Name: material formation of recombinant spider silks through aqueous solvation using heat and pressure
Uploaded: 2019-05-06T12:30:00
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Os autores gostariam de agradecer com gratidão o financiamento da iniciativa de pesquisa de ciência e tecnologia de Utah (USTAR).

1. preparação da mistura de seda da aranha de recombinação dos estoques liofilizados da proteína
<ol><li>Determine a formulação e o volume necessários para as formações materiais pretendidas. As formulações típicas variam de 3% (w/v) até 15% (w/v). Usando essa seleção, calcule o rSSp, as concentrações e as proporções apropriadas.<ol>
<li>Utilizar as seguintes formulações para preparar cada material descrito neste protocolo: hidrogéis/esponjas/lyogels, 6% (p/v) 50:50 MaSp1: MaSp2; filmes/revestime...

<ol>
	<li>Huemmerich, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+Structure+Elements+of+Spider+Dragline+Silks+and+Their+Contribution+to+Protein+Solubility.">Primary Structure Elements of Spider Dragline Silks and Their Contribution to Protein Solubility.</a> Biochemistry. 43 (42), 13604-13612 (2004).</li><li>Schacht, K., Scheibel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled+Hydrogel+Formation+of+a+Recombinant+Spider+Silk+Protein.">Controlled Hydrogel Formation of a Recombinant Spider Silk Protein.</a> Biomacromolecules. 12 (7), 2488-2495 (2011).</li><li>Jones, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=More+Than+Just+Fibers:+An+Aqueous+Method+for+the+Production+of+Innovative+Recombinant+Spider+Silk+Protein+Materials.">More Than Just Fibers: An Aqueous Method for the Production of Innovative Recombinant Spider Silk Protein Materials.</a> Biomacromolecules. 16 (4), 1418-1425 (2015).</li><li>Tucker, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+and+Physical+Properties+of+Recombinant+Spider+Silk+Films+Using+Organic+and+Aqueous+Solvents.">Mechanical and Physical Properties of Recombinant Spider Silk Films Using Organic and Aqueous Solvents.</a> Biomacromolecules. 15 (8), 3158-3170 (2014).</li><li>Harris, T. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Sticky+Situation:+An+Investigation+of+Robust+Aqueous-Based+Recombinant+Spider+Silk+Protein+Coatings+and+Adhesives.">A Sticky Situation: An Investigation of Robust Aqueous-Based Recombinant Spider Silk Protein Coatings and Adhesives.</a> Biomacromolecules. 17 (11), 3761-3772 (2016).</li><li>Jones, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Importance+of+Heat+and+Pressure+for+Solubilization+of+Recombinant+Spider+Silk+Proteins+in+Aqueous+Solution.">Importance of Heat and Pressure for Solubilization of Recombinant Spider Silk Proteins in Aqueous Solution.</a> International Journal of Molecular Sciences. 17 (11), 1955 (2016).</li><li>Copeland, C. G., Bell, B. E., Christensen, C. D., Lewis, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+Process+for+the+Spinning+of+Synthetic+Spider+Silk.">Development of a Process for the Spinning of Synthetic Spider Silk.</a> ACS Biomaterials Science and Engineering. 1 (7), 557-584 (2015).</li><li>Arcidiacono, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aqueous+Processing+and+Fiber+Spinning+of+Recombinant+Spider+Silks.">Aqueous Processing and Fiber Spinning of Recombinant Spider Silks.</a> Macromolecules. 35 (4), 1262-1266 (2002).</li><li>Work, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+Major+Ampullate+Silk+Fiber+Formation+by+Orb-Web-Spinning+Spiders.">Mechanisms of Major Ampullate Silk Fiber Formation by Orb-Web-Spinning Spiders.</a> Transactions of the American Microscopical Society. 96 (2), 170-189 (1977).</li><li>Decker, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+for+the+Destruction+of+Endotoxin+in+Synthetic+Spider+Silk+Proteins.">Method for the Destruction of Endotoxin in Synthetic Spider Silk Proteins.</a> Scientific Reports. 8 (12166), 1-6 (2018).</li></ol>

Depois que as proteínas de seda da aranha de recombinação são purified têm que então ser preparadas em uma solução que possa ser usada para a formação material. Misturando a proteína de seda da aranha liofilizada com água e expondo esta mistura à irradiação da microonda, para gerar o calor e a pressão, é possível preparar uma solução do rSSp. Uma grande variedade de formas materiais pode ser produzida a partir deste método simples e eficiente de solubilização de rSSp. Cada material tem que ser prep...

As sedas de aranha ganhou o interesse de cientistas materiais para sua combinação impressionante de força, elasticidade, e biocompatibility. Recriando fibras tem sido tradicionalmente o impulso da pesquisa. Este esforço foi dificultado pela insolubilidade recombinante da proteína de seda da aranha (rssp) na água assim como a incapacidade de técnicas tradicionais do solvatação (agentes e detergentes de chaotropic) para conseguir o solvatação aquoso. Além disso, as técnicas que foram desenvolvidas para as versões de altamente fácil do rssp não trabalham em todas as variantes do rssp e também requerem manipulação substancial e tempo que muitas vezes resulta em perda de proteína1,2. Isto conduziu pela maior parte no campo que utiliza 1, 1, 1, 3, 3, 3-hexafluoroisopropanol (HFIP) como um solvente de que para formar fibras, e outras formas materiais limitadas. A vantagem é que todos os rSSp conhecidos são solúveis em HFIP, proporcionando uniformidade de dados entre cada grupo de pesquisa. A desvantagem é que HFIP é um solvente tóxico que é caro e impraticável a escala devido a preocupações de saúde e considerações ambientais.
Uma aproximação nova à solvação do rssp foi desenvolvida que ponte a abertura tecnológica entre o solvente orgânico áspero hfip e as outras técnicas que trabalharam seletivamente para o solvatação do rssp. A combinação de aquece e de pressões específicos foi aplicada às suspensões do rssp e da água. Os resultados foram próximos de 100% de solvação e recuperação do rSSp, bem como altas concentrações protéicas; uma variedade de formas de materiais foi determinada para ser possível a partir dessas formulações que não eram todas realizáveis usando hfip ou outros solventes orgânicos3,4,5,6. O objetivo desta abordagem é a solubilizar eficientemente e facilmente proteínas de aranha recombinante purificada e seca em uma solução aquosa que pode então ser utilizada para a produção de uma variedade de formas materiais.
Fibras, filmes, revestimentos, adesivos, hidrogéis, lyogels, microesferas e materiais de esponja são prontamente conseguíveis a partir da mesma solução aquosa de rSSp usando este método. A continuação da evolução deste método, não apenas com o rSSp adicional, mas com outras proteínas, pode levar a novas formas materiais e vias alternativas de purificação e solubilização de proteínas.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:697px;" width="698">
	<tbody>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">3 mL Syringe with Luer-Lok Tip</td>
			<td style="width:148px;">BD</td>
			<td style="width:119px;">309657</td>
			<td style="width:215px;">Other size syringes can be used but to keep the tips on, it is advised to use luer-lok tips</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">4 mL culture vial, clear with rubber lined cap</td>
			<td style="width:148px;">Wheaton</td>
			<td style="width:119px;">225142</td>
			<td style="width:215px;">Minimum dope volume is 1mL, max is 2mL</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">8 mL culture vial, clear with rubber lined cap</td>
			<td style="width:148px;">Wheaton</td>
			<td style="width:119px;">225144</td>
			<td style="width:215px;">Minimum dope volume is 2mL, max is 4mL</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">99% Isopropyl Alcohol, Reagent ACS/USP Grade</td>
			<td style="width:148px;">Pharmco-Aaper</td>
			<td style="width:119px;">231000099</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Freezone 4.5 Plus</td>
			<td style="width:148px;">Labconco</td>
			<td style="width:119px;">7386030</td>
			<td>Freeze Dryer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Luer Adapter Female Luer x 10-32 Female, Tefzel (ETFE)</td>
			<td style="width:148px;">IDEX</td>
			<td style="width:119px;">P-629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:216px;">Microwave</td>
			<td style="width:148px;">Magic Chef</td>
			<td style="width:119px;">HMD1110B</td>
			<td style="width:215px;">120V, 60Hz AC; 1000 watts; 1.1 cu. ft. capacity; with glass turn table</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">One-Piece Fingertight 10-32 Coned, for 1/16&#34; OD</td>
			<td style="width:148px;">IDEX</td>
			<td style="width:119px;">F-120X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">PEEK Tubing 1/16&#34; OD x 0.010&#34; ID</td>
			<td style="width:148px;">IDEX</td>
			<td style="width:119px;">1531B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Sprayer: Master Airbrush</td>
			<td style="width:148px;">Master Airbrush</td>
			<td style="width:119px;">TC-60</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

material formation of recombinant spider silks through aqueous solvation using heat and pressure

Muitas aranhas produzem sete tipos de sedas. Seis das sedas são fibra na forma quando produzidas pelas aranhas. Estas fibras não são solúveis em água. A fim reproduzir as propriedades mecânicas notáveis de sedas da aranha, devem ser produzidas em anfitriões heterólogo porque as aranhas são territoriais e Cannibalistic. Os análogos sintéticos da seda da aranha igualmente tendem a ser insolúveis em soluções aquosas. Assim, uma grande percentagem de investigação em sedas de aranha recombinante dependem de solventes orgânicos que são prejudiciais para a produção em grande escala de materiais. O método do nosso grupo força a solvação dessas sedas de aranha recombinante em água. Notavelmente, quando essas proteínas são preparadas usando este método de calor e pressão, uma ampla gama de formas materiais pode ser preparada a partir da mesma solução de proteínas de seda de aranha recombinante (rSSp), incluindo: filmes, fibras, esponja, hidrogel, lyogel, e adesivos. Este artigo demonstra a produção do rssp solvatados e dos formulários materiais em uma maneira que seja compreendida mais facilmente do que dos materiais e dos métodos escritos sozinho.

A partir do método descrito de solubilização do rSSp, uma variedade de formas materiais pode ser alcançada como observado na Figura 1. O método de solubilização é aplicar calor e pressão, gerados por um microondas convencional, a uma suspensão de rSSp e água. Quando as temperaturas e as pressões críticas são alcançadas, a proteína solubilize. A partir desta solução de rSSp solubilizada, são apresentadas as condições necessárias para sete...

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Material Formation of Recombinant Spider Silks through Aqueous Solvation using Heat and Pressure

Formação de Material de Seda de Aranha Recombinante por Solvatação Aquosa Usando Calor e Pressão

Aqui, apresentamos um protocolo para produzir soluções de proteína de seda de aranha recombinante solúvel em água e as formas materiais que podem ser formadas a partir dessas soluções.

Many spiders produce seven types of silks. Six of the silks are fiber in form when produced by the spiders. These fibers are not water soluble. In order ...

Este método de solubilização de sedas de aranha recombinantes produz formas materiais que não são possíveis usando solventes orgânicos tradicionais. Além disso, o processo é de grãos, resultando em uma solução proteica simples na água. Ao utilizar este método, os materiais formados ou produzidos mantêm as características desejáveis das proteínas de seda de aranha.Esta técnica de solubilização para sedas de aranha recombinantes permite a solubilização de sedas de aranha recombinante em um processo de uma etapa. Isso é desejável porque essas notoriamente difíceis de produzir proteínas não são perdidas através de processamento extensivo. Além disso, como as soluções são apenas proteína na água, outros compostos biologicamente ativos podem ser adicionados se isso for desejável para a aplicação.Particularmente, a relação de função da estrutura proteica, este sistema é memético para como uma aranha faz uma fibra na qual utiliza água e proteínas em alta concentração. Utilizando esse método de solubilização e uma formação material subsequente, deve ser possível obter compreensão sobre os materiais que são formados, e as estruturas que são responsáveis por eles. Acredita-se que pode ser, nós usamos esta técnica para solubilizar peptídeos sintéticos que de outra forma exigiria um ambiente alcalino ou ácido para solvate.Isso pode ser vantajoso em aplicações a jusante para esses peptídeos. Além disso, uma série de proteínas conhecidas quando expressas sinteticamente tendem a acabar na fração insolúvel. Resolutizar e, em seguida, redobrar essas proteínas é muitas vezes um processo trabalhoso que resulta em grandes perdas.Utilizando essa técnica, pode ser possível aumentar a eficiência dos processos de recuperação de proteínas insolúveis. Colocar um frasco selado em um micro-ondas é um pouco assustador, dando o risco de superaquecimento e, portanto, sobre pressurizando o frasco. Entender a abordagem encenada para aplicar calor e pressão é fundamental.Em segundo lugar, para a seda de aranha recombinante em particular, ter sal presente não permitirá que a técnica funcione ou funcione tão efetivamente dependendo de quanto sal está presente. A remoção de sal é a chave. Seja paciente e cuidadoso, monitore de perto seus tempos de micro-ondas e temperaturas dentro do frasco.É fundamental porque há uma série de peças móveis para operação que muitas vezes são difíceis de transmitir através de materiais escritos tradicionais e seções de métodos. Dado que existem muitas proteínas que têm problemas de solubilidade que impedem o estudo adequado, esse método tem potencial para ser aplicado em uma variedade de espaços proteicos para melhorar, ou mesmo permitir técnicas analíticas e caracterização. Para começar, selecione um frasco de cultura de vidro borossivelável autoclaveável de oito mililitros com uma tampa de parafuso forrada de borracha e coloque o frasco vazio em um equilíbrio analítico.Rasgue a massa do frasco vazio para que o equilíbrio leia zero massa. Adicione o pó de proteína de seda de aranha recombinante liofilizada desejado ao frasco vazio para o material específico. Em seguida, adicione a quantidade desejada de água ultra pura, pelo menos dois mililitros, ao frasco.Sele a tampa do frasco e rapidamente vórtice do conteúdo para criar uma mistura dispersa e homogênea de proteína de seda de aranha recombinante. Realize uma verificação final da tampa do frasco para garantir que ela tenha sido firmemente e seguramente apertada. Em seguida, transfira a mistura de proteína de seda de aranha recombinante suspensa para um forno convencional de micro-ondas com a faixa de potência de 700 a 1500 watts.Comece a operar o micro-ondas com cinco rajadas de segunda, que definam a potência total ligando e desligando manualmente. Após cada estouro, abra brevemente a porta e misture cuidadosamente o frasco para evitar a acomodação e mantenha a mistura suspensa. Ocasionalmente, permita que o frasco e a solução esfriem, e evitem que a solução superaquecida toque no selo.Use um termômetro infravermelho para medir a temperatura da solução que contém parte do frasco. Repita o processo de micro-ondas até que a temperatura atinja pelo menos 130 graus Celsius, e todas as partículas sólidas foram completamente dissolvidas. Em seguida, deixe a temperatura da solução e a tampa do frasco esfriar abaixo de 100 graus Celsius.Antes que esta solução seja totalmente resfriada, lance-a do frasco em geometrias específicas para formar um hidrogel. Depois que o hidrogel for formado, coloque-o em um banho de água, e transfira-o para o congelador a menos 20 graus Celsius. Espere até o banho ficar completamente congelado.Complete o processo de formação de esponja removendo o hidrogel congelado e o banho de água do congelador, e descongelando a 25 graus Celsius. Em seguida, remova a esponja resultante da água descongelada. Para preparar um lyogel, transfira uma amostra de hidrogel congelado para um liofilizador.Após 24 horas, remova o material de gel liofilizado final da embarcação. Para produzir filmes de proteína de seda de aranha recombinante, lançou 200 microliters da proteína de seda de aranha recombinante solubilizada quente do frasco em uma forma PDMS da forma desejada. Depois de seco, retire-o do substrato PDMS para testes ou tratamento.Para preparar um revestimento que não pode ser removido do substrato, use um pulverizador de aerógrafo para aplicar a proteína de seda de aranha recombinante solubilizada para realizar um revestimento inicial de spray no substrato de escolha. Depois de seco, submergir o substrato revestido na proteína de seda de aranha recombinante solubilizada para formar um revestimento de mergulho. Repita o revestimento de mergulho para alcançar a espessura desejada.Para formar adesivos, use uma pipeta para adicionar a proteína de seda de aranha recombinante solubilizada em um substrato e, em seguida, aplique um segundo substrato sobre o topo da solução. Fixar firmemente as peças e, em seguida, secar as amostras em um forno com uma temperatura mínima de 25 graus Celsius por pelo menos 16 horas. Para gerar fibras molhadas, use uma agulha de deslizamento de 19 bitolas e carregue a solução de droga solubilizada em uma seringa concêntrica com uma ponta de bloqueio Luer.Ejete bolhas de ar, e deixe a droga sentar-se na extremidade da trava Luer da seringa. Insira pelo menos 25 milímetros de tubo PEEK nos encaixes apertados de uma peça do tubo PEEK para um diâmetro externo de mais de 16 polegadas e 10 sobre 32 pente. Substitua a agulha de calibre 19 por esta configuração no adaptador feminino de bloqueio Luer da seringa.Em seguida, coloque luvas de nitrito na parte externa dos deuses intermediários, para evitar que a fibra seja gerada de deslizamento, e para evitar danificar os motores. Obtenha um banho de vidro claro alto com isopropanol 99% puro para usar como banho de coagulação. Encha o primeiro banho de estiramento com uma proporção de 80 a 20 de isopropanol e água destilada.No segundo banho de estiramento, encha uma proporção de 20 a 80 de isopropanol e água destilada. Configure o sistema de estiramento godet no computador. Para ajustar a velocidade principal da remoção da fibra, ajuste a barra deslizante para a velocidade do trigêmeo A para um valor entre 10 a 14 milímetros por segundo, dependendo de quão bem e rapidamente a fibra está se formando.Inicie um primeiro trecho movendo a barra deslizante da relação de estiramento triplo B para dois Para o deus final no banho de estiramento um, o godet superior médio, e o primeiro godet em banho elástico dois. Inicie o segundo trecho movendo a barra deslizante da razão de estiramento triplo C para dois para o deus final no banho de estiramento dois, o último godet superior, e o winder. Esta configuração garante que o primeiro godet após o banho de coagulação, e o primeiro godet no primeiro banho de estiramento estão girando na mesma velocidade.Em seguida, carregue a solução de seda na seringa de um instrumento de linha de giro personalizado. No sistema automatizado, defina a taxa de extrusão para 10 milímetros por segundo, a fim de extruir a solução de seda no banho de coagulação de vidro preenchido com isopropanol. Deixe a extrusão de fibras ficar uniforme, antes de tirar as fibras do banho com um gancho de metal fino.Verifique se a remoção da fibra do banho cria um laço entre a ponta de tubo PEEK e o caminho da fibra que sai do banho. Guie a fibra recuperada através da série de deuses, de tal forma que a fibra está submersa nos banhos de estiramento, mas secando no ar entre os banhos de estiramento, e antes de ir para um carretel. Neste protocolo através de uma solubilização da proteína de seda de aranha recombinante, uma variedade de formas materiais pode ser alcançada.Sete formulários materiais são apresentados aqui. Hidrogéis, lyogels, esponja, adesivos, revestimentos, filmes e fibras. As fibras requerem o processamento mais extenso, extrudando-se em um banho de coagulação e, em seguida, esticando a fibra bruta em banhos de estiramento pós-lixeira.Dado que as soluções de proteína e água são aquecidas a uma temperatura e pressão relativamente altas, nossa experiência tem sido é que as soluções são estéreis no ponto em que a proteína é solvated. Isso permite que qualquer uma das formas materiais aqui apresentadas sejam levadas à cultura celular, desde que sejam tratadas adequadamente, para estudar a resposta celular aos materiais. Certamente essa técnica levou à descoberta de novas formas materiais, incluindo adesivos e material esponja.Formas materiais que não são necessariamente orientadas para a formação de fibras, embora a formação de fibras seja uma das áreas que também tem visto melhora através do desenvolvimento dessa técnica. Gerar calor e pressão dentro de um frasco selado tem perigo inerente. Use sempre equipamentos de proteção individual na realização desses procedimentos.

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