Name: purification and transplantation of myogenic progenitor cell derived exosomes to improve cardiac function in duchenne muscular dystrophic mice
Uploaded: 2019-04-10T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Purification and Transplantation of Myogenic Progenitor Cell Derived Exosomes to Improve Cardiac Function in Duchenne Muscular Dystrophic Mice at JoVE.com

Tang ont été partiellement pris en charge par l’American Heart Association : NIH-AR070029, NIH-HL086555, GRNT31430008, NIH-HL134354.

Les animaux ont été traités conformément aux protocoles approuvés et règlements de bien-être des animaux du comité d’utilisation de la Medical College of Georgia, à Augusta université et animalier institutionnel.
1. isolement et Purification des Exosomes dérivé de MPC
<ol><li>Cellules6 C2C12 semences 5 x 10 dans une boîte de Petri de cellule de 15 cm avec de Dulbecco complet 20 mL aigle modifié (DMEM) contenant 10 % sérum fœtal (SVF), 100 U/mL de pénicilline G e...

<ol>
	<li>Yiu, E. M., Kornberg, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Duchenne+muscular+dystrophy.">Duchenne muscular dystrophy.</a> Journal of Paediatrics and Child Health. 51 (8), 759-764 (2015).</li><li>Nudel, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Duchenne+muscular+dystrophy+gene+product+is+not+identical+in+muscle+and+brain.">Duchenne muscular dystrophy gene product is not identical in muscle and brain.</a> Nature. 337 (6202), 76-78 (1989).</li><li>Rae, M. G., O'Malley, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cognitive+dysfunction+in+Duchenne+muscular+dystrophy:+a+possible+role+for+neuromodulatory+immune+molecules.">Cognitive dysfunction in Duchenne muscular dystrophy: a possible role for neuromodulatory immune molecules.</a> Journal of Neurophysiology. 116 (3), 1304-1315 (2016).</li><li>Mah, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+systematic+review+and+meta-analysis+on+the+epidemiology+of+Duchenne+and+Becker+muscular+dystrophy.">A systematic review and meta-analysis on the epidemiology of Duchenne and Becker muscular dystrophy.</a> Neuromuscular Disorders. 24 (6), 482-491 (2014).</li><li>D'Amario, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+current+approach+to+heart+failure+in+Duchenne+muscular+dystrophy.">A current approach to heart failure in Duchenne muscular dystrophy.</a> Heart. 103 (22), 1770-1779 (2017).</li><li>Koeks, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+Outcomes+in+Duchenne+Muscular+Dystrophy:+A+Study+of+5345+Patients+from+the+TREAT-NMD+DMD+Global+Database.">Clinical Outcomes in Duchenne Muscular Dystrophy: A Study of 5345 Patients from the TREAT-NMD DMD Global Database.</a> Journal of Neuromuscular Diseases. 4 (4), 293-306 (2017).</li><li>Kamdar, F., Garry, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dystrophin-Deficient+Cardiomyopathy.">Dystrophin-Deficient Cardiomyopathy.</a> Journal of the American College of Cardiology. 67 (21), 2533-2546 (2016).</li><li>Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regenerative+Therapy+for+Cardiomyopathies.">Regenerative Therapy for Cardiomyopathies.</a> Journal of Cardiovascular Translational Research. , (2018).</li><li>Fayssoil, A., Nardi, O., Orlikowski, D., Annane, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiomyopathy+in+Duchenne+muscular+dystrophy:+pathogenesis+and+therapeutics.">Cardiomyopathy in Duchenne muscular dystrophy: pathogenesis and therapeutics.</a> Heart Failure Reviews. 15 (1), 103-107 (2010).</li><li>Hagan, M., Ashraf, M., Kim, I. M., Weintraub, N. L., Tang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effective+regeneration+of+dystrophic+muscle+using+autologous+iPSC-derived+progenitors+with+CRISPR-Cas9+mediated+precise+correction.">Effective regeneration of dystrophic muscle using autologous iPSC-derived progenitors with CRISPR-Cas9 mediated precise correction.</a> Medical Hypotheses. 110, 97-100 (2018).</li><li>Quinlan, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+the+mdx+mouse+cardiomyopathy:+physiological+and+morphological+findings.">Evolution of the mdx mouse cardiomyopathy: physiological and morphological findings.</a> Neuromuscular Disorders. 14 (8-9), 491-496 (2004).</li><li>Siemionow, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Creation+of+Dystrophin+Expressing+Chimeric+Cells+of+Myoblast+Origin+as+a+Novel+Stem+Cell+Based+Therapy+for+Duchenne+Muscular+Dystrophy.">Creation of Dystrophin Expressing Chimeric Cells of Myoblast Origin as a Novel Stem Cell Based Therapy for Duchenne Muscular Dystrophy.</a> Stem Cell Reviews and Reports. 14 (2), 189-199 (2018).</li><li>Sienkiewicz, D., Kulak, W., Okurowska-Zawada, B., Paszko-Patej, G., Kawnik, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Duchenne+muscular+dystrophy:+current+cell+therapies.">Duchenne muscular dystrophy: current cell therapies.</a> Therapeutic Advances in Neurological Disorders. 8 (4), 166-177 (2015).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+engraftment+of+myogenic+progenitors+from+adipose-derived+stem+cells+and+muscle+regeneration+in+dystrophic+mice.">Long-term engraftment of myogenic progenitors from adipose-derived stem cells and muscle regeneration in dystrophic mice.</a> Human Molecular Genetics. 24 (21), 6029-6040 (2015).</li><li>Ju, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+of+Cardiac+Mesenchymal+Stem+Cell-Derived+Exosomes+for+Angiogenesis.">Transplantation of Cardiac Mesenchymal Stem Cell-Derived Exosomes for Angiogenesis.</a> Journal of Cardiovascular Translational Research. 11 (5), 429-437 (2018).</li><li>Ju, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+of+Cardiac+Mesenchymal+Stem+Cell-Derived+Exosomes+Promotes+Repair+in+Ischemic+Myocardium.">Transplantation of Cardiac Mesenchymal Stem Cell-Derived Exosomes Promotes Repair in Ischemic Myocardium.</a> Journal of Cardiovascular Translational Research. 11 (5), 420-428 (2018).</li><li>Ruan, X. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suxiao+Jiuxin+pill+promotes+exosome+secretion+from+mouse+cardiac+mesenchymal+stem+cells+in+vitro.">Suxiao Jiuxin pill promotes exosome secretion from mouse cardiac mesenchymal stem cells in vitro.</a> Acta Pharmacologica Sinica. 39 (4), 569-578 (2018).</li><li>Ruan, X. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+from+Suxiao+Jiuxin+pill-treated+cardiac+mesenchymal+stem+cells+decrease+H3K27+demethylase+UTX+expression+in+mouse+cardiomyocytes+in+vitro.">Exosomes from Suxiao Jiuxin pill-treated cardiac mesenchymal stem cells decrease H3K27 demethylase UTX expression in mouse cardiomyocytes in vitro.</a> Acta Pharmacologica Sinica. 39 (4), 579-586 (2018).</li><li>Chen, Y., Tang, Y., Fan, G. C., Duan, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles+as+novel+biomarkers+and+pharmaceutic+targets+of+diseases.">Extracellular vesicles as novel biomarkers and pharmaceutic targets of diseases.</a> Acta Pharmacologica Sinica. 39 (4), 499-500 (2018).</li><li>Chen, Y., Tang, Y., Long, W., Zhang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+Cell-Released+Microvesicles+and+Exosomes+as+Novel+Biomarkers+and+Treatments+of+Diseases.">Stem Cell-Released Microvesicles and Exosomes as Novel Biomarkers and Treatments of Diseases.</a> Stem Cells International. 2016, 2417268 (2016).</li><li>Murphy, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+role+of+extracellular+vesicles+in+musculoskeletal+diseases.">Emerging role of extracellular vesicles in musculoskeletal diseases.</a> Molecular Aspects of Medicine. 60, 123-128 (2018).</li><li>Su, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosome-Derived+Dystrophin+from+Allograft+Myogenic+Progenitors+Improves+Cardiac+Function+in+Duchenne+Muscular+Dystrophic+Mice.">Exosome-Derived Dystrophin from Allograft Myogenic Progenitors Improves Cardiac Function in Duchenne Muscular Dystrophic Mice.</a> Journal of Cardiovascular Translational Research. , (2018).</li><li>Hu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosome-mediated+shuttling+of+microRNA-29+regulates+HIV+Tat+and+morphine-mediated+neuronal+dysfunction.">Exosome-mediated shuttling of microRNA-29 regulates HIV Tat and morphine-mediated neuronal dysfunction.</a> Cell Death &amp; Disease. 3, 381 (2012).</li><li>Bayoumi, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+carvedilol-responsive+microRNA,+miR-125b-5p+protects+the+heart+from+acute+myocardial+infarction+by+repressing+pro-apoptotic+bak1+and+klf13+in+cardiomyocytes.">A carvedilol-responsive microRNA, miR-125b-5p protects the heart from acute myocardial infarction by repressing pro-apoptotic bak1 and klf13 in cardiomyocytes.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 114, 72-82 (2018).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes/microvesicles+from+induced+pluripotent+stem+cells+deliver+cardioprotective+miRNAs+and+prevent+cardiomyocyte+apoptosis+in+the+ischemic+myocardium.">Exosomes/microvesicles from induced pluripotent stem cells deliver cardioprotective miRNAs and prevent cardiomyocyte apoptosis in the ischemic myocardium.</a> International Journal of Cardiology. 192, 61-69 (2015).</li><li>Cheruvanky, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+isolation+of+urinary+exosomal+biomarkers+using+a+nanomembrane+ultrafiltration+concentrator.">Rapid isolation of urinary exosomal biomarkers using a nanomembrane ultrafiltration concentrator.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. 292 (5), 1657-1661 (2007).</li><li>Oksvold, M. P., Neurauter, A., Pedersen, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetic+bead-based+isolation+of+exosomes.">Magnetic bead-based isolation of exosomes.</a> Methods in Molecular Biology. 1218, 465-481 (2015).</li><li>Pedersen, K. W., Kierulf, B., Neurauter, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+and+Generic+Isolation+of+Extracellular+Vesicles+with+Magnetic+Beads.">Specific and Generic Isolation of Extracellular Vesicles with Magnetic Beads.</a> Methods in Molecular Biology. 1660, 65-87 (2017).</li><li>Teng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+Stem+Cell-Derived+Exosomes+Improve+the+Microenvironment+of+Infarcted+Myocardium+Contributing+to+Angiogenesis+and+Anti-Inflammation.">Mesenchymal Stem Cell-Derived Exosomes Improve the Microenvironment of Infarcted Myocardium Contributing to Angiogenesis and Anti-Inflammation.</a> Cellular Physiology and Biochemistry. 37 (6), 2415-2424 (2015).</li><li>Aminzadeh, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosome-Mediated+Benefits+of+Cell+Therapy+in+Mouse+and+Human+Models+of+Duchenne+Muscular+Dystrophy.">Exosome-Mediated Benefits of Cell Therapy in Mouse and Human Models of Duchenne Muscular Dystrophy.</a> Stem Cell Reports. 10 (3), 942-955 (2018).</li></ol>

La méthode consistant à isoler les exosomes pure est essentielle pour l’étude de la fonction des exosomes. Une des techniques communes pour l’isolement de l’exosome est polyéthylène glycols (PEG) médiée par précipitation17,18,25. Exosomes peut être précipité dans les chevilles et granulés par centrifugation à basse vitesse. PEG-mediated purification est très pratique et peu coûteux, il n’a pas besoin des ?...

Dystrophie musculaire de Duchenne (DMD) est une lié à le X récessive, progressive maladie neuromusculaire due à une mutation dans le gène DMD et la perte de la dystrophine fonctionnelle1. La dystrophine est exprimée principalement dans le myocarde et le muscle squelettique et est moins exprimée dans le muscle lisse, les glandes endocrines et les neurones2,3. DMD est le type le plus commun de la dystrophie musculaire avec une fréquence d’un par 3 500 à 5 000 garçons nouveau-nés dans le monde entier4,5. Individus développent généralement une nécrose musculaire progressive, perte de la marche indépendante de début de l’adolescence et la mort dans les décennies de deuxième et troisième de leur vie en raison de l’insuffisance cardiaque et insuffisance respiratoire6.
Cardiomyopathie dilatée, arythmies et insuffisance cardiaque congestive sont des manifestations cardiovasculaires courantes de DMD7,8. La maladie ne peut pas être guérie, un traitement de soutien peut améliorer les symptômes ou retarder la progression de l’insuffisance cardiaque, mais il est très difficile d’améliorer le cœur fonction9,10.
Similaires aux patients DMD, la dystrophie musculaire liée à le X (MDX) souris sont déficientes en protéine dystrophine et les symptômes présents de cardiomyopathie11et sont donc largement utilisés dans la recherche de cardiomyopathie DMD associé. Afin de rétablir la dystrophine dans les muscles affectés, la thérapie de cellules souches allogéniques s’est avéré pour être un traitement efficace pour la DMD12,13,14. Exosomes, vésicules de membrane de 30-150 nm sécrétées par divers types de cellules, jouent un rôle clé dans la communication de cellule-cellule par l’intermédiaire de transport de matériel génétique, telles que l’ARN messager (ARNm) et non-codantes RNAs15,16,17 ,18,19,20,21.
Nos études antérieures ont montré qu’exosomes dérivé de progéniteurs myogéniques (MPC), tels que la lignée C2C12, peut transférer la dystrophine ARNm d’hôte cardiomyocytes après injection cardiaque directe22, indiquant que la livraison allogénique de Les exosomes dérivé de MPC (MPC-Exo) peut restaurer transitoirement l’expression des gènes chez les souris MDX DMD. Cet article se concentre sur les techniques de purification et de la transplantation MPC-Exo.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1064px;" width="1064">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:424px;">0.22-&#956;m Filter</td>
			<td style="width:280px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:185px;">09-720-004</td>
			<td style="width:175px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">15-cm Cell Culture Dish</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>157150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">24-gauge catheter</td>
			<td style="width:280px;">TERUMO</td>
			<td>SR-OX2419CA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">31-gauge insulin needle</td>
			<td style="width:280px;">BD</td>
			<td>328291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">4% paraformaldehyde&#160;</td>
			<td style="width:280px;">Affymetrix</td>
			<td>AAJ19943K2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">50 mL Centrifuge Tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>339652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">6-0 suture</td>
			<td style="width:280px;">Pro Advantage by NDC</td>
			<td>P420697</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG</td>
			<td style="width:280px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-11008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Antibiotic Antimycotic Solution</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>30-004-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-Dystrophin antibody</td>
			<td style="width:280px;">Abcam</td>
			<td>ab15277</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Antigen retriever&#160;</td>
			<td style="width:280px;">Aptum Biologics</td>
			<td>R2100-US</td>
			<td>Antigen recovery</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Autofluorescence Quenching Kit&#160;</td>
			<td style="width:280px;">Vector Laboratories</td>
			<td>SP-8400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">C2C12 cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1772</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Centrifuge</td>
			<td>Unico</td>
			<td>C8606</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Change-A-Tip High Temp Cauteries</td>
			<td>Bovie Medical Corporation</td>
			<td>HIT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Confocal microscopy</td>
			<td style="width:280px;">Zeiss</td>
			<td>Zeiss 780 Upright Confocal</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DBA/2J-mdx mice</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>013141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>10-013-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>35-011-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Goat serum&#160;</td>
			<td style="width:280px;">MP Biomedicals, LLC</td>
			<td>191356</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Isoflurane</td>
			<td style="width:280px;">Patterson Veterinary</td>
			<td>07-893-1389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ketamine</td>
			<td style="width:280px;">Henry Schein</td>
			<td>056344</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mounting Medium with DAPI&#160;</td>
			<td style="width:280px;">Vector Laboratories</td>
			<td>H-1500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mouse Retractor Set</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td>SURGI-5001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether</td>
			<td style="width:280px;">Fisher Scientific</td>
			<td>BP151-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rodent ventilator</td>
			<td style="width:280px;">Harvard Apparatus</td>
			<td>55-7066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SW-28 Ti rotor</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>342207</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">The Vevo 2100 Imaging Platform</td>
			<td style="width:280px;">FUJIFILM VisualSonics</td>
			<td>Vevo 2100</td>
			<td>Ultrasound System&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>365672</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ultra-Clear Tubes</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>344058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Xylazine (XylaMed)</td>
			<td style="width:280px;">Bimeda-MTC Animal Health Inc.</td>
			<td>1XYL003 8XYL006</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

purification and transplantation of myogenic progenitor cell derived exosomes to improve cardiac function in duchenne muscular dystrophic mice

Duchene de Duchenne (DMD) est une maladie génétique récessive liée à le X causée par un manque de protéine dystrophine fonctionnelle. La maladie ne peut pas être guérie, et que la maladie progresse, le patient développe des symptômes d’insuffisance cardiaque congestive, arythmie et une cardiomyopathie dilatée. Les souris mutantes DMDMDX n’expriment pas la dystrophine et sont couramment utilisés comme un modèle murin de DMD. Dans notre étude récente, nous avons observé que l’injection intramyocardique de type large (WT)-exosomes de dérivés de cellules progéniteurs myogéniques (MPC-Exo) restauré transitoirement l’expression de la dystrophine dans le myocarde de souris mutantes DMDMDX , qui a été associé avec une amélioration transitoire en suggérant que la fonction cardiaque WT-MPC-Exo peut fournir une option pour soulager les symptômes cardiaques de DMD. Cet article décrit la technique de purification MPC-Exo et la transplantation dans les cœurs des souris mutantes DMDMDX .

Un ordinogramme pour isoler et purifier les exosomes des cellules C2C12 est montré dans la Figure 1A. Pour confirmer la présence des exosomes, nous avons effectué analyse de microscopie électronique à transmission. Image de microscopie électronique à transmission (Figure 1B) montre la morphologie des vésicules forme rond et lumineux des exosomes C2C12 dérivé. Analyse par Western blot ont confirmé la présence de marqu...

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Purification and Transplantation of Myogenic Progenitor Cell Derived Exosomes to Improve Cardiac Function in Duchenne Muscular Dystrophic Mice

Nous présentons ici un protocole pour améliorer transitoirement la fonction cardiaque chez les souris de dystrophie musculaire de Duchenne en transplantant des exosomes dérivée de cellules progénitrices myogéniques normal.

Purification et la Transplantation de cellules progéniteurs myogéniques dérivé Exosomes afin d’améliorer la fonction cardiaque chez les souris dystrophiques musculaires de Duchenne

Duchene Muscular Dystrophy (DMD) is an X-linked recessive genetic disease caused by a lack of functional dystrophin protein. The disease cannot be cured, ...

Ce protocole présente la méthode pour améliorer de façon transitionnaire la fonction cardiaque chez les souris dystrophie musculaire de Duchenne en transplantant l’exon dérivé des cellules progénitrices myogéniques normales. La transplantation exosomale peut améliorer la fonction cardiaque chez les souris DMD en association avec l’expression accrue de la dystrophie dans les coeurs destinataires. La méthode appropriée pour l’isolement d’exon, la purification, et la transplantation intramyocardique contribuent au succès de la transplantation d’exon pour améliorer la fonction cardiaque pour des souris avec Duchenne' dystrophie musculaire de s.La thérapie exosome MPC-dérivée pourrait améliorer la fonction squelettique de muscle par le transfert normal exosome-médié de dystrophine d’ARNm. Cette vidéo démontre les techniques critiques pour la purification exosome, la livraison exosome intramyocardique, et l’échocardiographie post-transplantation. La démonstration de l’échocardiographie sera faite par Yan Shen, technicien de notre laboratoire.Pour commencer cette procédure, les semences cinq millions de cellules C2C12 dans un plat de culture de 15 centimètres avec 20 millilitres de DMEM complet contenant 10%FBS et antibiotiques. Incuber à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone. Ensuite, utilisez un rotor balançant seau à l’ultracentrifugeuse FBS à 100 000 fois G et à quatre degrés Celsius pendant 18 heures pour préparer un milieu appauvri en exosome.Jeter la pastille et recueillir le supernatant. Lorsque les cellules monocouches atteignent 80% de confluence dans le plat de culture, remplacez le DMEM complet par un milieu exosome-épuisé. Utilisez une pipette de transfert pour recueillir le supernatant dans le plat de culture cellulaire toutes les 48 heures.Centrifuger les tubes à 150 fois G pendant dix minutes pour enlever les cellules restantes. Filtrez le supernatant à travers un filtre de 0,22 micromètre pour éliminer les débris cellulaires et transférer les tubes filtrés moyens à ultra-clairs. Ensuite, utilisez un rotor de seau pivotant pour ultracentrifuger les tubes à 100 00 fois G et à 4 degrés Celsius pendant 120 minutes pour précipiter les exosomes.Resuspendez la pastille contenant de l’exosome dans PBS, puis remplissez l’ensemble du tube ultra-clair avec PBS. Ultracentrifugeuse cette suspension à 100,00 fois G et à 4 degrés Celsius pendant 120 minutes pour éliminer les protéines contaminantes. Jetez le supernatant et resuspendez la pastille exosome dans 100 microlitres de PBS.Conserver à moins 80 degrés Celsius pour une utilisation future. Tout d’abord, fixer chaque souris anesthésiée dans la position supine sur une plate-forme chirurgicale en sécurisant chaque membre avec du ruban adhésif. Placez une suture 3-0 horizontalement sous les dents supérieures pour maintenir la mâchoire supérieure en place.Ensuite, appliquez de la crème depilatory sur le côté gauche de la poitrine de la souris pour enlever le sapin de la peau. À l’aide d’un cathéter de calibre 24, effectuez une intubation endotracheal par la cavité buccale. Et utilisez un ventilateur de rongeurs pour ventiler la souris avec de l’air de pièce à une vitesse de 195 respirations par minute.Désinfecter la peau avec 70% d’alcool et 10% d’iode povidone. Ensuite, faire une incision oblique de 10 à 15 millimètres du bord sternal gauche à l’aisselle gauche. Utilisez des ciseaux pour couper le pectoralis majeur et pectoralis mineur.Et faire une thoracotamy gauche à travers le quatrième espace intercoastal. Insérez doucement des bandes rétractables pour étendre la cavité thoracique à une largeur de 10 millimètres en prenant soin de ne pas endommager le poumon gauche. Après cela, utilisez deux pinces droites pour enlever le péricarde.Séparez-les et placez-les derrière les pointes de rétracteur pour exposer le cœur. Utilisez une aiguille d’insuline de calibre 31 pour injecter mpc-exo ou PBS intramyocardially dans la paroi antérieure du ventricule gauche à un endroit. Ensuite, utilisez des sutures en nylon 6-0 pour fermer la cavité thoracique, les muscles pectoralis, et la peau, dans l’ordre.Deux jours après la transplantation exosome PBS, anesthésier les souris comme décrit dans le protocole de texte. Utilisez du ruban adhésif pour fixer une souris en position supine et appliquez du gel acoustique préchauffé sur la poitrine gauche. Ensuite, utilisez l’échocardiographie pour évaluer la fonction ventriculaire gauche.Obtenez la vue parasternale à long axe du ventricule gauche en deux dimensions, puis faites pivoter la sonde à ultrasons à 90 degrés pour obtenir une vue de l’axe court ventricule gauche au niveau du muscle papillaire. Après cela, enregistrez des images échocardiographiques de M-mode et mesurez le diamètre ventriculaire gauche end-diastolique, le volume ventriculaire gauche d’extrémité-systolique, le volume ventriculaire gauche d’extrémité-diastolique, et le volume ventriculaire gauche d’extrémité-systolique. La fréquence cardiaque des souris doit être contrôlée au moins 400 bpm pour la fonction de mesure cardiaque.Après que les exosomes soient isolés et purifiés des cellules C2C12, leur présence est confirmée utilisant l’analyse électronique de microscopie de transmission. L’image de microscopie électronique de transmission montre la morphologie des vésicules lumineuses et rondes des exosomes dérivés de C2C12. L’analyse des taches occidentales confirme la présence de marqueurs exosomes, y compris le CD63 et le Tsg101.Une zone translucide d’oedème est observée après l’injection intramyocardique dans la paroi antérieure du ventricule gauche des souris de mdx qui indique que l’injection dans le myocarde est réussie. La coloration immunofluorescente pour la dystrophine est alors exécutée pour déterminer si l’accouchement cardiaque de MPC-Exo restaure l’expression dystrophine-protéine dans les coeurs de mdx. La restauration partielle de l’expression de dystrophine est observée avec la localisation de membrane dans certains cardiomyocytes.La fonction cardiaque est mesurée par échocardiographie deux jours après la livraison intramyocardique pour déterminer si la transplation de MPC-Exo améliore la fonction cardiaque chez les souris mdx. Le traitement de MPC-Exo est vu pour améliorer le mouvement intérieur de mur comparé à PBS, suggérant que la transplantation de MPC-Exo a amélioré la fonction cardiaque chez les souris de mdx. L’utilisation d’une aiguille d’insuline de calibre 31 avec la pointe à environ 20 degrés est essentielle pour le succès pour la livraison de la plupart des exosomes dans le myocarde et maximise l’exposition des exosomes injectés pour accueillir des cardiomyocytes.Après la procédure, l’expression de dystrophine peut être détectée après injection exosome MPC-dérivée par la coloration immunofluorescente indiquant que la livraison exosome MPC-dérivée cardiaque restaure l’expression dystrophine-protéine. Cette technique ouvrira la voie à un traitement par cardiomyopathie avec du matériel génétique thérapeutique porteur d’exosomes, y compris l’ADN, l’ARNm, lncRNA ou les microARN.

Research

JoVE Journal

Genetics

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L&#39;élevage et d&#39;ARN double brin médiée Gene Knockdown dans le Hide Beetle,<em&gt; Dermestes maculatus</em

Advances in genomics have raised the possibility of probing biodiversity at an unprecedented scale. However, sequence alone will not be informative ...

Recherche

Génétique

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Unicellulaire profil d&#39;expression génique utilisant FACS et qPCR avec les normes internes

Gene expression measurements from bulk populations of cells can obscure the considerable transcriptomic variation of individual cells within those ...

Primordial Germ Cell Transplantation for CRISPR/Cas9-based Leapfrogging in Xenopus

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