用 Luer 锁尖将溶解的掺杂液溶液装入同心注射器中。弹出气泡，让兴奋剂坐在注射器的Luer锁端。将至少 25 毫米 PEEK 管插入 PEEK 管的一件手指紧贴件，用于一个直径超过 16 英寸的外径和 10 个超过 32 个梳子。在注射器的 Luer 锁母适配器上，用此设置更换 19 测量针。然后，将硝酸盐手套放在中间神套的外层，防止纤维打滑，避免损坏电机。获得一个高大的透明玻璃浴与99%纯异丙醇用作凝固浴。用 80 比 20 的异丙醇和蒸馏水填充第一个拉伸浴池。在第二个拉伸浴中，填充20至80比的异丙醇和蒸馏水。在计算机上设置神性拉伸系统。要调整光纤去除的主速度，请根据光纤成形的速度和速度，将三胞胎 A 速度的滑动杆调整为 10 到 14 毫米/秒的值。启动第一个拉伸通过移动滑动杆的神三 B 拉伸比为两为最后哥特在拉伸浴一，中上哥特，和第一个神在拉伸浴二。启动第二个拉伸，将神的滑动杆的三重 C 拉伸比移动到两个，为伸展浴二，最后一个上哥特，和风车的最后一个神道。此设置可确保凝固浴后的第一个神器，以及第一个拉伸浴中的第一个神器以相同的速度旋转。接下来，将丝绸溶液装在定制旋转线仪器的注射器中。在自动化系统中，将挤出速率设置为 10 毫米/秒，以便将丝绸溶液挤出到充满异丙醇的玻璃凝固浴中。在用薄金属钩将纤维从浴缸中拉出之前，让纤维挤压变得均匀。验证从浴池中去除纤维会在 PEEK 油管尖端和离开浴池的纤维路径之间产生循环。引导检索到的纤维通过一系列神器，使纤维淹没在拉伸浴池中，但在拉伸浴间和进入滑阀之前在空气中干燥。在此协议中，通过重组蜘蛛丝蛋白的溶解，可以实现多种材料形式。此处介绍了七种材料形式。水凝胶、胶胶、海绵、粘合剂、涂料、薄膜和纤维。纤维需要最广泛的处理，通过挤出到凝固浴，然后连续拉伸后箱拉伸浴中的生纤维。鉴于蛋白质和水溶液被加热到相对较高的温度和压力，我们的经验是，溶液在蛋白质溶解时是无菌的。这允许此处呈现的任何材料形式被带到细胞培养中，只要处理得当，它们就能够研究细胞对材料的反应。当然，这项技术已经导致发现了新的材料形式，包括粘合剂和海绵材料。材料形式不一定以纤维形成为导向，尽管纤维形成也是通过开发这种技术而得到改进的领域之一。在密封小瓶内产生热量和压力具有固有的危险性。执行这些程序时，始终佩戴个人防护设备。

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重组DNA和蛋白质复合物，用原子力显微镜的可视化

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利用双水相系统的细胞共培养图案

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空气过滤设备，包括非织造网格静电重组蜘蛛丝蛋白

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Several bacterial species possess the ability to attach to surfaces and colonize them in the form of thin films called biofilms. Biofilms that grow in ...

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An artificial lipid bilayer, or black lipid membrane (BLM), is a powerful tool for studying ion channels and protein interactions, as well as for ...

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The transmission of multiple independent optical signals through a multimode fiber is accomplished using wavefront shaping in order to compensate for the ...