Name: material formation of recombinant spider silks through aqueous solvation using heat and pressure
Uploaded: 2019-05-06T12:30:00
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Les auteurs aimeraient remercier avec gratitude le financement de l’initiative de recherche scientifique et technologique de l’Utah (USTAR).

1. préparation de mélange de soie d’araignée recombinante à partir de stocks protéiques lyophilisés
<ol><li>Déterminer la formulation et le volume nécessaires pour les formations de matériaux prévues. Les formulations typiques varient de 3% (w/v) à 15% (w/v). À l’aide de cette sélection, calculez les rSSp, les concentrations et les ratios appropriés.<ol>
<li>Utiliser les formulations respectives suivantes pour préparer chaque matière décrite dans le présent protocole: hydrogels/éponges/lyogels, 6...

<ol>
	<li>Huemmerich, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+Structure+Elements+of+Spider+Dragline+Silks+and+Their+Contribution+to+Protein+Solubility.">Primary Structure Elements of Spider Dragline Silks and Their Contribution to Protein Solubility.</a> Biochemistry. 43 (42), 13604-13612 (2004).</li><li>Schacht, K., Scheibel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled+Hydrogel+Formation+of+a+Recombinant+Spider+Silk+Protein.">Controlled Hydrogel Formation of a Recombinant Spider Silk Protein.</a> Biomacromolecules. 12 (7), 2488-2495 (2011).</li><li>Jones, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=More+Than+Just+Fibers:+An+Aqueous+Method+for+the+Production+of+Innovative+Recombinant+Spider+Silk+Protein+Materials.">More Than Just Fibers: An Aqueous Method for the Production of Innovative Recombinant Spider Silk Protein Materials.</a> Biomacromolecules. 16 (4), 1418-1425 (2015).</li><li>Tucker, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+and+Physical+Properties+of+Recombinant+Spider+Silk+Films+Using+Organic+and+Aqueous+Solvents.">Mechanical and Physical Properties of Recombinant Spider Silk Films Using Organic and Aqueous Solvents.</a> Biomacromolecules. 15 (8), 3158-3170 (2014).</li><li>Harris, T. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Sticky+Situation:+An+Investigation+of+Robust+Aqueous-Based+Recombinant+Spider+Silk+Protein+Coatings+and+Adhesives.">A Sticky Situation: An Investigation of Robust Aqueous-Based Recombinant Spider Silk Protein Coatings and Adhesives.</a> Biomacromolecules. 17 (11), 3761-3772 (2016).</li><li>Jones, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Importance+of+Heat+and+Pressure+for+Solubilization+of+Recombinant+Spider+Silk+Proteins+in+Aqueous+Solution.">Importance of Heat and Pressure for Solubilization of Recombinant Spider Silk Proteins in Aqueous Solution.</a> International Journal of Molecular Sciences. 17 (11), 1955 (2016).</li><li>Copeland, C. G., Bell, B. E., Christensen, C. D., Lewis, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+Process+for+the+Spinning+of+Synthetic+Spider+Silk.">Development of a Process for the Spinning of Synthetic Spider Silk.</a> ACS Biomaterials Science and Engineering. 1 (7), 557-584 (2015).</li><li>Arcidiacono, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aqueous+Processing+and+Fiber+Spinning+of+Recombinant+Spider+Silks.">Aqueous Processing and Fiber Spinning of Recombinant Spider Silks.</a> Macromolecules. 35 (4), 1262-1266 (2002).</li><li>Work, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+Major+Ampullate+Silk+Fiber+Formation+by+Orb-Web-Spinning+Spiders.">Mechanisms of Major Ampullate Silk Fiber Formation by Orb-Web-Spinning Spiders.</a> Transactions of the American Microscopical Society. 96 (2), 170-189 (1977).</li><li>Decker, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+for+the+Destruction+of+Endotoxin+in+Synthetic+Spider+Silk+Proteins.">Method for the Destruction of Endotoxin in Synthetic Spider Silk Proteins.</a> Scientific Reports. 8 (12166), 1-6 (2018).</li></ol>

Après que les protéines de soie d’araignée recombinantes soient purifiées, elles doivent ensuite être préparées dans une solution qui peut être utilisée pour la formation de matériaux. En mélangeant la protéine de soie d’araignée lyophilisée à l’eau et en exposant ce mélange à l’irradiation par micro-ondes, pour générer de la chaleur et de la pression, il est possible de préparer une solution rSSp. Une grande variété de formes matérielles peut être produite à partir de cette méthode simp...

Les soies d’araignée ont suscité l’intérêt des scientifiques matériels pour leur impressionnante combinaison de force, d’élasticité et de biocompatibilité. La recréation des fibres a traditionnellement été la poussée de la recherche. Cet effort a été entravé par la protéine de soie d’araignée recombinante (rSSp) insolubilité dans l’eau ainsi que l’incapacité des techniques de solvatation traditionnelles (agents chaotropes et détergents) pour obtenir la solvatation aqueuse. En outre, les techniques qui ont été développées pour la solvatation des versions de RSSP ne fonctionnent pas sur toutes les variantes RSSP et nécessitent également une manipulation substantielle et le temps qui se traduit souvent par la perte de protéine1,2. Cela s’est traduit en grande partie par le champ utilisant le 1, 1, 1, 3, 3, 3-hexafluoroisopropanol (HFIP) comme solvant pour former des fibres, et d’autres formes matérielles limitées. L’avantage étant que tous les rSSp connus sont solubles dans le HFIP, fournissant l’uniformité des données entre chaque groupe de recherche. L’inconvénient est que le HFIP est un solvant toxique qui est coûteux et peu pratique à l’échelle en raison de problèmes de santé et de considérations environnementales.
Une nouvelle approche de la solvatation rSSp a été développée qui a comblé l’écart technologique entre le solvant organique sévère HFIP et d’autres techniques qui ont fonctionné sélectivement pour la solvatation de rSSp. La combinaison de chaleurs et de pressions spécifiques a été appliquée aux suspensions de rSSp et d’eau. Les résultats ont été près de 100% de solvatation et de récupération du rSSp, ainsi que des concentrations élevées de protéines; une variété de formes de matériaux ont été déterminées comme étant possibles à partir de ces formulations qui n’étaient pas toutes réalisables à l’aide de HFIP ou d’autres solvants organiques3,4,5,6. L’objectif de cette approche est de solubiliser efficacement et facilement les protéines d’araignée recombinantes purifiées et séchées dans une solution aqueuse qui peut ensuite être utilisée pour la production d’une variété de formes matérielles.
Les fibres, les films, les revêtements, les adhésifs, les hydrogels, les lyogels, les microsphères et les matériaux éponge sont tous facilement utilisables à partir de la même solution aqueuse de rSSp utilisant cette méthode. L’évolution continue de cette méthode, non seulement avec rSSp supplémentaire, mais avec d’autres protéines, pourrait conduire à de nouvelles formes matérielles et alternatives de purification des protéines et des avenues de solubilisation.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:697px;" width="698">
	<tbody>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">3 mL Syringe with Luer-Lok Tip</td>
			<td style="width:148px;">BD</td>
			<td style="width:119px;">309657</td>
			<td style="width:215px;">Other size syringes can be used but to keep the tips on, it is advised to use luer-lok tips</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">4 mL culture vial, clear with rubber lined cap</td>
			<td style="width:148px;">Wheaton</td>
			<td style="width:119px;">225142</td>
			<td style="width:215px;">Minimum dope volume is 1mL, max is 2mL</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">8 mL culture vial, clear with rubber lined cap</td>
			<td style="width:148px;">Wheaton</td>
			<td style="width:119px;">225144</td>
			<td style="width:215px;">Minimum dope volume is 2mL, max is 4mL</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">99% Isopropyl Alcohol, Reagent ACS/USP Grade</td>
			<td style="width:148px;">Pharmco-Aaper</td>
			<td style="width:119px;">231000099</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Freezone 4.5 Plus</td>
			<td style="width:148px;">Labconco</td>
			<td style="width:119px;">7386030</td>
			<td>Freeze Dryer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Luer Adapter Female Luer x 10-32 Female, Tefzel (ETFE)</td>
			<td style="width:148px;">IDEX</td>
			<td style="width:119px;">P-629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:216px;">Microwave</td>
			<td style="width:148px;">Magic Chef</td>
			<td style="width:119px;">HMD1110B</td>
			<td style="width:215px;">120V, 60Hz AC; 1000 watts; 1.1 cu. ft. capacity; with glass turn table</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">One-Piece Fingertight 10-32 Coned, for 1/16&#34; OD</td>
			<td style="width:148px;">IDEX</td>
			<td style="width:119px;">F-120X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">PEEK Tubing 1/16&#34; OD x 0.010&#34; ID</td>
			<td style="width:148px;">IDEX</td>
			<td style="width:119px;">1531B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Sprayer: Master Airbrush</td>
			<td style="width:148px;">Master Airbrush</td>
			<td style="width:119px;">TC-60</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

material formation of recombinant spider silks through aqueous solvation using heat and pressure

De nombreuses araignées produisent sept types de soies. Six des soies sont des fibres sous forme lorsqu’elles sont produites par les araignées. Ces fibres ne sont pas solubles dans l’eau. Afin de reproduire les remarquables propriétés mécaniques des soies d’araignée, elles doivent être produites dans des hôtes hétérologues car les araignées sont à la fois territoriales et cannibales. Les analogues synthétiques de la soie d’araignée ont également tendance à être insoluble dans les solutions aqueuses. Ainsi, un grand pourcentage de recherches sur les soies d’araignée recombinantes reposent sur des solvants organiques qui nuisent à la production à grande échelle de matériaux. La méthode de notre groupe force la solvatation de ces soies d’araignée recombinantes dans l’eau. Remarquablement, lorsque ces protéines sont préparées à l’aide de cette méthode de chaleur et de pression, une large gamme de formes matérielles peut être préparée à partir de la même solution de protéines de soie d’araignée recombinantes (rSSp), y compris: films, fibres, éponge, hydrogel, lyogel, et adhésifs. Cet article démontre la production du rSSp solvaté et des formes matérielles d’une manière plus facile à comprendre que des matériaux écrits et des méthodes seules.

De la méthode décrite de solubilisation de rSSp, une variété de formes matérielles peut être obtenue comme on le voit dans la figure 1. La méthode de solubilisation est d’appliquer la chaleur et la pression, générées par un micro-ondes conventionnel, à une suspension de rSSp et d’eau. Lorsque des températures et des pressions critiques sont atteintes, la protéine se solubiliser. De cette solution solubilisée de rSSp, les conditions requises ...

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Material Formation of Recombinant Spider Silks through Aqueous Solvation using Heat and Pressure

Formation matérielle de soies d’araignée recombinantes par solvatation aqueuse utilisant la chaleur et la pression

Ici, nous présentons un protocole pour produire des solutions de protéines de soie d’araignée recombinantes solubles dans l’eau et les formes matérielles qui peuvent être formées à partir de ces solutions.

Many spiders produce seven types of silks. Six of the silks are fiber in form when produced by the spiders. These fibers are not water soluble. In order ...

Cette méthode de solubilisation des soies d’araignée recombinantes produit des formes matérielles qui ne sont pas possibles à l’aide de solvants organiques durs traditionnels. En outre, le processus est le grain, résultant en une solution protéique simple dans l’eau. En utilisant cette méthode, les matériaux formés ou produits maintiennent les caractéristiques souhaitables des protéines de soie d’araignée.Cette technique de solubilisation pour les soies d’araignée recombinantes permet la solubilisation des soies d’araignée recombinantes en une seule étape. Cela est souhaitable parce que ces protéines notoirement difficiles à produire ne sont pas perdues par un traitement approfondi. En outre, puisque les solutions ne sont que des protéines dans l’eau, d’autres composés biologiquement actifs peuvent être ajoutés si cela est souhaitable pour l’application.En particulier, la relation de fonction de structure de protéine, ce système est mèmetic à la façon dont une araignée fait une fibre en ce qu’elle utilise l’eau et les protéines à une concentration élevée. En utilisant cette méthode de solubilisation et une formation matérielle ultérieure, il devrait être possible d’acquérir une compréhension dans les matériaux qui sont formés, et les structures qui en sont responsables. On pense qu’il peut être, nous avons utilisé cette technique pour solubiliser les peptides synthétiques qui autrement nécessiteraient un environnement alcalin ou acide pour se dissoudre.Cela peut être avantageux dans les applications en aval pour ces peptides. En outre, un certain nombre de protéines connues lorsqu’elles sont exprimées synthétiquement ont tendance à se retrouver dans la fraction insoluble. Resolubiliser, puis refolding ces protéines est souvent un processus laborieux qui entraîne de grandes pertes.En utilisant cette technique, il pourrait être possible d’augmenter l’efficacité des processus de récupération des protéines insolubles. Placer un flacon scellé dans un four à micro-ondes est un peu intimidant donnant le risque de surchauffe et donc sur pressurisation du flacon. Il est essentiel de comprendre l’approche par étapes de l’application de la chaleur et de la pression.Deuxièmement, pour la soie d’araignée recombinante en particulier, le fait d’avoir du sel présent ne permettra pas à la technique de fonctionner ou de fonctionner aussi efficacement selon la quantité de sel présente. L’enlèvement du sel est la clé. Soyez patient et prudent, surveillez de près les temps et les températures de votre micro-ondes à l’intérieur du flacon.C’est essentiel parce qu’il y a un certain nombre de pièces mobiles à utiliser qui sont souvent difficiles à transmettre à travers les documents écrits traditionnels et les sections de méthode. Étant donné qu’il existe de nombreuses protéines qui ont des problèmes de solubilité qui empêchent une étude adéquate, cette méthode a le potentiel d’être appliquée sur une variété d’espaces protéiques pour améliorer, ou même permettre des techniques analytiques et la caractérisation. Pour commencer, choisissez un flacon de culture de borosilicate autoclaveable propre et neuf de huit millilitres avec un bouchon à vis doublé de caoutchouc, et placez le flacon vide sur un équilibre analytique.Déchirer la masse du flacon vide de sorte que l’équilibre se lit masse zéro. Ajouter la poudre de protéine de soie d’araignée recombinante lyophilisée désirée au flacon vide pour le matériau spécifique. Ensuite, ajoutez la quantité désirée d’eau ultra pure, au moins deux millilitres, au flacon.Sceller le bouchon de flacon, et vortex vivement le contenu pour créer un mélange dispersé et homogène de protéines de soie d’araignée recombinante. Effectuez une vérification finale du bouchon de flacon pour vous assurer qu’il a été solidement et solidement serré. Ensuite, transférez le mélange de protéines de soie d’araignée recombinante en suspension dans un four à micro-ondes conventionnel d’une puissance de 700 à 1500 watts.Commencez le fonctionnement du four à micro-ondes avec des rafales de cinq secondes réglées à pleine puissance en allumant et éteignez manuellement. Après chaque éclatement, ouvrez brièvement la porte et mélangez soigneusement le flacon pour éviter le tassement et maintenez le mélange suspendu. Laissez parfois refroidir le flacon et la solution et empêchez la solution surchauffée de toucher le joint.Utilisez un thermomètre infrarouge pour mesurer la température de la solution contenant une partie du flacon. Répétez le processus de micro-ondes jusqu’à ce que la température atteigne au moins 130 degrés Celsius, et tous les particules solides ont été complètement dissous. Ensuite, laissez la température de la solution et le bouchon de flacon refroidir en dessous de 100 degrés Celsius.Avant que cette solution ne soit complètement refroidie, jetez-la du flacon dans des géométries spécifiques pour former un hydrogel. Après la formation de l’hydrogel, placez-le dans un bain d’eau et transférez-le au congélateur à moins 20 degrés Celsius. Attendez que le bain soit complètement congelé.Terminer le processus de formation de l’éponge en enlevant l’hydrogel congelé et le bain d’eau du congélateur, et en décongelant à 25 degrés Celsius. Ensuite, retirez l’éponge résultante de l’eau décongelée. Pour préparer un lyogel, transférer un échantillon d’hydrogel congelé à un lyophilisateur.Après 24 heures, retirer le matériel de gel lyophilisé final du navire. Pour produire des films de protéines recombinantes de soie d’araignée, jetez 200 microlitres de la protéine de soie d’araignée recombinante solubilisée chaude du flacon sur une forme PDMS de la forme désirée. Une fois séché, peler le substrat PDMS pour les tester ou les soigner.Pour préparer un revêtement qui ne peut pas être retiré du substrat, utilisez un pulvérisateur d’aérographe pour appliquer la protéine solubilisée de soie d’araignée recombinante pour effectuer un revêtement initial de pulvérisation sur le substrat de choix. Après avoir séché, submergez le substrat enduit dans la protéine de soie d’araignée recombinante solubilisée pour former un revêtement de trempette. Répétez le revêtement de trempette pour atteindre l’épaisseur désirée.Pour former des adhésifs, utilisez une pipette pour ajouter la protéine solubilisée de soie d’araignée recombinante sur un substrat, puis appliquez un deuxième substrat sur le dessus de la solution. Serrez fermement les morceaux ensemble, puis séchez les échantillons dans un four avec une température minimale de 25 degrés Celsius pendant au moins 16 heures. Pour générer des fibres filées humides, utilisez une aiguille de glisse de calibre 19 et chargez la solution de dope solubilisée dans une seringue concentrique avec une pointe de serrure Luer.Éjectez les bulles d’air et laissez la dope s’asseoir à l’extrémité de la serrure Luer de la seringue. Insérez au moins 25 millimètres de tubes PEEK dans les raccords serrés à doigts d’une seule pièce du tube PEEK pour un diamètre extérieur de plus de 16 pouces et 10 peigne de plus de 32. Remplacez l’aiguille de calibre 19 par cette configuration sur l’adaptateur femelle de serrure Luer de la seringue.Ensuite, placez des gants de nitrile à l’extérieur des godets intermédiaires, pour empêcher la fibre d’être produite de glisser, et pour éviter d’endommager les moteurs. Obtenez un grand bain en verre clair avec 99% d’isopropanol pur à utiliser comme bain de coagulation. Remplissez le premier bain extensible d’un rapport de 80 à 20 d’isopropanol et d’eau distillée.Dans le deuxième bain extensible, remplir un rapport de 20 à 80 d’isopropanol et d’eau distillée. Installez le système d’étirement godet sur l’ordinateur. Pour ajuster la vitesse principale de l’enlèvement de la fibre, ajustez la barre coulissante pour la vitesse du tripleT A de godet à une valeur comprise entre 10 et 14 millimètres par seconde, selon la façon dont la fibre se forme rapidement.Amorcer une première ligne droite en déplaçant la barre coulissante du rapport godet triple B stretch à deux Pour le godet final dans le bain extensible un, Le godet supérieur moyen, et le premier godet dans le bain extensible deux. Lancez la deuxième ligne droite en déplaçant la barre coulissante du rapport godet triple C stretch à deux pour le godet final dans le bain extensible deux, le dernier godet supérieur, et le winder. Cette configuration assure que le premier godet après le bain de coagulation, et le premier godet dans le premier bain extensible tournent à la même vitesse.Ensuite, chargez la solution de soie dans la seringue d’un instrument de spin line personnalisé. Dans le système automatisé, réglez le taux d’extrusion à 10 millimètres par seconde, afin d’extruder la solution de soie dans le bain de coagulation en verre rempli d’isopropanol. Laissez l’extrusion de fibre devenir uniforme, avant de tirer les fibres hors du bain avec un crochet en métal mince.Vérifiez que l’élimination de la fibre du bain crée une boucle entre la pointe du tube PEEK et le chemin de la fibre sortant du bain. Guidez la fibre récupérée à travers la série de godets, de sorte que la fibre est immergée dans les bains extensibles, mais le séchage dans l’air entre les bains extensibles, et avant d’aller sur une bobine. Dans ce protocole par une solubilisation de la protéine recombinante de soie d’araignée, une série de formes matérielles peuvent être réalisées.Sept formes matérielles sont présentées ici. Hydrogels, lyogels, éponge, adhésifs, revêtements, films et fibres. Les fibres nécessitent le traitement le plus étendu en extrextrugeant dans un bain de coagulation, puis en étirant périodiquement la fibre brute dans les bains extensibles post-bac.Étant donné que les solutions de protéines et d’eau sont chauffées à une température et une pression relativement élevées, notre expérience a été que les solutions sont stériles au point où la protéine est résolue. Cela permet à l’une des formes matérielles présentées ici d’être prises à la culture cellulaire, tant qu’ils sont manipulés de manière appropriée, pour étudier la réponse cellulaire aux matériaux. Certes, cette technique a conduit à la découverte de nouvelles formes matérielles, y compris les adhésifs et les matériaux éponge.Formes matérielles qui ne sont pas nécessairement orientées vers la formation de fibres, bien que la formation de fibres est l’un des domaines qui a également connu une amélioration par le développement de cette technique. Générer de la chaleur et de la pression à l’intérieur d’un flacon scellé a un danger inhérent. Portez toujours de l’équipement de protection individuelle lorsque vous effectuez ces procédures.

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