Name: purification and transplantation of myogenic progenitor cell derived exosomes to improve cardiac function in duchenne muscular dystrophic mice
Uploaded: 2019-04-10T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Purification and Transplantation of Myogenic Progenitor Cell Derived Exosomes to Improve Cardiac Function in Duchenne Muscular Dystrophic Mice at JoVE.com

당나라는 미국 심장 협회에 의해 부분적으로 지원 되었다: GRNT31430008, NIH-AR070029, NIH-HL086555, NIH-HL134354.

동물은 승인 된 프로토콜 및 기관 동물 관리 및 사용 위원회 오 거 스타 대학에서 조오지 아의 의학 대학의의 동물 복지 규정에 따라 처리 합니다.
1. 격리와 MPC에서 파생 된 Exosomes의 정화
<ol><li>20 mL 완전 한 Dulbecco와 15 cm 세포 문화 접시에 시드 5 x 106 C2C12 셀이 글의 중간 (DMEM) 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS), 100 U/mL 페니실린 G 및 100 μ g/mL 스 수정. 37 ° C, 5% CO2에서 ...

<ol>
	<li>Yiu, E. M., Kornberg, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Duchenne+muscular+dystrophy.">Duchenne muscular dystrophy.</a> Journal of Paediatrics and Child Health. 51 (8), 759-764 (2015).</li><li>Nudel, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Duchenne+muscular+dystrophy+gene+product+is+not+identical+in+muscle+and+brain.">Duchenne muscular dystrophy gene product is not identical in muscle and brain.</a> Nature. 337 (6202), 76-78 (1989).</li><li>Rae, M. G., O'Malley, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cognitive+dysfunction+in+Duchenne+muscular+dystrophy:+a+possible+role+for+neuromodulatory+immune+molecules.">Cognitive dysfunction in Duchenne muscular dystrophy: a possible role for neuromodulatory immune molecules.</a> Journal of Neurophysiology. 116 (3), 1304-1315 (2016).</li><li>Mah, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+systematic+review+and+meta-analysis+on+the+epidemiology+of+Duchenne+and+Becker+muscular+dystrophy.">A systematic review and meta-analysis on the epidemiology of Duchenne and Becker muscular dystrophy.</a> Neuromuscular Disorders. 24 (6), 482-491 (2014).</li><li>D'Amario, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+current+approach+to+heart+failure+in+Duchenne+muscular+dystrophy.">A current approach to heart failure in Duchenne muscular dystrophy.</a> Heart. 103 (22), 1770-1779 (2017).</li><li>Koeks, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+Outcomes+in+Duchenne+Muscular+Dystrophy:+A+Study+of+5345+Patients+from+the+TREAT-NMD+DMD+Global+Database.">Clinical Outcomes in Duchenne Muscular Dystrophy: A Study of 5345 Patients from the TREAT-NMD DMD Global Database.</a> Journal of Neuromuscular Diseases. 4 (4), 293-306 (2017).</li><li>Kamdar, F., Garry, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dystrophin-Deficient+Cardiomyopathy.">Dystrophin-Deficient Cardiomyopathy.</a> Journal of the American College of Cardiology. 67 (21), 2533-2546 (2016).</li><li>Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regenerative+Therapy+for+Cardiomyopathies.">Regenerative Therapy for Cardiomyopathies.</a> Journal of Cardiovascular Translational Research. , (2018).</li><li>Fayssoil, A., Nardi, O., Orlikowski, D., Annane, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiomyopathy+in+Duchenne+muscular+dystrophy:+pathogenesis+and+therapeutics.">Cardiomyopathy in Duchenne muscular dystrophy: pathogenesis and therapeutics.</a> Heart Failure Reviews. 15 (1), 103-107 (2010).</li><li>Hagan, M., Ashraf, M., Kim, I. M., Weintraub, N. L., Tang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effective+regeneration+of+dystrophic+muscle+using+autologous+iPSC-derived+progenitors+with+CRISPR-Cas9+mediated+precise+correction.">Effective regeneration of dystrophic muscle using autologous iPSC-derived progenitors with CRISPR-Cas9 mediated precise correction.</a> Medical Hypotheses. 110, 97-100 (2018).</li><li>Quinlan, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+the+mdx+mouse+cardiomyopathy:+physiological+and+morphological+findings.">Evolution of the mdx mouse cardiomyopathy: physiological and morphological findings.</a> Neuromuscular Disorders. 14 (8-9), 491-496 (2004).</li><li>Siemionow, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Creation+of+Dystrophin+Expressing+Chimeric+Cells+of+Myoblast+Origin+as+a+Novel+Stem+Cell+Based+Therapy+for+Duchenne+Muscular+Dystrophy.">Creation of Dystrophin Expressing Chimeric Cells of Myoblast Origin as a Novel Stem Cell Based Therapy for Duchenne Muscular Dystrophy.</a> Stem Cell Reviews and Reports. 14 (2), 189-199 (2018).</li><li>Sienkiewicz, D., Kulak, W., Okurowska-Zawada, B., Paszko-Patej, G., Kawnik, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Duchenne+muscular+dystrophy:+current+cell+therapies.">Duchenne muscular dystrophy: current cell therapies.</a> Therapeutic Advances in Neurological Disorders. 8 (4), 166-177 (2015).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+engraftment+of+myogenic+progenitors+from+adipose-derived+stem+cells+and+muscle+regeneration+in+dystrophic+mice.">Long-term engraftment of myogenic progenitors from adipose-derived stem cells and muscle regeneration in dystrophic mice.</a> Human Molecular Genetics. 24 (21), 6029-6040 (2015).</li><li>Ju, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+of+Cardiac+Mesenchymal+Stem+Cell-Derived+Exosomes+for+Angiogenesis.">Transplantation of Cardiac Mesenchymal Stem Cell-Derived Exosomes for Angiogenesis.</a> Journal of Cardiovascular Translational Research. 11 (5), 429-437 (2018).</li><li>Ju, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+of+Cardiac+Mesenchymal+Stem+Cell-Derived+Exosomes+Promotes+Repair+in+Ischemic+Myocardium.">Transplantation of Cardiac Mesenchymal Stem Cell-Derived Exosomes Promotes Repair in Ischemic Myocardium.</a> Journal of Cardiovascular Translational Research. 11 (5), 420-428 (2018).</li><li>Ruan, X. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suxiao+Jiuxin+pill+promotes+exosome+secretion+from+mouse+cardiac+mesenchymal+stem+cells+in+vitro.">Suxiao Jiuxin pill promotes exosome secretion from mouse cardiac mesenchymal stem cells in vitro.</a> Acta Pharmacologica Sinica. 39 (4), 569-578 (2018).</li><li>Ruan, X. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+from+Suxiao+Jiuxin+pill-treated+cardiac+mesenchymal+stem+cells+decrease+H3K27+demethylase+UTX+expression+in+mouse+cardiomyocytes+in+vitro.">Exosomes from Suxiao Jiuxin pill-treated cardiac mesenchymal stem cells decrease H3K27 demethylase UTX expression in mouse cardiomyocytes in vitro.</a> Acta Pharmacologica Sinica. 39 (4), 579-586 (2018).</li><li>Chen, Y., Tang, Y., Fan, G. C., Duan, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles+as+novel+biomarkers+and+pharmaceutic+targets+of+diseases.">Extracellular vesicles as novel biomarkers and pharmaceutic targets of diseases.</a> Acta Pharmacologica Sinica. 39 (4), 499-500 (2018).</li><li>Chen, Y., Tang, Y., Long, W., Zhang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+Cell-Released+Microvesicles+and+Exosomes+as+Novel+Biomarkers+and+Treatments+of+Diseases.">Stem Cell-Released Microvesicles and Exosomes as Novel Biomarkers and Treatments of Diseases.</a> Stem Cells International. 2016, 2417268 (2016).</li><li>Murphy, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+role+of+extracellular+vesicles+in+musculoskeletal+diseases.">Emerging role of extracellular vesicles in musculoskeletal diseases.</a> Molecular Aspects of Medicine. 60, 123-128 (2018).</li><li>Su, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosome-Derived+Dystrophin+from+Allograft+Myogenic+Progenitors+Improves+Cardiac+Function+in+Duchenne+Muscular+Dystrophic+Mice.">Exosome-Derived Dystrophin from Allograft Myogenic Progenitors Improves Cardiac Function in Duchenne Muscular Dystrophic Mice.</a> Journal of Cardiovascular Translational Research. , (2018).</li><li>Hu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosome-mediated+shuttling+of+microRNA-29+regulates+HIV+Tat+and+morphine-mediated+neuronal+dysfunction.">Exosome-mediated shuttling of microRNA-29 regulates HIV Tat and morphine-mediated neuronal dysfunction.</a> Cell Death &amp; Disease. 3, 381 (2012).</li><li>Bayoumi, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+carvedilol-responsive+microRNA,+miR-125b-5p+protects+the+heart+from+acute+myocardial+infarction+by+repressing+pro-apoptotic+bak1+and+klf13+in+cardiomyocytes.">A carvedilol-responsive microRNA, miR-125b-5p protects the heart from acute myocardial infarction by repressing pro-apoptotic bak1 and klf13 in cardiomyocytes.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 114, 72-82 (2018).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes/microvesicles+from+induced+pluripotent+stem+cells+deliver+cardioprotective+miRNAs+and+prevent+cardiomyocyte+apoptosis+in+the+ischemic+myocardium.">Exosomes/microvesicles from induced pluripotent stem cells deliver cardioprotective miRNAs and prevent cardiomyocyte apoptosis in the ischemic myocardium.</a> International Journal of Cardiology. 192, 61-69 (2015).</li><li>Cheruvanky, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+isolation+of+urinary+exosomal+biomarkers+using+a+nanomembrane+ultrafiltration+concentrator.">Rapid isolation of urinary exosomal biomarkers using a nanomembrane ultrafiltration concentrator.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. 292 (5), 1657-1661 (2007).</li><li>Oksvold, M. P., Neurauter, A., Pedersen, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetic+bead-based+isolation+of+exosomes.">Magnetic bead-based isolation of exosomes.</a> Methods in Molecular Biology. 1218, 465-481 (2015).</li><li>Pedersen, K. W., Kierulf, B., Neurauter, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+and+Generic+Isolation+of+Extracellular+Vesicles+with+Magnetic+Beads.">Specific and Generic Isolation of Extracellular Vesicles with Magnetic Beads.</a> Methods in Molecular Biology. 1660, 65-87 (2017).</li><li>Teng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+Stem+Cell-Derived+Exosomes+Improve+the+Microenvironment+of+Infarcted+Myocardium+Contributing+to+Angiogenesis+and+Anti-Inflammation.">Mesenchymal Stem Cell-Derived Exosomes Improve the Microenvironment of Infarcted Myocardium Contributing to Angiogenesis and Anti-Inflammation.</a> Cellular Physiology and Biochemistry. 37 (6), 2415-2424 (2015).</li><li>Aminzadeh, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosome-Mediated+Benefits+of+Cell+Therapy+in+Mouse+and+Human+Models+of+Duchenne+Muscular+Dystrophy.">Exosome-Mediated Benefits of Cell Therapy in Mouse and Human Models of Duchenne Muscular Dystrophy.</a> Stem Cell Reports. 10 (3), 942-955 (2018).</li></ol>

순수한 exosomes를 분리 하는 방법은 exosomes의 기능을 공부에 대 한 필수적입니다. Exosome 격리에 대 한 일반적인 기술 중 하나는 폴 리 에틸렌 glycols (나무 못) 중재 강수량17,18,25입니다. Exosomes, 구슬에서 시 켰 던 고 저속 원심 분리에 의해 일지도. 못-중재 정화는 매우 편리 하 고, 낮은-비용, 어떤 고급 장비를 필요 하지 않습니다 ?...

듀 켄 씨 근이 영양 증 (DMD)은 X 연결 된 열성, 진보적인 신경 근육 학 질환 기능 dystrophin1의 손실과 DMD 유전자에 돌연변이 의해 발생. Dystrophin 골격 근육에 심근, 주로 표현 하 고 덜 부드러운 근육, 내 분 비 샘과 신경2,3에 표시 됩니다. DMD는 3500 5000 신생아 소년 전세계4,5에 하나씩의 발생률과 근 위축 증의 가장 일반적인 유형입니다. 개인은 일반적으로 진보적인 근육 괴 사, 손실 초기 청소년 기, 그리고 두 번째 제 3 년간 심장 마비 및 호흡6그들의 생활의 죽음에의 한 독립적인 지나가는의 개발.
동 공이 확장 되어 심장 근육 병 증, 부정맥 및 심부는 DMD7,8의 일반적인 심장 혈관 발현. 질병을 치료 수 없습니다, 지지 치료 증상을 향상 시킬 수 있습니다 또는 심장 마비의 진행을 지연 하지만 심장 기능9,10개선 하기는 매우 어렵습니다.
DMD 환자, X 연결 된 근이 영양 증과 유사한 (MDX) 마우스 dystrophin 단백질 및 심근11의 현재 증상에 결핍을 따라서 널리 관련 된 DMD 심근 연구에 사용 합니다. 영향을 받는 근육에 dystrophin 복원 하기 위해 수용자 줄기 세포 치료는 DMD12,,1314에 대 한 효과적인 치료로 입증 되었습니다. Exosomes, 30-150 nm 막 소포 다양 한 셀 형식에 의해 은닉 된다 메신저 RNA (mRNA) 등 비 코딩 RNAs15,16,17 유전 소재 전송을 통해 셀을 통신에 핵심적인 역할을 담당 ,,1819,,2021.
우리의 이전 연구 C2C12 셀 줄, 조직적 뿌리 세포 (MPC)에서 파생 된 exosomes dystrophin 전송할 수 있습니다 직접 심장 주입22, 후 호스트 cardiomyocytes에 mRNA의 배달 된 수용자를 나타내는 MPC 파생 된 exosomes (MPC-엑 소) 정도 MDX 쥐에 DMD 유전자 발현을 복원할 수 있습니다. 이 문서는 MPC-엑 소 정화 및 이식 기술에 초점을 맞추고.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1064px;" width="1064">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:424px;">0.22-&#956;m Filter</td>
			<td style="width:280px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:185px;">09-720-004</td>
			<td style="width:175px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">15-cm Cell Culture Dish</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>157150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">24-gauge catheter</td>
			<td style="width:280px;">TERUMO</td>
			<td>SR-OX2419CA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">31-gauge insulin needle</td>
			<td style="width:280px;">BD</td>
			<td>328291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">4% paraformaldehyde&#160;</td>
			<td style="width:280px;">Affymetrix</td>
			<td>AAJ19943K2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">50 mL Centrifuge Tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>339652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">6-0 suture</td>
			<td style="width:280px;">Pro Advantage by NDC</td>
			<td>P420697</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG</td>
			<td style="width:280px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-11008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Antibiotic Antimycotic Solution</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>30-004-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-Dystrophin antibody</td>
			<td style="width:280px;">Abcam</td>
			<td>ab15277</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Antigen retriever&#160;</td>
			<td style="width:280px;">Aptum Biologics</td>
			<td>R2100-US</td>
			<td>Antigen recovery</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Autofluorescence Quenching Kit&#160;</td>
			<td style="width:280px;">Vector Laboratories</td>
			<td>SP-8400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">C2C12 cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1772</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Centrifuge</td>
			<td>Unico</td>
			<td>C8606</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Change-A-Tip High Temp Cauteries</td>
			<td>Bovie Medical Corporation</td>
			<td>HIT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Confocal microscopy</td>
			<td style="width:280px;">Zeiss</td>
			<td>Zeiss 780 Upright Confocal</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DBA/2J-mdx mice</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>013141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>10-013-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>35-011-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Goat serum&#160;</td>
			<td style="width:280px;">MP Biomedicals, LLC</td>
			<td>191356</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Isoflurane</td>
			<td style="width:280px;">Patterson Veterinary</td>
			<td>07-893-1389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ketamine</td>
			<td style="width:280px;">Henry Schein</td>
			<td>056344</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mounting Medium with DAPI&#160;</td>
			<td style="width:280px;">Vector Laboratories</td>
			<td>H-1500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mouse Retractor Set</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td>SURGI-5001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether</td>
			<td style="width:280px;">Fisher Scientific</td>
			<td>BP151-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rodent ventilator</td>
			<td style="width:280px;">Harvard Apparatus</td>
			<td>55-7066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SW-28 Ti rotor</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>342207</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">The Vevo 2100 Imaging Platform</td>
			<td style="width:280px;">FUJIFILM VisualSonics</td>
			<td>Vevo 2100</td>
			<td>Ultrasound System&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>365672</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ultra-Clear Tubes</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>344058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Xylazine (XylaMed)</td>
			<td style="width:280px;">Bimeda-MTC Animal Health Inc.</td>
			<td>1XYL003 8XYL006</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

purification and transplantation of myogenic progenitor cell derived exosomes to improve cardiac function in duchenne muscular dystrophic mice

Duchene 근 위축 증 (DMD)은 X 연결 된 열성 유전 질환 기능 dystrophin 단백질 부족으로 인 한. 질병을 치료 수 없습니다, 그리고 및 질병 진행 되는 동안, 환자는 동 공이 확장 되어 심장 근육 병 증, 부정맥, 울 혈 심장 마비의 증상을 개발 합니다. DMDMDX 돌연변이 마우스 dystrophin, 표현 하지 않는 그리고의 DMD 쥐 모형으로 일반적으로 사용 됩니다. 우리의 최근 연구에서 그 intramyocardial 주입 와이드 타입 (WT)의 관찰-조직적 조상 세포에서 파생 된 exosomes (MPC-엑 소) 정도 연관 되었다 dystrophin DMDMDX 돌연변이 생쥐의 심근에서의 식을 복원 심장 기능을 제안에 일시적인 개선 WT-MPC-엑 소 DMD의 심장 증상을 완화 하는 옵션을 제공할 수 있습니다. 이 문서에서는 MPC-엑 소 정화 및 DMDMDX 돌연변이 생쥐의 마음에 이식 하는 기술을 설명합니다.

분리 하 고 순화 C2C12 세포에서 exosomes에 대 한 흐름 차트는 그림 1에 표시 됩니다. Exosomes의 존재를 확인, 우리는 전송 전자 현미경 분석을 수행. 전송 전자 현미경 이미지 (그림 1B) 파생 하는 C2C12 exosomes의 밝고 둥근 모양 vesicles의 형태를 보여 줍니다. 서쪽 오 점 분석 exosome 마커, CD63 및 TSG101 등의 존재를 확인 했다 (<strong class="xf...

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Purification and Transplantation of Myogenic Progenitor Cell Derived Exosomes to Improve Cardiac Function in Duchenne Muscular Dystrophic Mice

여기, 선물이 정도 정상 조직적 조상 세포에서 파생 된 exosomes를 이식 하 여 듀 켄 씨 근이 영양 증 쥐에 심장 기능을 개선 하는 프로토콜.

정화와 조직적 조상 세포의 이식 파생 듀 켄 씨 근 Dystrophic 쥐에서 심장 기능을 개선 하기 위해 Exosomes

Duchene Muscular Dystrophy (DMD) is an X-linked recessive genetic disease caused by a lack of functional dystrophin protein. The disease cannot be cured, ...

이 프로토콜은 일반적인 근생 선조 세포에서 파생된 엑슨을 이식하여 Duchenne의 근 위축증 마우스에서 심장 기능을 전환적으로 향상시키는 방법을 제시합니다. 외경 이식은 수령인 심혼에 있는 이영양증의 증가한 발현과 관련하여 DMD 마우스에 있는 심장 기능을 향상할 수 있습니다. 엑슨 분리, 정화 및 인트라메요카르방 이식에 적합한 방법은 듀첸의 근이영양증을 가진 마우스의 심장 기능을 향상시키기 위해 엑슨 이식의 성공에 기여합니다.MPC 유래 엑소솜 치료는 엑소좀 매개된 정상 디스트로핀 mRNA 전달에 의한 골격 근육 기능을 향상시킬 수 있다. 이 비디오는 이식 후 외성 정제, 인트라미카르탈 엑소솜 전달 및 에코카르티오그래피를 위한 중요한 기술을 보여줍니다. 에코카르디그래피의 데모는 우리 실험실의 기술자 인 Yan Shen에 의해 수행됩니다.이 절차를 시작하기 위하여는, 10%FBS및 항생제를 포함하는 완전한 DMEM의 20 밀리리터와 15 센티미터 배양 접시에 5백만 C2C12 세포를 종자. 이산화탄소 5%와 섭씨 37도에서 배양합니다. 다음으로, 100, 000배, 섭씨 4도에서 초원심분리기 FBS에 스윙 버킷 로터를 사용하여 18시간 동안 섭씨 4도에서 엑소좀 고갈된 매체를 준비한다.펠릿을 버리고 상체를 수집합니다. 단층 세포가 배양 접시에 80%에 도달하면 전체 DMEM을 exosome 고갈 된 매체로 대체하십시오. 48시간마다 세포 배양 접시에서 상체를 수집하기 위해 이송 파이펫을 사용하십시오.나머지 세포를 제거하기 위해 10 분 동안 150 배 G에서 튜브를 원심 분리합니다. 0.22 마이크로미터 필터를 통해 상체를 필터링하여 세포 이물질을 제거하고 여과된 매체를 초투명 튜브로 옮기습니다. 다음으로, 스윙 버킷 로터를 사용하여 튜브를 100, 00배, 섭씨 4도에서 120분간 사용하여 엑소좀을 침전시합니다.PBS에서 엑소솜 함유 펠릿을 다시 중단한 다음 PBS로 전체 초투명 튜브를 채웁니다. 이 서스펜션은 100배, 00배, 섭씨 4도에서 120분 동안 오염단백질을 제거합니다. 슈퍼네티드를 버리고 PBS의 100 마이크로리터에서 엑소솜 펠릿을 재차 놓습니다.향후 사용을 위해 영하 80도에 보관하십시오. 먼저, 각 마취마우스를 수술 플랫폼의 척추 위치에 고정하여 각 사지를 테이프로 고정시한다. 윗턱을 제자리에 고정시키기 위해 위니 아래에 수평으로 3-0 봉합사를 놓습니다.다음으로, 마우스 가슴의 왼쪽에 디필 크림을 바르면 피부에서 전나무를 제거합니다. 24 게이지 카테터를 사용하여 구강을 통해 내트라큐레이션 삽관을 수행합니다. 설치류 인공호흡기를 사용하여 분당 195회 호흡속도로 실내 공기로 마우스를 환기시합니다.70%의 알코올과 10%의 포비도네 요오드로 피부를 소독합니다. 그런 다음 왼쪽 흉골 가장자리에서 왼쪽 겨드랑이까지 10 ~ 15 mm 경사 절개를 합니다. 가위를 사용하여 가슴 전공을 자르고 가슴은 경미한 것으로 절단하십시오.그리고 네 번째 해안 간 공간을 통해 왼쪽 토라 코타미를합니다. 흉부 구멍을 10mm 너비로 퍼지도록 리트랙터 밴드를 부드럽게 삽입하여 왼쪽 폐를 손상시키지 않도록 주의하십시오. 그 후 두 개의 직선 핀셋을 사용하여 심근을 제거하십시오.그들을 떼어 내고 마음을 드러내기 위해 리트랙터 팁 뒤에 놓습니다. 31 게이지 인슐린 바늘을 사용하여 MPC-엑소 또는 PBS intramyocardially 한 부위에 좌심실의 전방 벽에 주입한다. 그런 다음 6-0 나일론 봉합사를 사용하여 흉부 구멍, 가슴 근육 및 피부를 순차적으로 닫습니다.PBS 엑소솜 이식 후 2일 후, 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 마우스를 마취한다. 테이프를 사용하여 마우스를 supine 위치에 고정하고 왼쪽 가슴 부위에 예열 된 어쿠스틱 젤을 바르습니다. 다음으로, 에코카예피를 사용하여 좌심실 기능을 평가합니다.좌심실의 기갑 긴 축 뷰를 2차원에서 얻은 다음 초음파 프로브를 90도 회전하여 유두 근육 수준에서 좌심실 짧은 축 뷰를 얻습니다. 그 후 M-mode 심초음파 이미지를 기록하고 왼쪽 심실 종횡확장기 직경, 좌심실 단부 수축기 부피, 좌심실 단부 확장기 부피 및 좌심실 단부 수축기 부피를 측정합니다. 마우스의 심박수는 심장 측정 기능을 위해 적어도 400 bpm을 제어해야 합니다.엑소좀이 C2C12 세포로부터 분리되고 정제된 후, 이들의 존재는 투과 전자 현미경 분석을 사용하여 확인된다. 전송 전자 현미경 이미지는 C2C12 유래 엑소좀의 밝고 둥근 모양의 소포의 형태를 보여줍니다. 웨스턴 블롯 분석은 CD63 및 Tsg101을 포함한 엑소솜 마커의 존재를 확인합니다.반투명 부종 영역은 심근내 내 주입이 성공했음을 나타내는 mdx 마우스의 좌심실의 전방 벽에 내트라모니카심을 주입한 후에 관찰된다. 디스트로핀에 대한 면역 형광 염색은 심장 MPC-엑소 전달이 mdx 심혼에 있는 dystrophin 단백질 발현을 복원하는지 결정하기 위하여 그 때 수행됩니다. dystrophin 발현의 부분적인 복원은 심근 세포의 몇몇에 있는 막 국소화로 관찰됩니다.심장 기능은 MPC-엑소의 트랜스포이션이 mdx 마우스의 심장 기능을 향상시키는지 여부를 결정하기 위해 내트라미쿄카르탈 전달 후 이틀 후 에코카르디그래피로 측정된다. MPC-엑소 치료는 PBS에 비해 내부 벽 의 움직임을 개선하는 것으로 보이며, MPC-엑소 이식이 mdx 마우스에서 심장 기능을 향상시킨다는 것을 시사합니다. 약 20도에서 팁과 31 게이지 인슐린 바늘을 사용 하 여 심근에 대부분의 엑소좀의 전달에 대 한 성공에 대 한 중요 한 심근 세포를 호스트 하는 주입 된 엑소좀의 노출을 극대화.시술에 이어, Dystrophin 발현은 MPC 유래 엑소솜 주입 후 면역형광 염색에 의해 검출될 수 있으며 이는 심장 MPC 유래 엑소좀 전달이 dystrophin-protein 발현을 회복한다는 것을 나타낸다. 이 기술은 DNA, mRNA, lncRNA, 또는 microRNAs를 포함하여 엑소좀 운반 치료 유전 물질을 가진 심근병증 처리를 위한 도로를 포장할 것입니다.

Research

JoVE Journal

Genetics

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

양육 및 숨기기 비틀에 RNA 매개 유전자 최저를 두 번 좌초,<em&gt; Dermestes maculatus</em

Advances in genomics have raised the possibility of probing biodiversity at an unprecedented scale. However, sequence alone will not be informative ...

연구

유전학

Single-cell Gene Expression Profiling Using FACS and qPCR with Internal Standards

내부 기준에 FACS 및 qPCR에 사용 단일 세포 유전자 발현 프로파일 링

Gene expression measurements from bulk populations of cells can obscure the considerable transcriptomic variation of individual cells within those ...

Primordial Germ Cell Transplantation for CRISPR/Cas9-based Leapfrogging in Xenopus

Primordial Germ Cell Transplantation for CRISPR/Cas9-based Leapfrogging in Xenopus

Xenopus 에 Leapfrogging CRISPR/Cas9-기반에 대 한 원시 생식 세포 이식

The creation of mutant lines by genome editing is accelerating genetic analysis in many organisms. CRISPR/Cas9 methods have been adapted for use in the ...

Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation

Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation

태아 Microinjection 및 Nasonia vitripennis 게놈 조작을 위한 이식 기술

The jewel wasp Nasonia vitripennis has emerged as an effective model system for the study of processes including sex determination, haplo-diploid sex ...

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9

CRISPR/Cas9에 의해 Murine 인간과 조 혈 조상 세포의 고효율 유전자 장애

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. ...

Bronchoalveolar Lavage Exosomes in Lipopolysaccharide-induced Septic Lung Injury

Bronchoalveolar 게 Exosomes Lipopolysaccharide 유도 정화 조 폐 상해에

Acute lung injury (ALI) and acute respiratory distress syndrome (ARDS) represent a heterogeneous group of lung diseases which continues to have a high ...

A Combinatorial Single-cell Approach to Characterize the Molecular and Immunophenotypic Heterogeneity of Human Stem and Progenitor Populations

분자 특성 조합 단일 셀 접근 및 인간의 줄기 및 조상 인구 Immunophenotypic이

Immunophenotypic characterization and molecular analysis have long been used to delineate heterogeneity and define distinct cell populations. FACS is ...

Dissection of Enhancer Function Using Multiplex CRISPR-based Enhancer Interference in Cell Lines

증강 기능 다중 CRISPR 기반 증강 간섭 셀 라인에서의 해 부

Multiple enhancers often regulate a given gene, yet for most genes, it remains unclear which enhancers are necessary for gene expression, and how these ...

Isolation, Characterization and MicroRNA-based Genetic Modification of Human Dental Follicle Stem Cells

절연, 특성화 및 예측에 관한 기반 유전자 조작 인간 치과 여 포 줄기 세포의

To date, several stem cell types at different developmental stages are in the focus for the treatment of degenerative diseases. Yet, certain aspects, such ...

Preparation and Gene Modification of Nonhuman Primate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells

준비 및 Nonhuman 영장류 조 혈 줄기와 조상 세포의 유전자 수정

Hematopoietic stem and progenitor cell (HSPC) transplantation has been a cornerstone therapy for leukemia and other cancers for nearly half a century, ...