Name: purification and transplantation of myogenic progenitor cell derived exosomes to improve cardiac function in duchenne muscular dystrophic mice
Uploaded: 2019-04-10T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Purification and Transplantation of Myogenic Progenitor Cell Derived Exosomes to Improve Cardiac Function in Duchenne Muscular Dystrophic Mice at JoVE.com

Tang erano parzialmente supportato dall'associazione americana del cuore: NIH-AR070029, NIH-HL086555, GRNT31430008, NIH-HL134354.

Gli animali sono stati gestiti secondo protocolli approvati e le norme sul benessere degli animali del Comitato uso il Medical College della Georgia all'Università di Augusta e istituzionali Animal Care.
1. isolamento e purificazione di esosomi MPC-derivato
<ol><li>Seme 5 x 106 C2C12 celle in una piastra di coltura cellulare di 15cm con 20ml completo Dulbecco modificate, mezzo di Eagle (DMEM) contenente 10% siero bovino fetale (FBS), 100 U/mL di penicillina G e 100 μg/mL di stre...

<ol>
	<li>Yiu, E. M., Kornberg, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Duchenne+muscular+dystrophy.">Duchenne muscular dystrophy.</a> Journal of Paediatrics and Child Health. 51 (8), 759-764 (2015).</li><li>Nudel, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Duchenne+muscular+dystrophy+gene+product+is+not+identical+in+muscle+and+brain.">Duchenne muscular dystrophy gene product is not identical in muscle and brain.</a> Nature. 337 (6202), 76-78 (1989).</li><li>Rae, M. G., O'Malley, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cognitive+dysfunction+in+Duchenne+muscular+dystrophy:+a+possible+role+for+neuromodulatory+immune+molecules.">Cognitive dysfunction in Duchenne muscular dystrophy: a possible role for neuromodulatory immune molecules.</a> Journal of Neurophysiology. 116 (3), 1304-1315 (2016).</li><li>Mah, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+systematic+review+and+meta-analysis+on+the+epidemiology+of+Duchenne+and+Becker+muscular+dystrophy.">A systematic review and meta-analysis on the epidemiology of Duchenne and Becker muscular dystrophy.</a> Neuromuscular Disorders. 24 (6), 482-491 (2014).</li><li>D'Amario, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+current+approach+to+heart+failure+in+Duchenne+muscular+dystrophy.">A current approach to heart failure in Duchenne muscular dystrophy.</a> Heart. 103 (22), 1770-1779 (2017).</li><li>Koeks, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+Outcomes+in+Duchenne+Muscular+Dystrophy:+A+Study+of+5345+Patients+from+the+TREAT-NMD+DMD+Global+Database.">Clinical Outcomes in Duchenne Muscular Dystrophy: A Study of 5345 Patients from the TREAT-NMD DMD Global Database.</a> Journal of Neuromuscular Diseases. 4 (4), 293-306 (2017).</li><li>Kamdar, F., Garry, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dystrophin-Deficient+Cardiomyopathy.">Dystrophin-Deficient Cardiomyopathy.</a> Journal of the American College of Cardiology. 67 (21), 2533-2546 (2016).</li><li>Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regenerative+Therapy+for+Cardiomyopathies.">Regenerative Therapy for Cardiomyopathies.</a> Journal of Cardiovascular Translational Research. , (2018).</li><li>Fayssoil, A., Nardi, O., Orlikowski, D., Annane, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiomyopathy+in+Duchenne+muscular+dystrophy:+pathogenesis+and+therapeutics.">Cardiomyopathy in Duchenne muscular dystrophy: pathogenesis and therapeutics.</a> Heart Failure Reviews. 15 (1), 103-107 (2010).</li><li>Hagan, M., Ashraf, M., Kim, I. M., Weintraub, N. L., Tang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effective+regeneration+of+dystrophic+muscle+using+autologous+iPSC-derived+progenitors+with+CRISPR-Cas9+mediated+precise+correction.">Effective regeneration of dystrophic muscle using autologous iPSC-derived progenitors with CRISPR-Cas9 mediated precise correction.</a> Medical Hypotheses. 110, 97-100 (2018).</li><li>Quinlan, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+the+mdx+mouse+cardiomyopathy:+physiological+and+morphological+findings.">Evolution of the mdx mouse cardiomyopathy: physiological and morphological findings.</a> Neuromuscular Disorders. 14 (8-9), 491-496 (2004).</li><li>Siemionow, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Creation+of+Dystrophin+Expressing+Chimeric+Cells+of+Myoblast+Origin+as+a+Novel+Stem+Cell+Based+Therapy+for+Duchenne+Muscular+Dystrophy.">Creation of Dystrophin Expressing Chimeric Cells of Myoblast Origin as a Novel Stem Cell Based Therapy for Duchenne Muscular Dystrophy.</a> Stem Cell Reviews and Reports. 14 (2), 189-199 (2018).</li><li>Sienkiewicz, D., Kulak, W., Okurowska-Zawada, B., Paszko-Patej, G., Kawnik, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Duchenne+muscular+dystrophy:+current+cell+therapies.">Duchenne muscular dystrophy: current cell therapies.</a> Therapeutic Advances in Neurological Disorders. 8 (4), 166-177 (2015).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+engraftment+of+myogenic+progenitors+from+adipose-derived+stem+cells+and+muscle+regeneration+in+dystrophic+mice.">Long-term engraftment of myogenic progenitors from adipose-derived stem cells and muscle regeneration in dystrophic mice.</a> Human Molecular Genetics. 24 (21), 6029-6040 (2015).</li><li>Ju, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+of+Cardiac+Mesenchymal+Stem+Cell-Derived+Exosomes+for+Angiogenesis.">Transplantation of Cardiac Mesenchymal Stem Cell-Derived Exosomes for Angiogenesis.</a> Journal of Cardiovascular Translational Research. 11 (5), 429-437 (2018).</li><li>Ju, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+of+Cardiac+Mesenchymal+Stem+Cell-Derived+Exosomes+Promotes+Repair+in+Ischemic+Myocardium.">Transplantation of Cardiac Mesenchymal Stem Cell-Derived Exosomes Promotes Repair in Ischemic Myocardium.</a> Journal of Cardiovascular Translational Research. 11 (5), 420-428 (2018).</li><li>Ruan, X. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suxiao+Jiuxin+pill+promotes+exosome+secretion+from+mouse+cardiac+mesenchymal+stem+cells+in+vitro.">Suxiao Jiuxin pill promotes exosome secretion from mouse cardiac mesenchymal stem cells in vitro.</a> Acta Pharmacologica Sinica. 39 (4), 569-578 (2018).</li><li>Ruan, X. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+from+Suxiao+Jiuxin+pill-treated+cardiac+mesenchymal+stem+cells+decrease+H3K27+demethylase+UTX+expression+in+mouse+cardiomyocytes+in+vitro.">Exosomes from Suxiao Jiuxin pill-treated cardiac mesenchymal stem cells decrease H3K27 demethylase UTX expression in mouse cardiomyocytes in vitro.</a> Acta Pharmacologica Sinica. 39 (4), 579-586 (2018).</li><li>Chen, Y., Tang, Y., Fan, G. C., Duan, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles+as+novel+biomarkers+and+pharmaceutic+targets+of+diseases.">Extracellular vesicles as novel biomarkers and pharmaceutic targets of diseases.</a> Acta Pharmacologica Sinica. 39 (4), 499-500 (2018).</li><li>Chen, Y., Tang, Y., Long, W., Zhang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+Cell-Released+Microvesicles+and+Exosomes+as+Novel+Biomarkers+and+Treatments+of+Diseases.">Stem Cell-Released Microvesicles and Exosomes as Novel Biomarkers and Treatments of Diseases.</a> Stem Cells International. 2016, 2417268 (2016).</li><li>Murphy, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+role+of+extracellular+vesicles+in+musculoskeletal+diseases.">Emerging role of extracellular vesicles in musculoskeletal diseases.</a> Molecular Aspects of Medicine. 60, 123-128 (2018).</li><li>Su, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosome-Derived+Dystrophin+from+Allograft+Myogenic+Progenitors+Improves+Cardiac+Function+in+Duchenne+Muscular+Dystrophic+Mice.">Exosome-Derived Dystrophin from Allograft Myogenic Progenitors Improves Cardiac Function in Duchenne Muscular Dystrophic Mice.</a> Journal of Cardiovascular Translational Research. , (2018).</li><li>Hu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosome-mediated+shuttling+of+microRNA-29+regulates+HIV+Tat+and+morphine-mediated+neuronal+dysfunction.">Exosome-mediated shuttling of microRNA-29 regulates HIV Tat and morphine-mediated neuronal dysfunction.</a> Cell Death &amp; Disease. 3, 381 (2012).</li><li>Bayoumi, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+carvedilol-responsive+microRNA,+miR-125b-5p+protects+the+heart+from+acute+myocardial+infarction+by+repressing+pro-apoptotic+bak1+and+klf13+in+cardiomyocytes.">A carvedilol-responsive microRNA, miR-125b-5p protects the heart from acute myocardial infarction by repressing pro-apoptotic bak1 and klf13 in cardiomyocytes.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 114, 72-82 (2018).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes/microvesicles+from+induced+pluripotent+stem+cells+deliver+cardioprotective+miRNAs+and+prevent+cardiomyocyte+apoptosis+in+the+ischemic+myocardium.">Exosomes/microvesicles from induced pluripotent stem cells deliver cardioprotective miRNAs and prevent cardiomyocyte apoptosis in the ischemic myocardium.</a> International Journal of Cardiology. 192, 61-69 (2015).</li><li>Cheruvanky, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+isolation+of+urinary+exosomal+biomarkers+using+a+nanomembrane+ultrafiltration+concentrator.">Rapid isolation of urinary exosomal biomarkers using a nanomembrane ultrafiltration concentrator.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. 292 (5), 1657-1661 (2007).</li><li>Oksvold, M. P., Neurauter, A., Pedersen, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetic+bead-based+isolation+of+exosomes.">Magnetic bead-based isolation of exosomes.</a> Methods in Molecular Biology. 1218, 465-481 (2015).</li><li>Pedersen, K. W., Kierulf, B., Neurauter, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+and+Generic+Isolation+of+Extracellular+Vesicles+with+Magnetic+Beads.">Specific and Generic Isolation of Extracellular Vesicles with Magnetic Beads.</a> Methods in Molecular Biology. 1660, 65-87 (2017).</li><li>Teng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+Stem+Cell-Derived+Exosomes+Improve+the+Microenvironment+of+Infarcted+Myocardium+Contributing+to+Angiogenesis+and+Anti-Inflammation.">Mesenchymal Stem Cell-Derived Exosomes Improve the Microenvironment of Infarcted Myocardium Contributing to Angiogenesis and Anti-Inflammation.</a> Cellular Physiology and Biochemistry. 37 (6), 2415-2424 (2015).</li><li>Aminzadeh, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosome-Mediated+Benefits+of+Cell+Therapy+in+Mouse+and+Human+Models+of+Duchenne+Muscular+Dystrophy.">Exosome-Mediated Benefits of Cell Therapy in Mouse and Human Models of Duchenne Muscular Dystrophy.</a> Stem Cell Reports. 10 (3), 942-955 (2018).</li></ol>

Il metodo di isolamento esosomi puri è essenziale per studiare la funzione di esosomi. Una delle tecniche comuni per l'isolamento di esosomi è polietilenglicoli (pioli) mediate precipitazioni17,18,25. Esosomi possono essere precipitati in pioli e pellettati mediante centrifugazione a bassa velocità. PEG-mediata di purificazione è molto conveniente, basso costo, non ha bisogno di qualsiasi attrezzatura avanzata, ma c'è preoc...

Distrofia muscolare di Duchenne (DMD) è una X-linked recessiva neuromuscolare malattia progressiva causata da una mutazione nel gene DMD e la perdita di distrofina funzionale1. Distrofina è espresso principalmente nel miocardio e nel muscolo scheletrico e meno è espressa nel muscolo liscio, ghiandole endocrine e neuroni2,3. DMD è il tipo più comune di distrofia muscolare con un'incidenza di uno per 3.500 a 5.000 ragazzi neonato in tutto il mondo4,5. Gli individui si sviluppano tipicamente necrosi progressiva del muscolo, perdita della deambulazione indipendente dalla prima adolescenza e morte nei decenni della loro vita a causa di scompenso cardiaco e insufficienza respiratoria6secondo al terzo.
Cardiomiopatia dilatativa, aritmie e scompenso cardiaco sono manifestazioni comuni cardiovascolare di DMD7,8. La malattia non può essere curata, trattamento di supporto può migliorare i sintomi o ritardare la progressione dell'insufficienza cardiaca, ma è molto difficile migliorare il cuore funzione9,10.
Simile ai pazienti di DMD, distrofia muscolare X-collegata (MDX) topi sono carenti di distrofina e presenti sintomi di cardiomiopatia11e di conseguenza sono ampiamente usati nella DMD associata cardiomiopatia ricerca. Al fine di ripristinare la distrofina in muscoli commoventi, terapia di trapianto allogeneic della cellula formativa ha dimostrato di essere un efficace trattamento per DMD12,13,14. Esosomi, vescicole di membrana di 30-150 nm secernute da vari tipi cellulari, svolgono un ruolo chiave nella comunicazione cellula--cellula attraverso il trasporto di materiale genetico, come RNA messaggero (mRNA) e non-codificazione RNAs15,16,17 ,18,19,20,21.
Nostri studi precedenti hanno dimostrato che gli esosomi derivati da cellule progenitrici myogenic (MPC), ad esempio linea di cellule C2C12, possono trasferire dystrophin mRNA a host cardiomiociti dopo iniezione cardiaca diretta22, che indica quella consegna allogenico di MPC-derivato esosomi (MPC-Exo) possono ripristinare transitoriamente DMD espressione genica nei topi MDX. Questo articolo si concentra su tecniche di purificazione e trapianto di MPC-Exo.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1064px;" width="1064">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:424px;">0.22-&#956;m Filter</td>
			<td style="width:280px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:185px;">09-720-004</td>
			<td style="width:175px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">15-cm Cell Culture Dish</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>157150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">24-gauge catheter</td>
			<td style="width:280px;">TERUMO</td>
			<td>SR-OX2419CA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">31-gauge insulin needle</td>
			<td style="width:280px;">BD</td>
			<td>328291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">4% paraformaldehyde&#160;</td>
			<td style="width:280px;">Affymetrix</td>
			<td>AAJ19943K2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">50 mL Centrifuge Tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>339652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">6-0 suture</td>
			<td style="width:280px;">Pro Advantage by NDC</td>
			<td>P420697</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG</td>
			<td style="width:280px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-11008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Antibiotic Antimycotic Solution</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>30-004-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-Dystrophin antibody</td>
			<td style="width:280px;">Abcam</td>
			<td>ab15277</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Antigen retriever&#160;</td>
			<td style="width:280px;">Aptum Biologics</td>
			<td>R2100-US</td>
			<td>Antigen recovery</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Autofluorescence Quenching Kit&#160;</td>
			<td style="width:280px;">Vector Laboratories</td>
			<td>SP-8400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">C2C12 cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1772</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Centrifuge</td>
			<td>Unico</td>
			<td>C8606</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Change-A-Tip High Temp Cauteries</td>
			<td>Bovie Medical Corporation</td>
			<td>HIT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Confocal microscopy</td>
			<td style="width:280px;">Zeiss</td>
			<td>Zeiss 780 Upright Confocal</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DBA/2J-mdx mice</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>013141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>10-013-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>35-011-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Goat serum&#160;</td>
			<td style="width:280px;">MP Biomedicals, LLC</td>
			<td>191356</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Isoflurane</td>
			<td style="width:280px;">Patterson Veterinary</td>
			<td>07-893-1389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ketamine</td>
			<td style="width:280px;">Henry Schein</td>
			<td>056344</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mounting Medium with DAPI&#160;</td>
			<td style="width:280px;">Vector Laboratories</td>
			<td>H-1500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mouse Retractor Set</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td>SURGI-5001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether</td>
			<td style="width:280px;">Fisher Scientific</td>
			<td>BP151-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rodent ventilator</td>
			<td style="width:280px;">Harvard Apparatus</td>
			<td>55-7066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SW-28 Ti rotor</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>342207</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">The Vevo 2100 Imaging Platform</td>
			<td style="width:280px;">FUJIFILM VisualSonics</td>
			<td>Vevo 2100</td>
			<td>Ultrasound System&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>365672</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ultra-Clear Tubes</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>344058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Xylazine (XylaMed)</td>
			<td style="width:280px;">Bimeda-MTC Animal Health Inc.</td>
			<td>1XYL003 8XYL006</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

purification and transplantation of myogenic progenitor cell derived exosomes to improve cardiac function in duchenne muscular dystrophic mice

Duchene distrofia muscolare (DMD) è una malattia genetica recessiva legata al X causata da una mancanza di distrofina funzionale. La malattia non può essere curata, e come la malattia progredisce, il paziente sviluppa sintomi di scompenso cardiaco, aritmia e cardiomiopatia dilatativa. I topi mutanti DMDMDX non esprimono distrofina e sono comunemente usati come un modello murino di DMD. Nel nostro recente studio, abbiamo osservato che l'iniezione intramiocardica di tipo largo (WT)-esosomi derivato da cellule progenitrici myogenic (MPC-Exo) ripristino transitoriamente l'espressione di distrofina nel miocardio dei topi mutanti DMDMDX , che è stato associato con un miglioramento transitorio nella funzione cardiaca suggerendo che WT-MPC-Exo può fornire un'opzione per alleviare i sintomi cardiaci di DMD. Questo articolo descrive la tecnica di purificazione di MPC-Exo e trapianto nei cuori dei topi mutanti DMDMDX .

Un diagramma di flusso per isolare e purificare gli esosomi da cellule C2C12 è illustrato nella Figura 1A. Per confermare la presenza di esosomi, abbiamo effettuato l'analisi di microscopia elettronica di trasmissione. Immagine di microscopia elettronica di trasmissione (Figura 1B) Mostra la morfologia delle vescicole di forma rotonda e brillante degli esosomi C2C12 derivato. L'analisi Western blot ha confermato la presenza di ...

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Purification and Transplantation of Myogenic Progenitor Cell Derived Exosomes to Improve Cardiac Function in Duchenne Muscular Dystrophic Mice

Qui, presentiamo un protocollo per migliorare la funzione cardiaca nei topi di distrofia muscolare di Duchenne transitoriamente trapiantando esosomi derivati da cellule progenitrici myogenic normale.

Purificazione e trapianto di cellule progenitrici Myogenic derivato esosomi per migliorare la funzione cardiaca nei topi distrofici muscolare di Duchenne

Duchene Muscular Dystrophy (DMD) is an X-linked recessive genetic disease caused by a lack of functional dystrophin protein. The disease cannot be cured, ...

Questo protocollo presenta il metodo per migliorare transitoriamente la funzione cardiaca nei topi di distrofia muscolare di Duchenne trapiantando l'esone derivato dalle normali cellule progenitrici miogeniche. Il trapianto esosomiale può migliorare la funzione cardiaca nei topi DMD in associazione con una maggiore espressione di distrofia nei cuori riceventi. Il metodo appropriato per l'isolamento, la purificazione e il trapianto intramiocardico dell'esone contribuisce al successo del trapianto di esone per migliorare la funzione cardiaca per i topi con distrofia muscolare di Duchenne.La terapia esosoma derivata da MPC potrebbe migliorare la funzione muscolare scheletrica mediante il trasferimento di mRNA di distrofina normale mediato da esosomi. Questo video illustra le tecniche critiche per la purificazione esosoma, la consegna di esosomi intramiocardio e l'ecocardiografia post-trapianto. La dimostrazione di ecocardiografia sarà fatta da Yan Shen, tecnico del nostro laboratorio.Per iniziare questa procedura, sementi cinque milioni di cellule C2C12 in un piatto di coltura di 15 centimetri con 20 millilitri di DMEM completo contenenti 10%FBS e antibiotici. Incubare a 37 gradi Celsius con anidride carbonica al 5%. Successivamente, utilizzare un rotore a secchiello oscillante per fbs ultracentrifugo a 100.000 volte G e a quattro gradi Celsius per 18 ore per preparare il mezzo impoverito da esosomi.Scartare il pellet e raccogliere il supernatante. Quando le cellule monostrato raggiungono l'80% di confluenza nel piatto di coltura, sostituire il DMEM completo con un mezzo impoverito da esosomi. Utilizzare una pipetta di trasferimento per raccogliere il supernatante dal piatto di coltura cellulare ogni 48 ore.Centrifugare i tubi a 150 volte G per dieci minuti per rimuovere le celle rimanenti. Filtrare il supernatante attraverso un filtro da 0,22 micrometri per eliminare eventuali detriti cellulari e trasferire i tubi filtrati da medi a ultra-chiari. Successivamente, utilizzare un rotore a benna oscillante per far precipitare i tubi a 100, 00 volte G e a 4 gradi Celsius per 120 minuti per far precipitare gli esosomi.Resuspend il pellet contenente esosomi in PBS e quindi riempire l'intero tubo ultra-trasparente con PBS. Ultracentrifugare questa sospensione a 100, 00 volte G e a 4 gradi Celsius per 120 minuti per eliminare le proteine contaminanti. Scartare il supernatante e rimescolare il pellet esosoma in 100 microlitri di PBS.Conservare a meno 80 gradi Celsius per un uso futuro. In primo luogo, fissare ogni mouse anestetizzato in posizione supina su una piattaforma chirurgica fissando ogni arto con nastro adesivo. Posizionare una sutura 3-0 orizzontalmente sotto i denti superiori per tenere la mascella superiore in posizione.Quindi, applicare la crema depilatoria sul lato sinistro del petto del mouse per rimuovere l'abete dalla pelle. Utilizzando un catetere calibro 24, eseguire l'intubazione endotracheale attraverso la cavità orale. E utilizzare un ventilatore per roditori per ventilare il topo con aria ambiente ad una velocità di 195 respiri al minuto.Disinfettare la pelle con il 70% di alcol e il 10% di iodio di povidone. Quindi fai un'incisione obliqua da 10 a 15 millimetri dal bordo sternale sinistro all'ascella sinistra. Usa le forbici per tagliare il pettorale maggiore e il pettorale minore.E fare una toracotamia sinistra attraverso il quarto spazio intercoastale. Inserire delicatamente bande retrattili per diffondere la cavità toracica a una larghezza di 10 millimetri facendo attenzione a non danneggiare il polmone sinistro. Dopo questo, utilizzare due pinzette dritte per rimuovere il pericardio.Separali e posizionali dietro le punte del riavvolgitore per esporre il cuore. Utilizzare un ago per insulina calibro 31 per iniettare MPC-Exo o PBS intramiocardially nella parete anteriore del ventricolo sinistro in un sito. Quindi, utilizzare 6-0 suture di nylon per chiudere la cavità toracica, i muscoli pettorali e la pelle, in sequenza.Due giorni dopo il trapianto di esosoma PBS, anestetizza i topi come delineato nel protocollo di testo. Utilizzare il nastro adesivo per fissare un mouse in posizione supina e applicare il gel acustico preriscaldato sull'area sinistra del torace. Quindi, utilizzare l'ecocardiografia per valutare la funzione ventricolare sinistra.Ottenere la vista parasternale dell'asse lungo del ventricolo sinistro in due dimensioni e quindi ruotare la sonda ad ultrasuoni di 90 gradi per ottenere una vista dell'asse corto del ventricolo sinistro a livello muscolare papillare. Successivamente, registrare le immagini ecocardiografiche in modalità M e misurare il diametro diastolico finale ventricolare sinistro, il volume sistolico finale ventricolare sinistro, il volume diastolico finale ventricolare sinistro e il volume sistolico finale ventricolare sinistro. La frequenza cardiaca dei topi deve essere controllata almeno 400 bpm per la funzione di misurazione cardiaca.Dopo che gli esosomi sono stati isolati e purificati dalle cellule C2C12, la loro presenza è confermata utilizzando l'analisi della microscopia elettronica a trasmissione. L'immagine della microscopia elettronica a trasmissione mostra la morfologia delle vescicole luminose e a forma rotonda degli esosomi derivati dal C2C12. L'analisi western blot conferma la presenza di marcatori esosomi tra cui CD63 e Tsg101.Un'area di edema traslucido si osserva dopo l'iniezione intramiocardica nella parete anteriore del ventricolo sinistro dei topi mdx che indica che l'iniezione nel miocardio ha successo. La colorazione immunofluorescente per la distroficina viene quindi eseguita per determinare se l'erogazione cardiaca di MPC-Exo ripristina l'espressione distrofina-proteina nei cuori mdx. Il ripristino parziale dell'espressione di distrofica si osserva con la localizzazione della membrana in alcuni cardiomiociti.La funzione cardiaca è misurata mediante ecocardiografia due giorni dopo l'erogazione intramiocardica per determinare se la traslazione di MPC-Exo migliora la funzione cardiaca nei topi mdx. Il trattamento MPC-Exo è visto per migliorare il movimento della parete interna rispetto al PBS, suggerendo che il trapianto MPC-Exo ha migliorato la funzione cardiaca nei topi mdx. L'uso di un ago di insulina calibro 31 con la punta a circa 20 gradi è fondamentale per il successo per la consegna della maggior parte degli esosomi nel miocardio e massimizza l'esposizione di esosomi iniettati ai cardiomiociti ospiti.Seguendo la procedura, l'espressione di distroficina può essere rilevata dopo iniezione esosoma derivata da MPC mediante colorazione immunofluorescente che indica che l'erogazione esosoma derivata da MPC cardiaco ripristina l'espressione distrofina-proteina. Questa tecnica aprirà la strada al trattamento della cardiomiopatia con materiali genetici terapeutici che trasportano esosomi tra cui DNA, mRNA, lncRNA o microRNA.

Research

JoVE Journal

Genetics

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

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Allevamento e RNA a doppio filamento mediata silenziamento genico nel Hide Beetle,<em&gt; Dermestes maculatus</em

Advances in genomics have raised the possibility of probing biodiversity at an unprecedented scale. However, sequence alone will not be informative ...

Ricerca

Genetica

Single-cell Gene Expression Profiling Using FACS and qPCR with Internal Standards

Unicellulare profili di espressione genica Utilizzando FACS e qPCR con standard interni

Gene expression measurements from bulk populations of cells can obscure the considerable transcriptomic variation of individual cells within those ...

Primordial Germ Cell Transplantation for CRISPR/Cas9-based Leapfrogging in Xenopus

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Trapianto di cellule germinali primordiali per basati su CRISPR/Cas9 rincorsa in Xenopus

The creation of mutant lines by genome editing is accelerating genetic analysis in many organisms. CRISPR/Cas9 methods have been adapted for use in the ...

Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation

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Microinjection di embrione e tecnica di trapianto per la manipolazione del genoma di Nasonia vitripennis

The jewel wasp Nasonia vitripennis has emerged as an effective model system for the study of processes including sex determination, haplo-diploid sex ...

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9

Rottura del Gene altamente efficiente di cellule progenitrici ematopoietiche Murine ed umane di CRISPR/Cas9

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. ...

Bronchoalveolar Lavage Exosomes in Lipopolysaccharide-induced Septic Lung Injury

Il lavaggio broncoalveolare esosomi in lesioni polmonari settici Lipopolysaccharide indotta

Acute lung injury (ALI) and acute respiratory distress syndrome (ARDS) represent a heterogeneous group of lung diseases which continues to have a high ...

A Combinatorial Single-cell Approach to Characterize the Molecular and Immunophenotypic Heterogeneity of Human Stem and Progenitor Populations

Una combinatoria unicellulare approccio per la caratterizzazione molecolare e Immunophenotypic eterogeneità del tronco umano e popolazioni di cellule progenitrici

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Dissection of Enhancer Function Using Multiplex CRISPR-based Enhancer Interference in Cell Lines

Dissezione della funzione Enhancer usando Multiplex basati su CRISPR Enhancer interferenze nelle linee cellulari

Multiple enhancers often regulate a given gene, yet for most genes, it remains unclear which enhancers are necessary for gene expression, and how these ...

Isolation, Characterization and MicroRNA-based Genetic Modification of Human Dental Follicle Stem Cells

Isolamento, caratterizzazione e MicroRNA-basato di modificazione genetica di cellule staminali del follicolo dentale umano

To date, several stem cell types at different developmental stages are in the focus for the treatment of degenerative diseases. Yet, certain aspects, such ...

Preparation and Gene Modification of Nonhuman Primate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells

Preparazione e modificazione genetica di staminali ematopoietiche Nonhuman Primate e cellule progenitrici

Hematopoietic stem and progenitor cell (HSPC) transplantation has been a cornerstone therapy for leukemia and other cancers for nearly half a century, ...