Name: purification and transplantation of myogenic progenitor cell derived exosomes to improve cardiac function in duchenne muscular dystrophic mice
Uploaded: 2019-04-10T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Purification and Transplantation of Myogenic Progenitor Cell Derived Exosomes to Improve Cardiac Function in Duchenne Muscular Dystrophic Mice at JoVE.com

تانغ كانت تدعمها جزئيا في "جمعية القلب الأمريكية": GRNT31430008، AR070029 المعاهد الوطنية للصحة، والمعاهد الوطنية للصحة-HL086555، HL134354 المعاهد الوطنية للصحة.

تم التعامل مع الحيوانات وفقا للبروتوكولات المعتمدة واللوائح الرفق بالحيوان لرعاية الحيوان المؤسسية واستخدام اللجنة "كلية جورجيا الطبية" في جامعة أوغوستا.
1-عزل وتنقية اكسوسوميس المستمدة من السياسة النقدية
<ol><li>البذور 5 × 106 C2C12 الخلايا في صحن ثقافة خلية 15 سم مع 20 مل دو...

<ol>
	<li>Yiu, E. M., Kornberg, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Duchenne+muscular+dystrophy.">Duchenne muscular dystrophy.</a> Journal of Paediatrics and Child Health. 51 (8), 759-764 (2015).</li><li>Nudel, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Duchenne+muscular+dystrophy+gene+product+is+not+identical+in+muscle+and+brain.">Duchenne muscular dystrophy gene product is not identical in muscle and brain.</a> Nature. 337 (6202), 76-78 (1989).</li><li>Rae, M. G., O'Malley, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cognitive+dysfunction+in+Duchenne+muscular+dystrophy:+a+possible+role+for+neuromodulatory+immune+molecules.">Cognitive dysfunction in Duchenne muscular dystrophy: a possible role for neuromodulatory immune molecules.</a> Journal of Neurophysiology. 116 (3), 1304-1315 (2016).</li><li>Mah, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+systematic+review+and+meta-analysis+on+the+epidemiology+of+Duchenne+and+Becker+muscular+dystrophy.">A systematic review and meta-analysis on the epidemiology of Duchenne and Becker muscular dystrophy.</a> Neuromuscular Disorders. 24 (6), 482-491 (2014).</li><li>D'Amario, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+current+approach+to+heart+failure+in+Duchenne+muscular+dystrophy.">A current approach to heart failure in Duchenne muscular dystrophy.</a> Heart. 103 (22), 1770-1779 (2017).</li><li>Koeks, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+Outcomes+in+Duchenne+Muscular+Dystrophy:+A+Study+of+5345+Patients+from+the+TREAT-NMD+DMD+Global+Database.">Clinical Outcomes in Duchenne Muscular Dystrophy: A Study of 5345 Patients from the TREAT-NMD DMD Global Database.</a> Journal of Neuromuscular Diseases. 4 (4), 293-306 (2017).</li><li>Kamdar, F., Garry, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dystrophin-Deficient+Cardiomyopathy.">Dystrophin-Deficient Cardiomyopathy.</a> Journal of the American College of Cardiology. 67 (21), 2533-2546 (2016).</li><li>Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regenerative+Therapy+for+Cardiomyopathies.">Regenerative Therapy for Cardiomyopathies.</a> Journal of Cardiovascular Translational Research. , (2018).</li><li>Fayssoil, A., Nardi, O., Orlikowski, D., Annane, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiomyopathy+in+Duchenne+muscular+dystrophy:+pathogenesis+and+therapeutics.">Cardiomyopathy in Duchenne muscular dystrophy: pathogenesis and therapeutics.</a> Heart Failure Reviews. 15 (1), 103-107 (2010).</li><li>Hagan, M., Ashraf, M., Kim, I. M., Weintraub, N. L., Tang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effective+regeneration+of+dystrophic+muscle+using+autologous+iPSC-derived+progenitors+with+CRISPR-Cas9+mediated+precise+correction.">Effective regeneration of dystrophic muscle using autologous iPSC-derived progenitors with CRISPR-Cas9 mediated precise correction.</a> Medical Hypotheses. 110, 97-100 (2018).</li><li>Quinlan, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+the+mdx+mouse+cardiomyopathy:+physiological+and+morphological+findings.">Evolution of the mdx mouse cardiomyopathy: physiological and morphological findings.</a> Neuromuscular Disorders. 14 (8-9), 491-496 (2004).</li><li>Siemionow, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Creation+of+Dystrophin+Expressing+Chimeric+Cells+of+Myoblast+Origin+as+a+Novel+Stem+Cell+Based+Therapy+for+Duchenne+Muscular+Dystrophy.">Creation of Dystrophin Expressing Chimeric Cells of Myoblast Origin as a Novel Stem Cell Based Therapy for Duchenne Muscular Dystrophy.</a> Stem Cell Reviews and Reports. 14 (2), 189-199 (2018).</li><li>Sienkiewicz, D., Kulak, W., Okurowska-Zawada, B., Paszko-Patej, G., Kawnik, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Duchenne+muscular+dystrophy:+current+cell+therapies.">Duchenne muscular dystrophy: current cell therapies.</a> Therapeutic Advances in Neurological Disorders. 8 (4), 166-177 (2015).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+engraftment+of+myogenic+progenitors+from+adipose-derived+stem+cells+and+muscle+regeneration+in+dystrophic+mice.">Long-term engraftment of myogenic progenitors from adipose-derived stem cells and muscle regeneration in dystrophic mice.</a> Human Molecular Genetics. 24 (21), 6029-6040 (2015).</li><li>Ju, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+of+Cardiac+Mesenchymal+Stem+Cell-Derived+Exosomes+for+Angiogenesis.">Transplantation of Cardiac Mesenchymal Stem Cell-Derived Exosomes for Angiogenesis.</a> Journal of Cardiovascular Translational Research. 11 (5), 429-437 (2018).</li><li>Ju, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+of+Cardiac+Mesenchymal+Stem+Cell-Derived+Exosomes+Promotes+Repair+in+Ischemic+Myocardium.">Transplantation of Cardiac Mesenchymal Stem Cell-Derived Exosomes Promotes Repair in Ischemic Myocardium.</a> Journal of Cardiovascular Translational Research. 11 (5), 420-428 (2018).</li><li>Ruan, X. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suxiao+Jiuxin+pill+promotes+exosome+secretion+from+mouse+cardiac+mesenchymal+stem+cells+in+vitro.">Suxiao Jiuxin pill promotes exosome secretion from mouse cardiac mesenchymal stem cells in vitro.</a> Acta Pharmacologica Sinica. 39 (4), 569-578 (2018).</li><li>Ruan, X. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+from+Suxiao+Jiuxin+pill-treated+cardiac+mesenchymal+stem+cells+decrease+H3K27+demethylase+UTX+expression+in+mouse+cardiomyocytes+in+vitro.">Exosomes from Suxiao Jiuxin pill-treated cardiac mesenchymal stem cells decrease H3K27 demethylase UTX expression in mouse cardiomyocytes in vitro.</a> Acta Pharmacologica Sinica. 39 (4), 579-586 (2018).</li><li>Chen, Y., Tang, Y., Fan, G. C., Duan, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles+as+novel+biomarkers+and+pharmaceutic+targets+of+diseases.">Extracellular vesicles as novel biomarkers and pharmaceutic targets of diseases.</a> Acta Pharmacologica Sinica. 39 (4), 499-500 (2018).</li><li>Chen, Y., Tang, Y., Long, W., Zhang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+Cell-Released+Microvesicles+and+Exosomes+as+Novel+Biomarkers+and+Treatments+of+Diseases.">Stem Cell-Released Microvesicles and Exosomes as Novel Biomarkers and Treatments of Diseases.</a> Stem Cells International. 2016, 2417268 (2016).</li><li>Murphy, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+role+of+extracellular+vesicles+in+musculoskeletal+diseases.">Emerging role of extracellular vesicles in musculoskeletal diseases.</a> Molecular Aspects of Medicine. 60, 123-128 (2018).</li><li>Su, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosome-Derived+Dystrophin+from+Allograft+Myogenic+Progenitors+Improves+Cardiac+Function+in+Duchenne+Muscular+Dystrophic+Mice.">Exosome-Derived Dystrophin from Allograft Myogenic Progenitors Improves Cardiac Function in Duchenne Muscular Dystrophic Mice.</a> Journal of Cardiovascular Translational Research. , (2018).</li><li>Hu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosome-mediated+shuttling+of+microRNA-29+regulates+HIV+Tat+and+morphine-mediated+neuronal+dysfunction.">Exosome-mediated shuttling of microRNA-29 regulates HIV Tat and morphine-mediated neuronal dysfunction.</a> Cell Death &amp; Disease. 3, 381 (2012).</li><li>Bayoumi, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+carvedilol-responsive+microRNA,+miR-125b-5p+protects+the+heart+from+acute+myocardial+infarction+by+repressing+pro-apoptotic+bak1+and+klf13+in+cardiomyocytes.">A carvedilol-responsive microRNA, miR-125b-5p protects the heart from acute myocardial infarction by repressing pro-apoptotic bak1 and klf13 in cardiomyocytes.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 114, 72-82 (2018).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes/microvesicles+from+induced+pluripotent+stem+cells+deliver+cardioprotective+miRNAs+and+prevent+cardiomyocyte+apoptosis+in+the+ischemic+myocardium.">Exosomes/microvesicles from induced pluripotent stem cells deliver cardioprotective miRNAs and prevent cardiomyocyte apoptosis in the ischemic myocardium.</a> International Journal of Cardiology. 192, 61-69 (2015).</li><li>Cheruvanky, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+isolation+of+urinary+exosomal+biomarkers+using+a+nanomembrane+ultrafiltration+concentrator.">Rapid isolation of urinary exosomal biomarkers using a nanomembrane ultrafiltration concentrator.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. 292 (5), 1657-1661 (2007).</li><li>Oksvold, M. P., Neurauter, A., Pedersen, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetic+bead-based+isolation+of+exosomes.">Magnetic bead-based isolation of exosomes.</a> Methods in Molecular Biology. 1218, 465-481 (2015).</li><li>Pedersen, K. W., Kierulf, B., Neurauter, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+and+Generic+Isolation+of+Extracellular+Vesicles+with+Magnetic+Beads.">Specific and Generic Isolation of Extracellular Vesicles with Magnetic Beads.</a> Methods in Molecular Biology. 1660, 65-87 (2017).</li><li>Teng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+Stem+Cell-Derived+Exosomes+Improve+the+Microenvironment+of+Infarcted+Myocardium+Contributing+to+Angiogenesis+and+Anti-Inflammation.">Mesenchymal Stem Cell-Derived Exosomes Improve the Microenvironment of Infarcted Myocardium Contributing to Angiogenesis and Anti-Inflammation.</a> Cellular Physiology and Biochemistry. 37 (6), 2415-2424 (2015).</li><li>Aminzadeh, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosome-Mediated+Benefits+of+Cell+Therapy+in+Mouse+and+Human+Models+of+Duchenne+Muscular+Dystrophy.">Exosome-Mediated Benefits of Cell Therapy in Mouse and Human Models of Duchenne Muscular Dystrophy.</a> Stem Cell Reports. 10 (3), 942-955 (2018).</li></ol>

الطريقة لعزل اكسوسوميس النقي ضروري لدراسة وظيفة اكسوسوميس. أحد الأساليب الشائعة لعزل اكسوسومي من البولي إيثيلين الجليكول (أوتاد) بوساطة الأمطار17،،من1825. اكسوسوميس يمكن أن تكون عجلت في أوتاد، والقريبون من الطرد المركزي ذات سرعة منخفضة. ت?...

دوشين ضمور العضلات (DMD) العاشر مرتبطة المتنحية، تقدمية العضلية مرض تسببه طفرة في جين DMD وفقدان ديستروفين الفنية1. ديستروفين تتجلى أساسا في العضلات الهيكلية وعضلة القلب، ويتم التعبير عن أقل في العضلات الملساء والغدد الصماء والخلايا العصبية2،3. DMD هو النوع الأكثر شيوعاً من ضمور العضلات مع معدل واحد لكل 3,500 إلى 5,000 الأولاد حديثي الولادة في جميع أنحاء العالم4،5. عادة وضع الأفراد نخر العضلات التدريجي، فقدان المشي المستقلة خلال مرحلة المراهقة المبكرة، والموت في العقود الثانية إلى الثالثة من حياتهم بسبب فشل القلب، وفشل في الجهاز التنفسي6.
المتوسعة اعتلال عضلة القلب وعدم انتظام ضربات القلب الاحتقاني مظاهر القلبية الوعائية شائعة DMD7،8. لا يمكن الشفاء من المرض، والعلاج الداعم قد تحسين الأعراض أو تأخير تطور قصور القلب، ولكن من الصعب جداً لتحسين وظيفة القلب9،10.
مماثلة للمرضى DMD، ضمور العضلات المرتبطة بالعاشر الفئران (MDX) تعاني من نقص في البروتين ديستروفين، وهذا أعراض اعتلال عضلة القلب11، وثم تستخدم على نطاق واسع في البحوث اعتلال عضلة القلب DMD المرتبطة. من أجل استعادة ديستروفين في العضلات المتأثرة، أثبت العلاج بالخلايا الجذعية متمكنة يمكن علاج فعال لإعلان الدوحة الوزاري12،،من1314. اكسوسوميس، شمال البحر الأبيض المتوسط 30-150 غشاء الحويصلات يفرز من مختلف أنواع الخلايا، تلعب دوراً أساسيا في الاتصالات خلية إلى خلية عن طريق نقل المواد الجينية، مثل الحمض النووي الريبي الرسول (مرناً) والترميز غير الكشف15،16،17 ،،من1819،،من2021.
وأظهرت دراساتنا السابقة أن اكسوسوميس المستمدة من الخلايا السلف شذوذ (MPC)، مثل خط الخلية C2C12، يمكن نقل ديستروفين مرناً للمضيف cardiomyocytes بعد22من الحقن المباشر للقلب، مشيراً إلى أن تسليم متمكنة يمكن استعادة اكسوسوميس المستمدة من السياسة النقدية (MPC-أكسو) عابر DMD الجينات في الفئران MDX. تركز هذه المقالة على تقنيات تنقية وزرع MPC-أكسو.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1064px;" width="1064">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:424px;">0.22-&#956;m Filter</td>
			<td style="width:280px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:185px;">09-720-004</td>
			<td style="width:175px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">15-cm Cell Culture Dish</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>157150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">24-gauge catheter</td>
			<td style="width:280px;">TERUMO</td>
			<td>SR-OX2419CA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">31-gauge insulin needle</td>
			<td style="width:280px;">BD</td>
			<td>328291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">4% paraformaldehyde&#160;</td>
			<td style="width:280px;">Affymetrix</td>
			<td>AAJ19943K2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">50 mL Centrifuge Tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>339652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">6-0 suture</td>
			<td style="width:280px;">Pro Advantage by NDC</td>
			<td>P420697</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG</td>
			<td style="width:280px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-11008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Antibiotic Antimycotic Solution</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>30-004-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-Dystrophin antibody</td>
			<td style="width:280px;">Abcam</td>
			<td>ab15277</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Antigen retriever&#160;</td>
			<td style="width:280px;">Aptum Biologics</td>
			<td>R2100-US</td>
			<td>Antigen recovery</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Autofluorescence Quenching Kit&#160;</td>
			<td style="width:280px;">Vector Laboratories</td>
			<td>SP-8400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">C2C12 cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1772</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Centrifuge</td>
			<td>Unico</td>
			<td>C8606</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Change-A-Tip High Temp Cauteries</td>
			<td>Bovie Medical Corporation</td>
			<td>HIT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Confocal microscopy</td>
			<td style="width:280px;">Zeiss</td>
			<td>Zeiss 780 Upright Confocal</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DBA/2J-mdx mice</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>013141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>10-013-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>35-011-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Goat serum&#160;</td>
			<td style="width:280px;">MP Biomedicals, LLC</td>
			<td>191356</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Isoflurane</td>
			<td style="width:280px;">Patterson Veterinary</td>
			<td>07-893-1389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ketamine</td>
			<td style="width:280px;">Henry Schein</td>
			<td>056344</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mounting Medium with DAPI&#160;</td>
			<td style="width:280px;">Vector Laboratories</td>
			<td>H-1500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mouse Retractor Set</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td>SURGI-5001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether</td>
			<td style="width:280px;">Fisher Scientific</td>
			<td>BP151-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rodent ventilator</td>
			<td style="width:280px;">Harvard Apparatus</td>
			<td>55-7066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SW-28 Ti rotor</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>342207</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">The Vevo 2100 Imaging Platform</td>
			<td style="width:280px;">FUJIFILM VisualSonics</td>
			<td>Vevo 2100</td>
			<td>Ultrasound System&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>365672</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ultra-Clear Tubes</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>344058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Xylazine (XylaMed)</td>
			<td style="width:280px;">Bimeda-MTC Animal Health Inc.</td>
			<td>1XYL003 8XYL006</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

purification and transplantation of myogenic progenitor cell derived exosomes to improve cardiac function in duchenne muscular dystrophic mice

دوشين ضمور العضلات (DMD) العاشر مرتبطة المتنحية وراثية مرض الناجم عن نقص البروتين ديستروفين الوظيفية. لا يمكن الشفاء من المرض، وكلما تقدم المرض، يطور المريض أعراض المتوسعة اعتلال عضلة القلب وعدم انتظام ضربات القلب، وفشل القلب الاحتقاني. الفئران DMDMDX متحولة لا تعبر عن ديستروفين، وتستخدم عادة كنموذج الفأر من إعلان الدوحة الوزاري. وفي دراستنا الأخيرة، لاحظنا أن حقن إينتراميوكارديال من نوع واسعة (WT)-عابر استعادة السلف شذوذ المستمدة من الخلايا اكسوسوميس (MPC-أكسو) التعبير عن ديستروفين في عضلة القلب الفئران DMDMDX المسخ، الذي ارتبط مع تحسن عابر في وظيفة القلب، مما يوحي بأن وزن-MPC-أكسو قد توفر خيار للتخفيف من أعراض أمراض القلب من إعلان الدوحة الوزاري. توضح هذه المقالة التقنية لتنقية MPC-أكسو وزرعها في قلوب الفئران متحولة DMDMDX .

ويبين الشكل 1ألفمخططا لعزل وتنقية اكسوسوميس من الخلايا C2C12. للتأكد من وجود اكسوسوميس، أجرينا تحليل المجهر الإلكتروني الإرسال. تظهر الصورة الميكروسكوب الإلكتروني انتقال (الشكل 1ب) مورفولوجية الحويصلات الشكل مشرق وجولة من اكسوسوميس C2C12 ال?...

Watch this Scientific Journal Video about Purification and Transplantation of Myogenic Progenitor Cell Derived Exosomes to Improve Cardiac Function in Duchenne Muscular Dystrophic Mice at JoVE.com

Purification and Transplantation of Myogenic Progenitor Cell Derived Exosomes to Improve Cardiac Function in Duchenne Muscular Dystrophic Mice

نقدم هنا، وضع بروتوكول لتحسين وظيفة القلب في فئران ضمور العضلات دوشين عابر بزرع اكسوسوميس المستمدة من الخلايا السلف شذوذ عادي.

تنقية وزرع الخلايا السلف شذوذ المستمدة اكسوسوميس لتحسين وظيفة القلب في فئران تندب العضلي دوشين

Duchene Muscular Dystrophy (DMD) is an X-linked recessive genetic disease caused by a lack of functional dystrophin protein. The disease cannot be cured, ...

يقدم هذا البروتوكول طريقة لتحسين وظيفة القلب في فئران ضمور العضلات في دوشين عن طريق زرع إكسون المستمدة من الخلايا السابقة لليوجينيك العادية. يمكن أن يحسن زرع الإزوم وظائف القلب في فئران DMD بالاشتراك مع زيادة التعبير عن ضمور في قلوب المتلقي. تساهم الطريقة المناسبة لعزل الطاردات وتنقيتها وزرعها داخل القلب في نجاح عملية زرع الطاردة من أجل تحسين وظيفة القلب للفئران التي تحتوي على ضمور العضلات في دوشين.قد العلاج exosome المستمدة من لجنة السياسة النقدية تحسين وظيفة العضلات والهيكل العظمي عن طريق الإكسوسوم بوساطة طبيعية دستروفين نقل مرنا. يوضح هذا الفيديو التقنيات الهامة لتنقية السوسات، وتسليم الزوم داخل القلب، وتصوير صدى القلب بعد الزرع. عرض تخطيط صدى القلب سيتم من قبل يان شين، فني من مختبرنا.لبدء هذا الإجراء، بذور خمسة ملايين الخلايا C2C12 في طبق ثقافة 15 سم مع 20 ملليلتر من DMEM كاملة تحتوي على 10٪ FBS والمضادات الحيوية. احتضان في 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون. بعد ذلك، استخدم دوار دلو متأرجح إلى FBS فائق التركيز عند 100، 000 مرة G وعند أربع درجات مئوية لمدة 18 ساعة لإعداد متوسطة مستنفدة من الكوسوم.تجاهل بيليه وجمع ناظر. عندما تصل الخلايا أحادية الطبقة إلى 80٪ التقاء في طبق الثقافة، استبدال DMEM كاملة مع المتوسطة المنضب exosome. استخدام ماصة نقل لجمع افرا من طبق ثقافة الخلية كل 48 ساعة.أجهزة الطرد المركزي الأنابيب في 150 مرة G لمدة عشر دقائق لإزالة الخلايا المتبقية. تصفية فائقة من خلال مرشح 0.22 ميكرومتر للقضاء على أي حطام الخلية ونقل المتوسطة المصفاة إلى أنابيب فائقة الوضوح. بعد ذلك، استخدم دوار دلو سوينغ إلى الrifuge أنابيب في 100، 00 مرات G و 4 درجة مئوية لمدة 120 دقيقة لتسريع exosomes.Resuspend الكريه التي تحتوي على exosome في برنامج تلفزيوني ومن ثم ملء أنبوب كامل فائقة واضحة مع برنامج تلفزيوني. فائقة التركيز يريفوج هذا التعليق في 100، 00 مرات G و 4 درجات مئوية لمدة 120 دقيقة للقضاء على البروتينات الملوثة. تجاهل السوبر و resuspend بيليه exosome في 100 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني.تخزين في ناقص 80 درجة مئوية للاستخدام في المستقبل. أولاً، قم بإصلاح كل فأر مُجرّد تخدير في موضع الوَيُبِي على منصة جراحية عن طريق تأمين كل طرف بشريط. ضع خياطة 3-0 أفقيًا أسفل الأسنان العلوية للاحتفاظ بالفك العلوي في مكانه.بعد ذلك، ضعي كريم إزالة الشعر على الجانب الأيسر من صدر الفأر لإزالة التنوب من الجلد. باستخدام قسطرة قياس 24، أداء الاحتضان البطاية عن طريق تجويف الفم. واستخدام جهاز التنفس الصناعي القوارض لتهوية الماوس مع هواء الغرفة بمعدل 195 نفسا في الدقيقة الواحدة.تطهير الجلد مع 70٪ الكحول و 10٪ povidone اليود. ثم جعل شق من 10 إلى 15 ملليمتر مائل من الحافة القبطية اليسرى إلى الإبط الأيسر. استخدام مقص لقطع الزهيري الرئيسي والصغرى الصدرية.وجعل thoracotamy اليسار من خلال الفضاء بين الكوستال الرابع. أدخل برفق شرائط الداحبة لنشر التجويف الصدري إلى عرض 10 ملليمترات مع الحرص على عدم تلف الرئة اليسرى. بعد ذلك، استخدمي ملاقطتين مستقيمتين لإزالة المُعايَر.سحبها بعيدا ووضعها وراء نصائح الداهم لفضح القلب. استخدام إبرة الأنسولين قياس 31 لحقن إما MPC-Exo أو PBS intramyocardially في الجدار الأمامي للبطين الأيسر في موقع واحد. ثم، استخدام خياطة النايلون 6-0 لإغلاق تجويف الصدر، والعضلات الصدرية، والجلد، في تسلسل.بعد يومين من زرع إكسوسومات PBS ، تخدير الفئران كما هو موضح في بروتوكول النص. استخدم الشريط لإصلاح الماوس في موضع الوبين وتطبيق الجل الصوتي المُحمّى مسبقًا على منطقة الصدر الأيسر. بعد ذلك، استخدم تخطيط صدى القلب لتقييم وظيفة البطين الأيسر.الحصول على عرض محور طويل parasternal من البطين الأيسر في بعدين ثم تدوير مسبار الموجات فوق الصوتية 90 درجة للحصول على عرض المحور القصير البطين الأيسر على مستوى العضلات الحليمية. بعد ذلك، قم بتسجيل الصور الصدى في وضع M وقياس القطر الأيسر للنهاية البطينية الانبساطية، وحجم نهاية البطين البطيني الأيسر، وحجم الانبساطي البطيني الأيسر، وحجم البطينين البطيني الانقباضي الأيسر. يجب التحكم في معدل ضربات القلب للفئران على الأقل 400 bpm لوظيفة قياس القلب.بعد عزل ونقاء السوسسومات من الخلايا C2C12، يتم تأكيد وجودها باستخدام التحليل المجهري للإلكترون انتقال. تُظهر صورة المجهر الإلكتروني المُنقلة مورفولوجيا الحويصلات الساطعة المستديرة على شكل شكل إكسوزومات مشتقة من C2C12. تحليل البقعة الغربية يؤكد وجود علامات إكسوسومات بما في ذلك CD63 و Tsg101.لوحظت منطقة ذمة شفافة بعد الحقن داخل القلب في الجدار الأمامي للبطين الأيسر من الفئران mdx مما يشير إلى أن الحقن في عضلة القلب ناجح. يتم تنفيذ تلوين مناعي للديستروفين لتحديد ما إذا كان تسليم MPC-Exo القلب يعيد التعبير بروتين ديستروفين في قلوب mdx. لوحظ استعادة جزئية للتعبير ديستروفين مع توطين الغشاء في بعض من cardiomyocytes.تقاس وظيفة القلب عن طريق تخطيط صدى القلب بعد يومين من الولادة داخل القلب لتحديد ما إذا كان نقل MPC-Exo يحسن وظيفة القلب في الفئران MDX. وينظر إلى العلاج MPC-Exo لتحسين حركة الجدار الداخلي مقارنة مع برنامج تلفزيوني، مما يشير إلى أن MPC-Exo زرع تحسين وظيفة القلب في الفئران MDX. استخدام إبرة الأنسولين قياس 31 مع طرف في حوالي 20 درجة أمر بالغ الأهمية لنجاح تسليم معظم الإكسوسومات في عضلة القلب ويزيد من التعرض للاكسوسوس حقن لاستضافة عضلة القلب.بعد الإجراء, يمكن الكشف عن تعبير ديستروفين بعد حقن اكسوسوسوم المستمدة من MPC عن طريق تلطيخ مناعي مما يدل على أن القلب MPC المستمدة من الاكوسوزومات تسليم يعيد التعبير ديستروفين البروتين. هذه التقنية سوف تمهد الطريق لعلاج اعتلال عضلة القلب مع المواد الوراثية العلاجية الحاملة للزوام بما في ذلك الحمض النووي، مرنا، لنكرنا، أو microRNAs.

Research

JoVE Journal

Genetics

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

تربية ومزدوجة الذين تقطعت بهم السبل بوساطة الحمض النووي الريبي الجينات ضربة قاضية في إخفاء بيتل،<em&gt; Dermestes المبقعة</em

Advances in genomics have raised the possibility of probing biodiversity at an unprecedented scale. However, sequence alone will not be informative ...

Single-cell Gene Expression Profiling Using FACS and qPCR with Internal Standards

وحيدة الخلية التعبير الجيني التنميط عن طريق نظام مراقبة الأصول الميدانية وQPCR مع المعايير الداخلية

Gene expression measurements from bulk populations of cells can obscure the considerable transcriptomic variation of individual cells within those ...

Primordial Germ Cell Transplantation for CRISPR/Cas9-based Leapfrogging in Xenopus

Primordial Germ Cell Transplantation for CRISPR/Cas9-based Leapfrogging in Xenopus

زرع الخلايا البدائية كريسبر/Cas9-تعتمد قفزات واسعة في النمو

The creation of mutant lines by genome editing is accelerating genetic analysis in many organisms. CRISPR/Cas9 methods have been adapted for use in the ...

Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation

Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation

Microinjection الأجنة وتقنية زرع "التلاعب الجينوم" فيتريبينيس ناسونيا

The jewel wasp Nasonia vitripennis has emerged as an effective model system for the study of processes including sex determination, haplo-diploid sex ...

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9

تعطيل الجينات ذات كفاءة عالية من الخلايا السلف مورين والبشرية المكونة للدم قبل كريسبر/Cas9

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. ...

Bronchoalveolar Lavage Exosomes in Lipopolysaccharide-induced Septic Lung Injury

اكسوسوميس الغسل للفيسيولوجيا في الإصابات الناجمة عن Lipopolysaccharide الرئة التفسخ

Acute lung injury (ALI) and acute respiratory distress syndrome (ARDS) represent a heterogeneous group of lung diseases which continues to have a high ...

A Combinatorial Single-cell Approach to Characterize the Molecular and Immunophenotypic Heterogeneity of Human Stem and Progenitor Populations

اتباع نهج خلية واحدة اندماجي لتوصيف الجزيئية والتغاير إيمونوفينوتيبيك الجذعية البشرية والسكان السلف

Immunophenotypic characterization and molecular analysis have long been used to delineate heterogeneity and define distinct cell populations. FACS is ...

Dissection of Enhancer Function Using Multiplex CRISPR-based Enhancer Interference in Cell Lines

تشريح للدالة محسن باستخدام محسن متعدد المستندة إلى كريسبر التدخل في خطوط الخلايا

Multiple enhancers often regulate a given gene, yet for most genes, it remains unclear which enhancers are necessary for gene expression, and how these ...

Isolation, Characterization and MicroRNA-based Genetic Modification of Human Dental Follicle Stem Cells

عزل وتوصيف والمستندة إلى MicroRNA التحوير الوراثي للخلايا الجذعية البشرية جريب طب الأسنان

To date, several stem cell types at different developmental stages are in the focus for the treatment of degenerative diseases. Yet, certain aspects, such ...

Preparation and Gene Modification of Nonhuman Primate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells

إعداد وتعديل الجينات الرئيسيات نونومان الجذعية المكونة للدم والخلايا السلف

Hematopoietic stem and progenitor cell (HSPC) transplantation has been a cornerstone therapy for leukemia and other cancers for nearly half a century, ...