Name: material formation of recombinant spider silks through aqueous solvation using heat and pressure
Uploaded: 2019-05-06T12:30:00
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Gli autori vorrebbero ringraziare con gratitudine i finanziamenti dell'iniziativa Utah Science and Technology Research (USTAR).

1. preparazione della miscela di seta di ragno ricombinante da scorte proteiche liofilizzate
<ol><li>Determinare la formulazione e il volume necessari per le formazioni di materiale previste. Le formulazioni tipiche vanno dal 3% (w/v) fino al 15% (p/v). Utilizzando questa selezione, calcolare l'rSSp, le concentrazioni e i rapporti appropriati.<ol>
<li>Utilizzare le seguenti formulazioni per preparare ogni materiale descritto nel presente protocollo: idrogel/spugne/lyogel, 6% (p/v) 50:50 MaSp1: MaSp2; film/rivestimenti,...

<ol>
	<li>Huemmerich, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+Structure+Elements+of+Spider+Dragline+Silks+and+Their+Contribution+to+Protein+Solubility.">Primary Structure Elements of Spider Dragline Silks and Their Contribution to Protein Solubility.</a> Biochemistry. 43 (42), 13604-13612 (2004).</li><li>Schacht, K., Scheibel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled+Hydrogel+Formation+of+a+Recombinant+Spider+Silk+Protein.">Controlled Hydrogel Formation of a Recombinant Spider Silk Protein.</a> Biomacromolecules. 12 (7), 2488-2495 (2011).</li><li>Jones, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=More+Than+Just+Fibers:+An+Aqueous+Method+for+the+Production+of+Innovative+Recombinant+Spider+Silk+Protein+Materials.">More Than Just Fibers: An Aqueous Method for the Production of Innovative Recombinant Spider Silk Protein Materials.</a> Biomacromolecules. 16 (4), 1418-1425 (2015).</li><li>Tucker, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+and+Physical+Properties+of+Recombinant+Spider+Silk+Films+Using+Organic+and+Aqueous+Solvents.">Mechanical and Physical Properties of Recombinant Spider Silk Films Using Organic and Aqueous Solvents.</a> Biomacromolecules. 15 (8), 3158-3170 (2014).</li><li>Harris, T. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Sticky+Situation:+An+Investigation+of+Robust+Aqueous-Based+Recombinant+Spider+Silk+Protein+Coatings+and+Adhesives.">A Sticky Situation: An Investigation of Robust Aqueous-Based Recombinant Spider Silk Protein Coatings and Adhesives.</a> Biomacromolecules. 17 (11), 3761-3772 (2016).</li><li>Jones, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Importance+of+Heat+and+Pressure+for+Solubilization+of+Recombinant+Spider+Silk+Proteins+in+Aqueous+Solution.">Importance of Heat and Pressure for Solubilization of Recombinant Spider Silk Proteins in Aqueous Solution.</a> International Journal of Molecular Sciences. 17 (11), 1955 (2016).</li><li>Copeland, C. G., Bell, B. E., Christensen, C. D., Lewis, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+Process+for+the+Spinning+of+Synthetic+Spider+Silk.">Development of a Process for the Spinning of Synthetic Spider Silk.</a> ACS Biomaterials Science and Engineering. 1 (7), 557-584 (2015).</li><li>Arcidiacono, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aqueous+Processing+and+Fiber+Spinning+of+Recombinant+Spider+Silks.">Aqueous Processing and Fiber Spinning of Recombinant Spider Silks.</a> Macromolecules. 35 (4), 1262-1266 (2002).</li><li>Work, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+Major+Ampullate+Silk+Fiber+Formation+by+Orb-Web-Spinning+Spiders.">Mechanisms of Major Ampullate Silk Fiber Formation by Orb-Web-Spinning Spiders.</a> Transactions of the American Microscopical Society. 96 (2), 170-189 (1977).</li><li>Decker, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+for+the+Destruction+of+Endotoxin+in+Synthetic+Spider+Silk+Proteins.">Method for the Destruction of Endotoxin in Synthetic Spider Silk Proteins.</a> Scientific Reports. 8 (12166), 1-6 (2018).</li></ol>

Dopo che le proteine di seta del ragno ricombinante vengono purificate, devono essere preparate in una soluzione che può essere utilizzata per la formazione del materiale. Mescolando proteina di seta di ragno liofilizzata con acqua ed esponendo questa miscela all'irraggiamento a microonde, per generare calore e pressione, è possibile preparare una soluzione rSSp. Una vasta gamma di forme di materiale può essere prodotta da questo metodo semplice ed efficiente di solubilizzazione rSSp. Ogni materiale deve essere prepar...

I sete ragno hanno raccolto l'interesse degli scienziati materiali per la loro impressionante combinazione di forza, elasticità e biocompatibilità. Ricreare le fibre è stata tradizionalmente la spinta della ricerca. Questo sforzo è stato ostacolato dall'insolubilità di proteina di seta del ragno ricombinante (rSSp) in acqua, nonché dall'incapacità delle tecniche di solvazione tradizionali (agenti chaotropici e detergenti) di raggiungere la solvazione acquosa. Inoltre, le tecniche sviluppate per le versioni solvatanti di RSSP non funzionano su tutte le varianti RSSP e richiedono anche una manipolazione e un tempo sostanziali che spesso si traduce in perdita di proteine1,2. Questo ha portato in gran parte il campo utilizzando 1, 1, 1, 3, 3, 3-hexafluoroisopropanolo (HFIP) come un solvente da cui formare fibre, e altre forme limitate di materiale. Il vantaggio è che tutti i rSSp conosciuti sono solubili in HFIP, fornendo uniformità dei dati tra ogni gruppo di ricerca. Lo svantaggio è che HFIP è un solvente tossico che è costoso e poco pratico per scalare a causa di problemi di salute e considerazioni ambientali.
È stato sviluppato un nuovo approccio alla solvazione rSSp che ha colato il divario tecnologico tra il duro solvente organico HFIP e altre tecniche che hanno funzionato selettivamente per la solvazione rSSp. La combinazione di manches e pressioni specifiche è stata applicata alle sospensioni di rSSp e acqua. I risultati sono stati quasi 100% di solvazione e recupero del rSSp, nonché alte concentrazioni proteiche; una varietà di forme di materiali sono stati determinati per essere possibile da queste formulazioni che non erano tutti ottenibili utilizzando HFIP o altri solventi organici3,4,5,6. L'obiettivo di questo approccio è quello di solubilizzare efficacemente e facilmente le proteine del ragno ricombinante depurato e essiccato in una soluzione acquosa che può essere utilizzata per la produzione di una varietà di forme di materiale.
Fibre, pellicole, Rivestimenti, adesivi, idrogel, lyogel, microsfere e materiali in spugna sono tutti facilmente realizzabili dalla stessa soluzione acquosa di rSSp con questo metodo. L'evoluzione continua di questo metodo, non solo con ulteriori rSSp ma con altre proteine, potrebbe portare a nuove forme di materiale e vie alternative di purificazione e solubilizzazione delle proteine.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:697px;" width="698">
	<tbody>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">3 mL Syringe with Luer-Lok Tip</td>
			<td style="width:148px;">BD</td>
			<td style="width:119px;">309657</td>
			<td style="width:215px;">Other size syringes can be used but to keep the tips on, it is advised to use luer-lok tips</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">4 mL culture vial, clear with rubber lined cap</td>
			<td style="width:148px;">Wheaton</td>
			<td style="width:119px;">225142</td>
			<td style="width:215px;">Minimum dope volume is 1mL, max is 2mL</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">8 mL culture vial, clear with rubber lined cap</td>
			<td style="width:148px;">Wheaton</td>
			<td style="width:119px;">225144</td>
			<td style="width:215px;">Minimum dope volume is 2mL, max is 4mL</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">99% Isopropyl Alcohol, Reagent ACS/USP Grade</td>
			<td style="width:148px;">Pharmco-Aaper</td>
			<td style="width:119px;">231000099</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Freezone 4.5 Plus</td>
			<td style="width:148px;">Labconco</td>
			<td style="width:119px;">7386030</td>
			<td>Freeze Dryer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Luer Adapter Female Luer x 10-32 Female, Tefzel (ETFE)</td>
			<td style="width:148px;">IDEX</td>
			<td style="width:119px;">P-629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:216px;">Microwave</td>
			<td style="width:148px;">Magic Chef</td>
			<td style="width:119px;">HMD1110B</td>
			<td style="width:215px;">120V, 60Hz AC; 1000 watts; 1.1 cu. ft. capacity; with glass turn table</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">One-Piece Fingertight 10-32 Coned, for 1/16&#34; OD</td>
			<td style="width:148px;">IDEX</td>
			<td style="width:119px;">F-120X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">PEEK Tubing 1/16&#34; OD x 0.010&#34; ID</td>
			<td style="width:148px;">IDEX</td>
			<td style="width:119px;">1531B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Sprayer: Master Airbrush</td>
			<td style="width:148px;">Master Airbrush</td>
			<td style="width:119px;">TC-60</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

material formation of recombinant spider silks through aqueous solvation using heat and pressure

Molti ragni producono sette tipi di sete. Sei dei sete sono fibre in forma quando prodotte dai ragni. Queste fibre non sono solubili in acqua. Al fine di riprodurre le notevoli proprietà meccaniche delle sete di ragno, devono essere prodotte in padroni eterolodi come i ragni sono sia territoriali che cannibali. Anche gli analoghi sintetici della seta di ragno tendono ad essere insolubili in soluzioni acquose. Così, una grande percentuale di ricerca in sete di ragno ricombinante si basano su solventi organici che sono dannosi per la produzione su larga scala di materiali. Il metodo del nostro gruppo costringe la solvazione di questi sete di ragno ricombinanti in acqua. Sorprendentemente, quando queste proteine sono preparate utilizzando questo metodo di calore e pressione, una vasta gamma di forme di materiale può essere preparata dalla stessa soluzione di proteine di seta ragno ricombinante (rSSp) tra cui: film, fibre, spugna, hydrogel, lyogel, e adesivi. Questo articolo illustra la produzione di RSSP e forme di materiale solvatato in un modo che è più facilmente comprensibile che da solo materiali e metodi scritti.

Dal metodo descritto di solubilizzazione di rSSp, una varietà di forme di materiale può essere ottenuta come si vede nella Figura 1. Il metodo di solubilizzazione è quello di applicare calore e pressione, generata da un forno a microonde convenzionale, ad una sospensione di rSSp e acqua. Quando si raggiungono temperature e pressioni critiche, la proteina si solubilizza. Da questa soluzione di rSSp solubilizzata, le condizioni richieste sono presentate per ...

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Material Formation of Recombinant Spider Silks through Aqueous Solvation using Heat and Pressure

Formazione del materiale di sete di ragno ricombinante attraverso la Solvazione acquosa utilizzando calore e pressione

Qui, presentiamo un protocollo per produrre soluzioni di proteina di seta ragno ricombinante solubile in acqua e le forme di materiale che possono essere formate da queste soluzioni.

Many spiders produce seven types of silks. Six of the silks are fiber in form when produced by the spiders. These fibers are not water soluble. In order ...

Questo metodo di solubilizzazione delle sete di ragno ricombinante produce forme di materiale che non sono possibili utilizzando solventi organici duri tradizionali. Inoltre, il processo è grano, risultando in una semplice soluzione proteica in acqua. Utilizzando questo metodo, i materiali formati o prodotti mantengono le caratteristiche desiderabili delle proteine della seta di ragno.Questa tecnica di solubilizzazione per sete di ragno ricombinante consente la solubilizzazione delle sete di ragno ricombinante in un processo in un'unica fase. Questo è desiderabile perché queste proteine notoriamente difficili da produrre non vengono perse attraverso un'ampia lavorazione. Inoltre, poiché le soluzioni sono solo proteine in acqua, altri composti biologicamente attivi possono essere aggiunti se ciò è auspicabile per l'applicazione.In particolare, la relazione di funzione della struttura proteica, questo sistema è memetico a come un ragno produce una fibra in quanto utilizza acqua e proteine ad alta concentrazione. Utilizzando questo metodo di solubilizzazione e una successiva formazione del materiale, dovrebbe essere possibile comprendere i materiali che si formano e le strutture che ne sono responsabili. Si pensa che possa essere, abbiamo usato questa tecnica per solubilizzare peptidi sintetici che altrimenti richiederebbero un ambiente alcalino o acido per solvarsi.Questo può essere vantaggioso nelle applicazioni a valle per quei peptidi. Inoltre, un certo numero di proteine conosciute quando espresse sinteticamente tendono a finire nella frazione insolubile. La risolubilizzazione, e poi il ripienderamento di queste proteine è spesso un processo laborioso che si traduce in grandi perdite.Utilizzando questa tecnica, potrebbe essere possibile aumentare l'efficienza dei processi di recupero per le proteine insolubili. Posizionare una fiala sigillata in un forno a microonde è un po 'scoraggiante dando il rischio di surriscaldamento e quindi di pressurizzazione del flaconcino. Comprendere l'approccio a fasi per l'applicazione di calore e pressione è fondamentale.In secondo luogo, per la seta di ragno ricombinante in particolare, avere sale presente non permetterà alla tecnica di funzionare o funzionare in modo così efficace a seconda di quanto sale è presente. La rimozione del sale è la chiave. Sii paziente e attento, monitora attentamente i tempi e le temperature del microonde all'interno del flaconcino.È fondamentale perché ci sono un certo numero di parti mobili al funzionamento che sono spesso difficili da trasportare attraverso i materiali scritti tradizionali e le sezioni del metodo. Dato che ci sono molte proteine che hanno problemi di solubilità che impediscono uno studio adeguato, questo metodo ha il potenziale per essere applicato attraverso una varietà di spazi proteici per migliorare, o addirittura consentire tecniche analitiche e caratterizzazione. Per iniziare, selezionare una fiala di coltura in vetro borosilicabile autoclavebile da otto millilitri pulita e nuova con un tappo a vite foderato in gomma e posizionare il flaconcino vuoto su un equilibrio analitico.Strappare la massa della fiala vuota in modo che il saldo legga la massa zero. Aggiungere la polvere di proteina di seta di ragno ricombinante lyophilizzata desiderata alla fiala vuota per il materiale specifico. Quindi, aggiungere la quantità desiderata di acqua ultra pura, almeno due millilitri, al flaconcino.Sigillare il cappuccio della fiala e vortice vivacemente il contenuto per creare una miscela di proteine di seta di ragno ricombinante disperse e omogenee. Eseguire un controllo finale del cappuccio del flaconcino per assicurarsi che sia stato serrato saldamente e saldamente. Quindi, trasferire la miscela di proteine di seta di ragno ricombinante sospesa in un forno a microonde convenzionale con una gamma di potenza da 700 a 1500 watt.Inizia il funzionamento del microonde con raffiche di cinque secondi impostate a piena potenza accendendo e spegnendo manualmente. Dopo ogni scoppio, aprire brevemente la porta e mescolare accuratamente la fiala per evitare la sedimentazione e mantenere la miscela sospesa. Occasionalmente lasciare raffreddare il flaconcino e la soluzione e impedire alla soluzione surriscaldata di toccare la guarnizione.Utilizzare un termometro a infrarossi per misurare la temperatura della soluzione contenente la porzione del flaconcino. Ripetere il processo a microonde fino a quando la temperatura raggiunge almeno 130 gradi Celsius e tutte le particelle solide sono state completamente sciolte. Quindi, lasciare raffreddare la temperatura della soluzione e del cappuccio del flaconcino al di sotto dei 100 gradi Celsius.Prima che questa soluzione venga completamente raffreddata, gettarla dalla fiala in geometrie specifiche per formare un idrogel. Dopo aver formato l'idrogel, posizionarlo in un bagno d'acqua e trasferirlo nel congelatore a meno 20 gradi Celsius. Attendere che il bagno sia completamente congelato.Completare il processo di formazione della spugna rimuovendo l'idrogel congelato e il bagno d'acqua dal congelatore e scongelando a 25 gradi Celsius. Quindi, rimuovere la spugna risultante dall'acqua scongelata. Per preparare un lyogel, trasferire un campione di idrogel congelato in un lyophilizer.Dopo 24 ore, rimuovere il materiale gel licofilizzato finale dal vaso. Per produrre pellicole di proteina della seta ragno ricombinante, lanciare 200 microlitri della proteina della seta di ragno ricombinante solubilizzata a caldo dal flaconcino a una forma PDMS della forma desiderata. Dopo che è stato asciugato, staccarlo dal substrato PDMS per il test o il trattamento.Per preparare un rivestimento che non può essere rimosso dal substrato, utilizzare uno spruzzatore di aerografo per applicare la proteina solubilizzata della seta di ragno ricombinante per eseguire un rivestimento spray iniziale sul substrato di scelta. Dopo che è stato asciugato, immergere il substrato rivestito nella proteina solubilizzata della seta di ragno ricombinante per formare un rivestimento di immersione. Ripetere il rivestimento del tuffo per ottenere lo spessore desiderato.Per formare adesivi, utilizzare una pipetta per aggiungere la proteina solubilizzata della seta di ragno ricombinante su un substrato, quindi applicare un secondo substrato sopra la parte superiore della soluzione. Fissare saldamente i pezzi insieme, quindi asciugare i campioni in un forno con una temperatura minima di 25 gradi Celsius per almeno 16 ore. Per generare fibre filate bagnate, utilizzare un ago di planata calibro 19 e caricare la soluzione di droga solubilizzata in una siringa concentrica con una punta di blocco Luer.Espellere le bolle d'aria e lasciare che la droga si sieda all'estremità della serratura Luer della siringa. Inserire almeno 25 millimetri di tubi PEEK nei raccordi aderente con un solo pezzo del tubo PEEK per un diametro esterno superiore a 16 pollici e 10 su 32 pettini. Sostituire l'ago calibro 19 con questa configurazione sull'adattatore femmina di blocco Luer della siringa.Quindi, posizionare guanti di nitrile all'esterno delle divinità intermedie, per evitare che la fibra venga generata dallo scivolamento e per evitare di danneggiare i motori. Ottieni un alto bagno di vetro trasparente con isopropanolo puro al 99% da utilizzare come bagno di coagulazione. Riempire il primo bagno elasticizzato con un rapporto da 80 a 20 di isopropanolo e acqua distillata.Nel secondo bagno elasticizzato, riempire un rapporto da 20 a 80 di isopropanolo e acqua distillata. Impostare il sistema di estensione godet sul computer. Per regolare la velocità principale della rimozione della fibra, regolare la barra scorrevole per la tripletta godet Una velocità a un valore compreso tra 10 e 14 millimetri al secondo, a seconda di quanto bene e rapidamente la fibra si sta formando.Inizia un primo tratto spostando la barra scorrevole del rapporto di stiramento b tripla godet a due Per la godet finale nel bagno elasticizzato uno, La godet superiore centrale e la prima godet nel bagno di tratto due. Inizia il secondo tratto spostando la barra scorrevole del rapporto di allungamento della tripla C godet a due per la godet finale nel bagno elasticizzato due, l'ultima godet superiore e il winder. Questa configurazione assicura che la prima godet dopo il bagno di coagulazione e la prima godet nel primo bagno elasticizzato ruotano alla stessa velocità.Quindi, caricare la soluzione di seta nella siringa di uno strumento di linea di spin personalizzato. Nel sistema automatizzato, impostare la velocità di estrusione a 10 millimetri al secondo, al fine di estrudere la soluzione di seta nel bagno di coagulazione del vetro riempito con isopropanolo. Lasciare che l'estrusione della fibra diventi uniforme, prima di estrarre le fibre dal bagno con un sottile gancio metallico.Verificare che la rimozione della fibra dal bagno crei un anello tra la punta del tubo PEEK e il percorso della fibra che esce dal bagno. Guida la fibra recuperata attraverso la serie di godet, in modo che la fibra sia immersa nei bagni elastici, ma asciugandosi nell'aria tra i bagni elastici e prima di andare su una bobina. In questo protocollo attraverso una solubilizzazione della proteina della seta di ragno ricombinante, è possibile ottenere una varietà di forme di materiale.Qui vengono presentate sette forme materiali. Idrogel, liogel, spugna, adesivi, rivestimenti, pellicole e fibre. Le fibre richiedono la lavorazione più estesa estrudendosi in un bagno di coagulazione e quindi allungando serialmente la fibra grezza nei bagni elasticizzati post-bin.Dato che le soluzioni proteiche e idriche vengono riscaldate a una temperatura e una pressione relativamente elevate, la nostra esperienza è stata che le soluzioni sono sterili nel momento in cui la proteina viene solvata. Ciò consente a qualsiasi forma materiale qui presentata di essere portata alla coltura cellulare, purché siano gestite in modo appropriato, per studiare la risposta cellulare ai materiali. Certamente questa tecnica ha portato alla scoperta di nuove forme di materiale, tra cui adesivi e materiale spugna.Forme materiali che non sono necessariamente orientate verso la formazione di fibre, anche se la formazione di fibre è una delle aree che ha anche visto miglioramenti attraverso lo sviluppo di questa tecnica. Generare calore e pressione all'interno di una fiala sigillata ha un pericolo intrinseco. Indossare sempre dispositivi di protezione individuale quando si eseguono queste procedure.

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