Name: purification and transplantation of myogenic progenitor cell derived exosomes to improve cardiac function in duchenne muscular dystrophic mice
Uploaded: 2019-04-10T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Purification and Transplantation of Myogenic Progenitor Cell Derived Exosomes to Improve Cardiac Function in Duchenne Muscular Dystrophic Mice at JoVE.com

Tang waren teilweise unterstützt von der American Heart Association: NIH-AR070029, NIH-HL086555, GRNT31430008, NIH-HL134354.

Tiere wurden entsprechend zugelassene Protokolle und Tierschutzvorschriften der institutionellen Animal Care and Use Committee des Medical College of Georgia Augusta Universität behandelt.
1. Isolierung und Reinigung der MPC-abgeleitete Exosomen
<ol><li>Samen 5 x 106 C2C12 Zellen in der Kulturschale 15 cm Zelle mit 20 mL komplette Dulbecco geändert Adlers Medium (DMEM) mit 10 % fetalen bovine Serum (FBS), 100 U/mL Penicillin G und 100 μg/mL Streptomycin. Inkubation bei 37 ° C ...

<ol>
	<li>Yiu, E. M., Kornberg, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Duchenne+muscular+dystrophy.">Duchenne muscular dystrophy.</a> Journal of Paediatrics and Child Health. 51 (8), 759-764 (2015).</li><li>Nudel, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Duchenne+muscular+dystrophy+gene+product+is+not+identical+in+muscle+and+brain.">Duchenne muscular dystrophy gene product is not identical in muscle and brain.</a> Nature. 337 (6202), 76-78 (1989).</li><li>Rae, M. G., O'Malley, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cognitive+dysfunction+in+Duchenne+muscular+dystrophy:+a+possible+role+for+neuromodulatory+immune+molecules.">Cognitive dysfunction in Duchenne muscular dystrophy: a possible role for neuromodulatory immune molecules.</a> Journal of Neurophysiology. 116 (3), 1304-1315 (2016).</li><li>Mah, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+systematic+review+and+meta-analysis+on+the+epidemiology+of+Duchenne+and+Becker+muscular+dystrophy.">A systematic review and meta-analysis on the epidemiology of Duchenne and Becker muscular dystrophy.</a> Neuromuscular Disorders. 24 (6), 482-491 (2014).</li><li>D'Amario, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+current+approach+to+heart+failure+in+Duchenne+muscular+dystrophy.">A current approach to heart failure in Duchenne muscular dystrophy.</a> Heart. 103 (22), 1770-1779 (2017).</li><li>Koeks, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+Outcomes+in+Duchenne+Muscular+Dystrophy:+A+Study+of+5345+Patients+from+the+TREAT-NMD+DMD+Global+Database.">Clinical Outcomes in Duchenne Muscular Dystrophy: A Study of 5345 Patients from the TREAT-NMD DMD Global Database.</a> Journal of Neuromuscular Diseases. 4 (4), 293-306 (2017).</li><li>Kamdar, F., Garry, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dystrophin-Deficient+Cardiomyopathy.">Dystrophin-Deficient Cardiomyopathy.</a> Journal of the American College of Cardiology. 67 (21), 2533-2546 (2016).</li><li>Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regenerative+Therapy+for+Cardiomyopathies.">Regenerative Therapy for Cardiomyopathies.</a> Journal of Cardiovascular Translational Research. , (2018).</li><li>Fayssoil, A., Nardi, O., Orlikowski, D., Annane, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiomyopathy+in+Duchenne+muscular+dystrophy:+pathogenesis+and+therapeutics.">Cardiomyopathy in Duchenne muscular dystrophy: pathogenesis and therapeutics.</a> Heart Failure Reviews. 15 (1), 103-107 (2010).</li><li>Hagan, M., Ashraf, M., Kim, I. M., Weintraub, N. L., Tang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effective+regeneration+of+dystrophic+muscle+using+autologous+iPSC-derived+progenitors+with+CRISPR-Cas9+mediated+precise+correction.">Effective regeneration of dystrophic muscle using autologous iPSC-derived progenitors with CRISPR-Cas9 mediated precise correction.</a> Medical Hypotheses. 110, 97-100 (2018).</li><li>Quinlan, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+the+mdx+mouse+cardiomyopathy:+physiological+and+morphological+findings.">Evolution of the mdx mouse cardiomyopathy: physiological and morphological findings.</a> Neuromuscular Disorders. 14 (8-9), 491-496 (2004).</li><li>Siemionow, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Creation+of+Dystrophin+Expressing+Chimeric+Cells+of+Myoblast+Origin+as+a+Novel+Stem+Cell+Based+Therapy+for+Duchenne+Muscular+Dystrophy.">Creation of Dystrophin Expressing Chimeric Cells of Myoblast Origin as a Novel Stem Cell Based Therapy for Duchenne Muscular Dystrophy.</a> Stem Cell Reviews and Reports. 14 (2), 189-199 (2018).</li><li>Sienkiewicz, D., Kulak, W., Okurowska-Zawada, B., Paszko-Patej, G., Kawnik, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Duchenne+muscular+dystrophy:+current+cell+therapies.">Duchenne muscular dystrophy: current cell therapies.</a> Therapeutic Advances in Neurological Disorders. 8 (4), 166-177 (2015).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+engraftment+of+myogenic+progenitors+from+adipose-derived+stem+cells+and+muscle+regeneration+in+dystrophic+mice.">Long-term engraftment of myogenic progenitors from adipose-derived stem cells and muscle regeneration in dystrophic mice.</a> Human Molecular Genetics. 24 (21), 6029-6040 (2015).</li><li>Ju, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+of+Cardiac+Mesenchymal+Stem+Cell-Derived+Exosomes+for+Angiogenesis.">Transplantation of Cardiac Mesenchymal Stem Cell-Derived Exosomes for Angiogenesis.</a> Journal of Cardiovascular Translational Research. 11 (5), 429-437 (2018).</li><li>Ju, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+of+Cardiac+Mesenchymal+Stem+Cell-Derived+Exosomes+Promotes+Repair+in+Ischemic+Myocardium.">Transplantation of Cardiac Mesenchymal Stem Cell-Derived Exosomes Promotes Repair in Ischemic Myocardium.</a> Journal of Cardiovascular Translational Research. 11 (5), 420-428 (2018).</li><li>Ruan, X. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suxiao+Jiuxin+pill+promotes+exosome+secretion+from+mouse+cardiac+mesenchymal+stem+cells+in+vitro.">Suxiao Jiuxin pill promotes exosome secretion from mouse cardiac mesenchymal stem cells in vitro.</a> Acta Pharmacologica Sinica. 39 (4), 569-578 (2018).</li><li>Ruan, X. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+from+Suxiao+Jiuxin+pill-treated+cardiac+mesenchymal+stem+cells+decrease+H3K27+demethylase+UTX+expression+in+mouse+cardiomyocytes+in+vitro.">Exosomes from Suxiao Jiuxin pill-treated cardiac mesenchymal stem cells decrease H3K27 demethylase UTX expression in mouse cardiomyocytes in vitro.</a> Acta Pharmacologica Sinica. 39 (4), 579-586 (2018).</li><li>Chen, Y., Tang, Y., Fan, G. C., Duan, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles+as+novel+biomarkers+and+pharmaceutic+targets+of+diseases.">Extracellular vesicles as novel biomarkers and pharmaceutic targets of diseases.</a> Acta Pharmacologica Sinica. 39 (4), 499-500 (2018).</li><li>Chen, Y., Tang, Y., Long, W., Zhang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+Cell-Released+Microvesicles+and+Exosomes+as+Novel+Biomarkers+and+Treatments+of+Diseases.">Stem Cell-Released Microvesicles and Exosomes as Novel Biomarkers and Treatments of Diseases.</a> Stem Cells International. 2016, 2417268 (2016).</li><li>Murphy, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+role+of+extracellular+vesicles+in+musculoskeletal+diseases.">Emerging role of extracellular vesicles in musculoskeletal diseases.</a> Molecular Aspects of Medicine. 60, 123-128 (2018).</li><li>Su, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosome-Derived+Dystrophin+from+Allograft+Myogenic+Progenitors+Improves+Cardiac+Function+in+Duchenne+Muscular+Dystrophic+Mice.">Exosome-Derived Dystrophin from Allograft Myogenic Progenitors Improves Cardiac Function in Duchenne Muscular Dystrophic Mice.</a> Journal of Cardiovascular Translational Research. , (2018).</li><li>Hu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosome-mediated+shuttling+of+microRNA-29+regulates+HIV+Tat+and+morphine-mediated+neuronal+dysfunction.">Exosome-mediated shuttling of microRNA-29 regulates HIV Tat and morphine-mediated neuronal dysfunction.</a> Cell Death &amp; Disease. 3, 381 (2012).</li><li>Bayoumi, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+carvedilol-responsive+microRNA,+miR-125b-5p+protects+the+heart+from+acute+myocardial+infarction+by+repressing+pro-apoptotic+bak1+and+klf13+in+cardiomyocytes.">A carvedilol-responsive microRNA, miR-125b-5p protects the heart from acute myocardial infarction by repressing pro-apoptotic bak1 and klf13 in cardiomyocytes.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 114, 72-82 (2018).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes/microvesicles+from+induced+pluripotent+stem+cells+deliver+cardioprotective+miRNAs+and+prevent+cardiomyocyte+apoptosis+in+the+ischemic+myocardium.">Exosomes/microvesicles from induced pluripotent stem cells deliver cardioprotective miRNAs and prevent cardiomyocyte apoptosis in the ischemic myocardium.</a> International Journal of Cardiology. 192, 61-69 (2015).</li><li>Cheruvanky, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+isolation+of+urinary+exosomal+biomarkers+using+a+nanomembrane+ultrafiltration+concentrator.">Rapid isolation of urinary exosomal biomarkers using a nanomembrane ultrafiltration concentrator.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. 292 (5), 1657-1661 (2007).</li><li>Oksvold, M. P., Neurauter, A., Pedersen, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetic+bead-based+isolation+of+exosomes.">Magnetic bead-based isolation of exosomes.</a> Methods in Molecular Biology. 1218, 465-481 (2015).</li><li>Pedersen, K. W., Kierulf, B., Neurauter, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+and+Generic+Isolation+of+Extracellular+Vesicles+with+Magnetic+Beads.">Specific and Generic Isolation of Extracellular Vesicles with Magnetic Beads.</a> Methods in Molecular Biology. 1660, 65-87 (2017).</li><li>Teng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+Stem+Cell-Derived+Exosomes+Improve+the+Microenvironment+of+Infarcted+Myocardium+Contributing+to+Angiogenesis+and+Anti-Inflammation.">Mesenchymal Stem Cell-Derived Exosomes Improve the Microenvironment of Infarcted Myocardium Contributing to Angiogenesis and Anti-Inflammation.</a> Cellular Physiology and Biochemistry. 37 (6), 2415-2424 (2015).</li><li>Aminzadeh, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosome-Mediated+Benefits+of+Cell+Therapy+in+Mouse+and+Human+Models+of+Duchenne+Muscular+Dystrophy.">Exosome-Mediated Benefits of Cell Therapy in Mouse and Human Models of Duchenne Muscular Dystrophy.</a> Stem Cell Reports. 10 (3), 942-955 (2018).</li></ol>

Die Methode der reinen Exosomen zu isolieren ist essentiell für die Funktion der Exosomen zu studieren. Eines der gemeinsamen Techniken für die Exosom Isolierung ist Polyethylen Glykole (PEGs) vermittelte Niederschlag17,18,25. Exosomen können Stifte ausgefällt, und pelleted durch langsame Zentrifugation. PEG-vermittelten Reinigung ist sehr bequem, Low Cost, es braucht keiner vorgerückte Ausrüstung, aber gibt es Bedenken ü...

Duchenne-Muskeldystrophie (DMD) ist eine X-chromosomal rezessiv, progressive neuromuskuläre Erkrankungen verursacht durch eine Mutation in DMD gen und den Verlust der funktionellen Dystrophin-1. Dystrophin drückt sich vor allem im Skelettmuskel und Myokard und weniger drückt sich in endokrinen Drüsen, glatte Muskulatur und Neuronen2,3. DMD ist die häufigste Form der Muskeldystrophie mit einer Inzidenz von 1 pro 3.500 bis 5.000 Neugeborenen jungen weltweit4,5. Menschen entwickeln in der Regel progressive Muskelentspannung Nekrose, Verlust des unabhängigen Gehens von frühen Jugend und Tod in der zweiten bis dritten Jahrzehnte ihres Lebens durch Herzversagen und Atemstillstand6.
Dilatative Kardiomyopathie, Herzrhythmusstörungen und Herzinsuffizienz sind gemeinsame kardiovaskuläre Manifestationen von DMD7,8. Die Krankheit kann nicht geheilt werden, unterstützende Behandlung kann Symptome verbessern oder das Fortschreiten der Herzinsuffizienz zu verzögern, aber es ist sehr schwierig, die Herz-Funktion9,10zu verbessern.
Ähnlich wie bei DMD-Patienten, X-chromosomale Muskeldystrophie (MDX) Mäuse haben einen Mangel an Dystrophin-Protein und vorliegenden Symptome einer Kardiomyopathie11und werden daher häufig in DMD verbundenen Kardiomyopathie Forschung eingesetzt. Um das Dystrophin in den betroffenen Muskeln wiederherzustellen, erweist allogene Stammzell-Therapie sich eine wirksame Behandlung für DMD12,13,14. Exosomen, 30-150 nm Membranvesikel abgesondert von verschiedenen Zelltypen, spielen eine wichtige Rolle in der Zell-Zell-Kommunikation durch genetische Materialtransport wie Boten-RNA (mRNA) und nicht-kodierende RNAs15,16,17 ,18,19,20,21.
Unsere frühere Studien haben gezeigt, dass Exosomen abgeleitet myogen Vorläuferzellen (MPC), wie z. B. C2C12 Zelllinie Dystrophin übertragen können mRNA zu Host Kardiomyozyten nach kardialen Direkteinspritzung22, darauf hinweist, dass die allogene Lieferung von MPC-abgeleitete Exosomen (MPC-Exo) können vorübergehend DMD Genexpression in MDX-Mäuse wiederherstellen. Dieser Artikel konzentriert sich auf MPC-Exo-Reinigung und Transplantation-Techniken.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1064px;" width="1064">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:424px;">0.22-&#956;m Filter</td>
			<td style="width:280px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:185px;">09-720-004</td>
			<td style="width:175px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">15-cm Cell Culture Dish</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>157150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">24-gauge catheter</td>
			<td style="width:280px;">TERUMO</td>
			<td>SR-OX2419CA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">31-gauge insulin needle</td>
			<td style="width:280px;">BD</td>
			<td>328291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">4% paraformaldehyde&#160;</td>
			<td style="width:280px;">Affymetrix</td>
			<td>AAJ19943K2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">50 mL Centrifuge Tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>339652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">6-0 suture</td>
			<td style="width:280px;">Pro Advantage by NDC</td>
			<td>P420697</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG</td>
			<td style="width:280px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-11008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Antibiotic Antimycotic Solution</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>30-004-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-Dystrophin antibody</td>
			<td style="width:280px;">Abcam</td>
			<td>ab15277</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Antigen retriever&#160;</td>
			<td style="width:280px;">Aptum Biologics</td>
			<td>R2100-US</td>
			<td>Antigen recovery</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Autofluorescence Quenching Kit&#160;</td>
			<td style="width:280px;">Vector Laboratories</td>
			<td>SP-8400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">C2C12 cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1772</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Centrifuge</td>
			<td>Unico</td>
			<td>C8606</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Change-A-Tip High Temp Cauteries</td>
			<td>Bovie Medical Corporation</td>
			<td>HIT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Confocal microscopy</td>
			<td style="width:280px;">Zeiss</td>
			<td>Zeiss 780 Upright Confocal</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DBA/2J-mdx mice</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>013141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>10-013-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>35-011-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Goat serum&#160;</td>
			<td style="width:280px;">MP Biomedicals, LLC</td>
			<td>191356</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Isoflurane</td>
			<td style="width:280px;">Patterson Veterinary</td>
			<td>07-893-1389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ketamine</td>
			<td style="width:280px;">Henry Schein</td>
			<td>056344</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mounting Medium with DAPI&#160;</td>
			<td style="width:280px;">Vector Laboratories</td>
			<td>H-1500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mouse Retractor Set</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td>SURGI-5001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether</td>
			<td style="width:280px;">Fisher Scientific</td>
			<td>BP151-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rodent ventilator</td>
			<td style="width:280px;">Harvard Apparatus</td>
			<td>55-7066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SW-28 Ti rotor</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>342207</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">The Vevo 2100 Imaging Platform</td>
			<td style="width:280px;">FUJIFILM VisualSonics</td>
			<td>Vevo 2100</td>
			<td>Ultrasound System&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>365672</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ultra-Clear Tubes</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>344058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Xylazine (XylaMed)</td>
			<td style="width:280px;">Bimeda-MTC Animal Health Inc.</td>
			<td>1XYL003 8XYL006</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

purification and transplantation of myogenic progenitor cell derived exosomes to improve cardiac function in duchenne muscular dystrophic mice

Duchene Muskeldystrophie (DMD) ist eine X-chromosomal rezessive genetische Krankheit verursacht durch einen Mangel an funktionalen Dystrophin-Protein. Die Krankheit kann nicht geheilt werden, und wenn die Krankheit fortschreitet, entwickelt der Patient Symptome einer dilatative Kardiomyopathie, Herzrhythmusstörungen und Herzinsuffizienz. Die DMDMDX mutierte Mäuse Dystrophin nicht ausdrücklich und werden häufig als ein Maus-Modell der DMD verwendet. In unserer aktuellen Studie beobachteten wir, dass Intramyocardial Injektion von breite Ausführung (WT)-myogen Progenitor Zellen abgeleitet Exosomen (MPC-Exo) vorübergehend restauriert die Expression von Dystrophin im Myokard von DMDMDX mutierten Mäusen, die verbunden WT-MPC-Exo kann eine vorübergehende Verbesserung der Herzfunktion, die darauf hindeutet, dass eine Option, um die kardiale Symptome von DMD zur Verfügung. Dieser Artikel beschreibt die Technik der MPC-Exo-Reinigung und Transplantation in Herzen von DMDMDX mutierten Mäusen.

Ein Flussdiagramm zur Isolierung und Reinigung von Exosomen aus C2C12 Zellen ist in Abbildung 1Adargestellt. Um das Vorhandensein von Exosomen zu bestätigen, haben wir Transmission Electron Microscopy Analyse durchgeführt. Transmission Electron Microscopy Bild (Abbildung 1B) zeigt die Morphologie der Vesikel hell und Runde Form von Exosomen C2C12 abgeleitet. Western-Blot Analyse bestätigte die Anwesenheit von Exosom Markierun...

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Purification and Transplantation of Myogenic Progenitor Cell Derived Exosomes to Improve Cardiac Function in Duchenne Muscular Dystrophic Mice

Hier präsentieren wir ein Protokoll, um vorübergehend verbessern Herzfunktion bei Duchenne-Muskeldystrophie Mäusen durch die Transplantation von Exosomen von normalen myogen Vorläuferzellen abgeleitet.

Reinigung und Transplantation von myogen Progenitor Cell abgeleitet Exosomen zur Verbesserung der Herzfunktion bei Duchenne muskulöse dystrophischen Mäusen

Duchene Muscular Dystrophy (DMD) is an X-linked recessive genetic disease caused by a lack of functional dystrophin protein. The disease cannot be cured, ...

Dieses Protokoll stellt die Methode zur vorübergehenden Verbesserung der Herzfunktion in Duchennes Muskeldystrophie-Mäusen dar, indem Exon aus normalen myogenen Vorläuferzellen transplantiert wird. Die exosomale Transplantation kann die Herzfunktion bei DMD-Mäusen in Verbindung mit einer erhöhten Expression von Dystrophie in Empfängerherzen verbessern. Geeignete Methode zur Exonisolation, Reinigung und intramyokardialen Transplantation trägt zum Erfolg der Exontransplantation bei, um die Herzfunktion von Mäusen mit Duchennes Muskeldystrophie zu verbessern.Die Von MPC abgeleitete Exosomentherapie könnte die Skelettmuskelfunktion durch exosomenvermittelten normalen Dystrophin mRNA-Transfer verbessern. Dieses Video zeigt die kritischen Techniken für die Exosomenreinigung, die intramyokardiale Exosomenabgabe und die Echokardiographie nach der Transplantation. Die Demonstration der Echokardiographie wird von Yan Shen, Techniker aus unserem Labor, durchgeführt.Um dieses Verfahren zu beginnen, säen Sie fünf Millionen C2C12-Zellen in eine 15-Zentimeter-Kulturschale mit 20 Millilitern vollständiger DMEM mit 10%FBS und Antibiotika. Inkubieren Bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid. Als nächstes verwenden Sie einen schwingenden Schaufelrotor, um FBS bei 100, 000 mal G und bei vier Grad Celsius für 18 Stunden zu ultrazentrieren, um exosome-depleted Medium vorzubereiten.Entsorgen Sie das Pellet und sammeln Sie den Überstand. Wenn die Monolayer-Zellen 80% Konfluss in der Kulturschale erreichen, ersetzen Sie das komplette DMEM durch exosomen-erschöpftes Medium. Verwenden Sie eine Transferpipette, um den Überstand alle 48 Stunden aus der Zellkulturschale zu sammeln.Zentrifugieren Sie die Rohre bei 150 mal G für zehn Minuten, um die verbleibenden Zellen zu entfernen. Filtern Sie den Überstand durch einen 0,22-Mikrometer-Filter, um Zellablagerungen zu beseitigen und das gefilterte Medium auf ultraklare Rohre zu übertragen. Als nächstes verwenden Sie einen Schwenkschaufelrotor, um die Rohre bei 100, 00 mal G und bei 4 Grad Celsius für 120 Minuten zu ultrazentrieren, um die Exosomen auszufällen.Setzen Sie das exosomenhaltige Pellet in PBS wieder auf und füllen Sie dann das gesamte ultraklare Rohr mit PBS. Ultrazentrifugieren Sie diese Suspension bei 100, 00 mal G und bei 4 Grad Celsius für 120 Minuten, um kontaminierende Proteine zu beseitigen. Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie das Exosomepellet in 100 Mikroliter PBS wieder aus.Bei minus 80 Grad Celsius für die zukünftige Verwendung aufbewahren. Fixieren Sie zunächst jede anästhesierte Maus in der Rückenposition auf einer chirurgischen Plattform, indem Sie jede Gliedmaße mit Klebeband sichern. Legen Sie eine 3-0 Naht horizontal unter den oberen Zähnen, um den Oberkiefer an Ort und Stelle zu halten.Als nächstes tragen Sie Enthaarungscreme auf die linke Seite der Brust der Maus auf, um die Tanne von der Haut zu entfernen. Führen Sie mit einem 24 Gauge-Katheter endotracheale Intubation über die Mundhöhle durch. Und verwenden Sie ein Nagetier-Beatmungsgerät, um die Maus mit Raumluft mit einer Rate von 195 Atemzügen pro Minute zu belüften.Desinfizieren Sie die Haut mit 70% Alkohol und 10% Povidon Jod. Dann machen Sie einen 10 bis 15 Millimeter schrägen Schnitt von der linken Heckkante zur linken Achselhöhle. Verwenden Sie eine Schere, um die pectoralis major und pectoralis minor zu schneiden.Und machen Sie eine linke Thoracotamy durch den vierten intercoastal Raum. Legen Sie vorsichtig Retraktorbänder ein, um die Brusthöhle auf eine Breite von 10 Millimetern zu verteilen, wobei darauf geachtet wird, die linke Lunge nicht zu beschädigen. Danach verwenden Sie zwei gerade Pinzette, um das Perikard zu entfernen.Ziehen Sie sie auseinander und legen Sie sie hinter die Retraktor-Tipps, um das Herz zu entblößen. Verwenden Sie eine 31 Gauge Insulinnadel, um entweder MPC-Exo oder PBS intramyokardienweise in die vordere Wand des linken Ventrikels an einer Stelle zu injizieren. Verwenden Sie dann 6-0 Nylon Nähte, um die Brusthöhle, die Pectoralis Muskeln und die Haut, in der Reihenfolge zu schließen.Zwei Tage nach der PBS-Exosomentransplantation die Mäuse wie im Textprotokoll beschrieben anästhesieren. Verwenden Sie Klebeband, um eine Maus in der Supine-Position zu fixieren und vorgeheiztes Akustikgel auf den linken Brustbereich aufzutragen. Verwenden Sie als Nächstes die Echokardiographie, um die linksventrikuläre Funktion zu bewerten.Erhalten Sie die parasternale Langeachsenansicht des linken Ventrikels in zwei Dimensionen und drehen Sie dann die Ultraschallsonde um 90 Grad, um eine linke Ventrikel-Kurzachsenansicht auf papillarer Muskelebene zu erhalten. Danach nehmen Sie M-Mode-Echokardiographische Bilder auf und messen den linksventrikulären enddiastolischen Durchmesser, das linksventrikuläre endsystolische Volumen, das linksventrikuläre enddiastolische Volumen und das linksventrikuläre endsystolische Volumen. Die Herzfrequenz der Mäuse sollte für die Herzmessfunktion mindestens 400 bpm gesteuert werden.Nachdem Exosomen isoliert und aus C2C12-Zellen gereinigt wurden, wird ihre Anwesenheit durch Transmissionselektronenmikroskopie-Analyse bestätigt. Das Transmissionselektronenmikroskopiebild zeigt die Morphologie der hellen und runden förmigen Vesikel von C2C12-abgeleiteten Exosomen. Die Western-Blot-Analyse bestätigt das Vorhandensein von Exosomenmarkern wie CD63 und Tsg101.Nach der intramyokardialen Injektion in die vordere Wand der linken Herzkammer von mdx-Mäusen wird ein transluzenter Ödembereich beobachtet, der darauf hinweist, dass die Injektion in das Myokard erfolgreich ist. Immunfluoreszierende Färbung für Dystrophin wird dann durchgeführt, um festzustellen, ob die kardiale MPC-Exo-Lieferung die Dystrophin-Protein-Expression in mdx-Herzen wiederherstellt. Teilweise Restauration der Dystrophin-Expression wird mit Membranlokalisierung in einigen Kardiomyozyten beobachtet.Die Herzfunktion wird durch Echokardiographie zwei Tage nach der intramyokardialen Geburt gemessen, um festzustellen, ob die Transplation von MPC-Exo die Herzfunktion bei mdx-Mäusen verbessert. Die MPC-Exo-Behandlung wird gesehen, um die Innere Wandbewegung im Vergleich zu PBS zu verbessern, was darauf hindeutet, dass die MPC-Exo-Transplantation die Herzfunktion bei mdx-Mäusen verbessert. Die Verwendung einer 31 Gauge Insulinnadel mit der Spitze bei etwa 20 Grad ist entscheidend für den Erfolg für die Lieferung der meisten Exosomen in das Myokard und maximiert die Exposition der injizierten Exosomen, um Kardiomyozyten zu beherbergen.Im Anschluss an das Verfahren kann die Dystrophinexpression nach der Von MPC abgeleiteten Exosomeninjektion durch immunfluoreszierende Färbung nachgewiesen werden, was darauf hinweist, dass die kardiale, von MPC abgeleitete Exosomenabgabe die Dystrophin-Protein-Expression wiederherstellt. Diese Technik wird den Weg für die Kardiomyopathie-Behandlung mit exosomentragenden therapeutischen Materialien wie DNA, mRNA, lncRNA oder microRNAs ebnen.

Research

JoVE Journal

Genetics

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

Zucht- und RNA-vermittelte Gene Knockdown in der ausblenden Doppelstrang-Käfer,<em&gt; Dermestes maculatus</em

Advances in genomics have raised the possibility of probing biodiversity at an unprecedented scale. However, sequence alone will not be informative ...

Forschung

Genetik

Single-cell Gene Expression Profiling Using FACS and qPCR with Internal Standards

Einzellige Genexpressionsprofile mittels FACS und qPCR mit internen Standards

Gene expression measurements from bulk populations of cells can obscure the considerable transcriptomic variation of individual cells within those ...

Primordial Germ Cell Transplantation for CRISPR/Cas9-based Leapfrogging in Xenopus

Primordial Germ Cell Transplantation for CRISPR/Cas9-based Leapfrogging in Xenopus

Keim Urzelle Transplantation für CRISPR/Cas9-basierte in Xenopus überspringen

The creation of mutant lines by genome editing is accelerating genetic analysis in many organisms. CRISPR/Cas9 methods have been adapted for use in the ...

Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation

Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation

Embryo Mikroinjektion und Transplantation Technik für Nasonia Vitripennis Genom Manipulation

The jewel wasp Nasonia vitripennis has emerged as an effective model system for the study of processes including sex determination, haplo-diploid sex ...

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9

Hocheffiziente gen Störung der murinen und menschlichen hämatopoetischen Vorläuferzellen von CRISPR/Cas9

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. ...

Bronchoalveolar Lavage Exosomes in Lipopolysaccharide-induced Septic Lung Injury

Alvéolaire Lavage Exosomen in Lipopolysaccharid-induzierte septischen Lungenschädigung

Acute lung injury (ALI) and acute respiratory distress syndrome (ARDS) represent a heterogeneous group of lung diseases which continues to have a high ...

A Combinatorial Single-cell Approach to Characterize the Molecular and Immunophenotypic Heterogeneity of Human Stem and Progenitor Populations

Eine kombinatorische einzellige Ansatz zur molekularen Charakterisierung und Immunophenotypic Heterogenität der menschlichen Stammzellen und Vorläuferzellen Populationen

Immunophenotypic characterization and molecular analysis have long been used to delineate heterogeneity and define distinct cell populations. FACS is ...

Dissection of Enhancer Function Using Multiplex CRISPR-based Enhancer Interference in Cell Lines

Dissektion der Enhancer-Funktion mit Multiplex CRISPR-basierte Enhancer Einmischung in Zell-Linien

Multiple enhancers often regulate a given gene, yet for most genes, it remains unclear which enhancers are necessary for gene expression, and how these ...

Isolation, Characterization and MicroRNA-based Genetic Modification of Human Dental Follicle Stem Cells

Isolierung, Charakterisierung und RNA-basierte gentechnische Veränderung von menschlichen Dental follikelstimulierendes Stammzellen

To date, several stem cell types at different developmental stages are in the focus for the treatment of degenerative diseases. Yet, certain aspects, such ...

Preparation and Gene Modification of Nonhuman Primate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells

Vorbereitung und gentechnische Veränderung von Nichtmenschen Primas hämatopoetischen Stammzellen und Vorläuferzellen

Hematopoietic stem and progenitor cell (HSPC) transplantation has been a cornerstone therapy for leukemia and other cancers for nearly half a century, ...