Name: purification and transplantation of myogenic progenitor cell derived exosomes to improve cardiac function in duchenne muscular dystrophic mice
Uploaded: 2019-04-10T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Purification and Transplantation of Myogenic Progenitor Cell Derived Exosomes to Improve Cardiac Function in Duchenne Muscular Dystrophic Mice at JoVE.com

Tang ble delvis støttet av American Heart Association: GRNT31430008 NIH-AR070029 NIH-HL086555, NIH-HL134354.

Dyrene ble behandlet godkjent protokoller og dyrevelferd forskriftene av institusjonelle Animal Care og bruk komité Medical College of Georgia på Augusta University.
1. isolering og rensing av MPC-avledet Exosomes
<ol><li>Frø 5 x 106 C2C12 celler i en 15 cm celle kultur parabol med 20 mL komplett Dulbecco endret Eagle's medium (DMEM) som inneholder 10% fosterets bovin serum (FBS), 100 U/mL penicillin G og 100 μg/mL streptomycin. Ruge på 37 ° C og 5% CO2.</li>
	<li...

<ol>
	<li>Yiu, E. M., Kornberg, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Duchenne+muscular+dystrophy.">Duchenne muscular dystrophy.</a> Journal of Paediatrics and Child Health. 51 (8), 759-764 (2015).</li><li>Nudel, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Duchenne+muscular+dystrophy+gene+product+is+not+identical+in+muscle+and+brain.">Duchenne muscular dystrophy gene product is not identical in muscle and brain.</a> Nature. 337 (6202), 76-78 (1989).</li><li>Rae, M. G., O'Malley, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cognitive+dysfunction+in+Duchenne+muscular+dystrophy:+a+possible+role+for+neuromodulatory+immune+molecules.">Cognitive dysfunction in Duchenne muscular dystrophy: a possible role for neuromodulatory immune molecules.</a> Journal of Neurophysiology. 116 (3), 1304-1315 (2016).</li><li>Mah, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+systematic+review+and+meta-analysis+on+the+epidemiology+of+Duchenne+and+Becker+muscular+dystrophy.">A systematic review and meta-analysis on the epidemiology of Duchenne and Becker muscular dystrophy.</a> Neuromuscular Disorders. 24 (6), 482-491 (2014).</li><li>D'Amario, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+current+approach+to+heart+failure+in+Duchenne+muscular+dystrophy.">A current approach to heart failure in Duchenne muscular dystrophy.</a> Heart. 103 (22), 1770-1779 (2017).</li><li>Koeks, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+Outcomes+in+Duchenne+Muscular+Dystrophy:+A+Study+of+5345+Patients+from+the+TREAT-NMD+DMD+Global+Database.">Clinical Outcomes in Duchenne Muscular Dystrophy: A Study of 5345 Patients from the TREAT-NMD DMD Global Database.</a> Journal of Neuromuscular Diseases. 4 (4), 293-306 (2017).</li><li>Kamdar, F., Garry, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dystrophin-Deficient+Cardiomyopathy.">Dystrophin-Deficient Cardiomyopathy.</a> Journal of the American College of Cardiology. 67 (21), 2533-2546 (2016).</li><li>Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regenerative+Therapy+for+Cardiomyopathies.">Regenerative Therapy for Cardiomyopathies.</a> Journal of Cardiovascular Translational Research. , (2018).</li><li>Fayssoil, A., Nardi, O., Orlikowski, D., Annane, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiomyopathy+in+Duchenne+muscular+dystrophy:+pathogenesis+and+therapeutics.">Cardiomyopathy in Duchenne muscular dystrophy: pathogenesis and therapeutics.</a> Heart Failure Reviews. 15 (1), 103-107 (2010).</li><li>Hagan, M., Ashraf, M., Kim, I. M., Weintraub, N. L., Tang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effective+regeneration+of+dystrophic+muscle+using+autologous+iPSC-derived+progenitors+with+CRISPR-Cas9+mediated+precise+correction.">Effective regeneration of dystrophic muscle using autologous iPSC-derived progenitors with CRISPR-Cas9 mediated precise correction.</a> Medical Hypotheses. 110, 97-100 (2018).</li><li>Quinlan, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+the+mdx+mouse+cardiomyopathy:+physiological+and+morphological+findings.">Evolution of the mdx mouse cardiomyopathy: physiological and morphological findings.</a> Neuromuscular Disorders. 14 (8-9), 491-496 (2004).</li><li>Siemionow, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Creation+of+Dystrophin+Expressing+Chimeric+Cells+of+Myoblast+Origin+as+a+Novel+Stem+Cell+Based+Therapy+for+Duchenne+Muscular+Dystrophy.">Creation of Dystrophin Expressing Chimeric Cells of Myoblast Origin as a Novel Stem Cell Based Therapy for Duchenne Muscular Dystrophy.</a> Stem Cell Reviews and Reports. 14 (2), 189-199 (2018).</li><li>Sienkiewicz, D., Kulak, W., Okurowska-Zawada, B., Paszko-Patej, G., Kawnik, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Duchenne+muscular+dystrophy:+current+cell+therapies.">Duchenne muscular dystrophy: current cell therapies.</a> Therapeutic Advances in Neurological Disorders. 8 (4), 166-177 (2015).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+engraftment+of+myogenic+progenitors+from+adipose-derived+stem+cells+and+muscle+regeneration+in+dystrophic+mice.">Long-term engraftment of myogenic progenitors from adipose-derived stem cells and muscle regeneration in dystrophic mice.</a> Human Molecular Genetics. 24 (21), 6029-6040 (2015).</li><li>Ju, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+of+Cardiac+Mesenchymal+Stem+Cell-Derived+Exosomes+for+Angiogenesis.">Transplantation of Cardiac Mesenchymal Stem Cell-Derived Exosomes for Angiogenesis.</a> Journal of Cardiovascular Translational Research. 11 (5), 429-437 (2018).</li><li>Ju, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+of+Cardiac+Mesenchymal+Stem+Cell-Derived+Exosomes+Promotes+Repair+in+Ischemic+Myocardium.">Transplantation of Cardiac Mesenchymal Stem Cell-Derived Exosomes Promotes Repair in Ischemic Myocardium.</a> Journal of Cardiovascular Translational Research. 11 (5), 420-428 (2018).</li><li>Ruan, X. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suxiao+Jiuxin+pill+promotes+exosome+secretion+from+mouse+cardiac+mesenchymal+stem+cells+in+vitro.">Suxiao Jiuxin pill promotes exosome secretion from mouse cardiac mesenchymal stem cells in vitro.</a> Acta Pharmacologica Sinica. 39 (4), 569-578 (2018).</li><li>Ruan, X. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+from+Suxiao+Jiuxin+pill-treated+cardiac+mesenchymal+stem+cells+decrease+H3K27+demethylase+UTX+expression+in+mouse+cardiomyocytes+in+vitro.">Exosomes from Suxiao Jiuxin pill-treated cardiac mesenchymal stem cells decrease H3K27 demethylase UTX expression in mouse cardiomyocytes in vitro.</a> Acta Pharmacologica Sinica. 39 (4), 579-586 (2018).</li><li>Chen, Y., Tang, Y., Fan, G. C., Duan, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles+as+novel+biomarkers+and+pharmaceutic+targets+of+diseases.">Extracellular vesicles as novel biomarkers and pharmaceutic targets of diseases.</a> Acta Pharmacologica Sinica. 39 (4), 499-500 (2018).</li><li>Chen, Y., Tang, Y., Long, W., Zhang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+Cell-Released+Microvesicles+and+Exosomes+as+Novel+Biomarkers+and+Treatments+of+Diseases.">Stem Cell-Released Microvesicles and Exosomes as Novel Biomarkers and Treatments of Diseases.</a> Stem Cells International. 2016, 2417268 (2016).</li><li>Murphy, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+role+of+extracellular+vesicles+in+musculoskeletal+diseases.">Emerging role of extracellular vesicles in musculoskeletal diseases.</a> Molecular Aspects of Medicine. 60, 123-128 (2018).</li><li>Su, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosome-Derived+Dystrophin+from+Allograft+Myogenic+Progenitors+Improves+Cardiac+Function+in+Duchenne+Muscular+Dystrophic+Mice.">Exosome-Derived Dystrophin from Allograft Myogenic Progenitors Improves Cardiac Function in Duchenne Muscular Dystrophic Mice.</a> Journal of Cardiovascular Translational Research. , (2018).</li><li>Hu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosome-mediated+shuttling+of+microRNA-29+regulates+HIV+Tat+and+morphine-mediated+neuronal+dysfunction.">Exosome-mediated shuttling of microRNA-29 regulates HIV Tat and morphine-mediated neuronal dysfunction.</a> Cell Death &amp; Disease. 3, 381 (2012).</li><li>Bayoumi, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+carvedilol-responsive+microRNA,+miR-125b-5p+protects+the+heart+from+acute+myocardial+infarction+by+repressing+pro-apoptotic+bak1+and+klf13+in+cardiomyocytes.">A carvedilol-responsive microRNA, miR-125b-5p protects the heart from acute myocardial infarction by repressing pro-apoptotic bak1 and klf13 in cardiomyocytes.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 114, 72-82 (2018).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes/microvesicles+from+induced+pluripotent+stem+cells+deliver+cardioprotective+miRNAs+and+prevent+cardiomyocyte+apoptosis+in+the+ischemic+myocardium.">Exosomes/microvesicles from induced pluripotent stem cells deliver cardioprotective miRNAs and prevent cardiomyocyte apoptosis in the ischemic myocardium.</a> International Journal of Cardiology. 192, 61-69 (2015).</li><li>Cheruvanky, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+isolation+of+urinary+exosomal+biomarkers+using+a+nanomembrane+ultrafiltration+concentrator.">Rapid isolation of urinary exosomal biomarkers using a nanomembrane ultrafiltration concentrator.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. 292 (5), 1657-1661 (2007).</li><li>Oksvold, M. P., Neurauter, A., Pedersen, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetic+bead-based+isolation+of+exosomes.">Magnetic bead-based isolation of exosomes.</a> Methods in Molecular Biology. 1218, 465-481 (2015).</li><li>Pedersen, K. W., Kierulf, B., Neurauter, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+and+Generic+Isolation+of+Extracellular+Vesicles+with+Magnetic+Beads.">Specific and Generic Isolation of Extracellular Vesicles with Magnetic Beads.</a> Methods in Molecular Biology. 1660, 65-87 (2017).</li><li>Teng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+Stem+Cell-Derived+Exosomes+Improve+the+Microenvironment+of+Infarcted+Myocardium+Contributing+to+Angiogenesis+and+Anti-Inflammation.">Mesenchymal Stem Cell-Derived Exosomes Improve the Microenvironment of Infarcted Myocardium Contributing to Angiogenesis and Anti-Inflammation.</a> Cellular Physiology and Biochemistry. 37 (6), 2415-2424 (2015).</li><li>Aminzadeh, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosome-Mediated+Benefits+of+Cell+Therapy+in+Mouse+and+Human+Models+of+Duchenne+Muscular+Dystrophy.">Exosome-Mediated Benefits of Cell Therapy in Mouse and Human Models of Duchenne Muscular Dystrophy.</a> Stem Cell Reports. 10 (3), 942-955 (2018).</li></ol>

Metoden isolere ren exosomes er avgjørende for å studere funksjonen til exosomes. En av de vanlige teknikkene for exosome isolasjon er polyetylen glycols (plugger) mediert nedbør17,18,25. Exosomes kan igangsatte i plugger og pelleted med lav hastighet sentrifugering. PEG-mediert rensing er veldig praktisk, rimelig, det trenger ikke noen avansert utstyr, men det er bekymring for renhet av exosomes siden andre lipoproteiner kan...

Duchenne muskeldystrofi (DMD) er en X-tilknyttet tilbakeslag, progressive nevromuskulær sykdom forårsaket av en mutasjon i DMD gene og tap av funksjonelle dystrophin1. Dystrophin er uttrykt i skjelettmuskulatur og myokard, og uttrykkes mindre glatt muskel, endokrine kjertler og neurons2,3. DMD er den vanligste typen muskeldystrofi med en forekomst av en per 3500 til å 5000 nyfødte gutter verden4,5. Individer utvikler vanligvis progressive muskelavslapning nekrose, tap av uavhengige vandre ved tidlig ungdom, og døde i de andre til tredje tiårene av livet på grunn av hjertesvikt og respirasjonssvikt6.
Dilaterte kardiomyopati, arytmi og hjertesvikt er vanlige hjerte manifestasjoner av DMD7,8. Sykdommen kan ikke kureres, støttende behandling kan forbedre symptomer eller forsinke utviklingen av hjertesvikt, men det er svært vanskelig å forbedre hjertet funksjon9,10.
Lik DMD pasienter, X-tilknyttet muskeldystrofi (MDX) mus er mangelfull i dystrophin protein og nåværende symptomer på kardiomyopati11, og er derfor mye brukt i DMD forbundet kardiomyopati forskning. For å gjenopprette dystrophin i berørte muskler, fører allogene stilk cellen terapi har vist seg for å være en effektiv behandling for DMD12,13,14. Exosomes, 30-150 nm membran blemmer utskilles av ulike celletyper, spiller en viktig rolle i celle til celle kommunikasjon gjennom genetisk materiale transport som budbringer RNA (mRNA) og ikke-koding RNAs15,16,17 ,18,19,20,21.
Våre tidligere studier har vist at exosomes avledet fra myogenic progenitor celler (MPC), for eksempel C2C12 celle linje, kan overføre dystrophin mRNA til verten cardiomyocytes etter direkte cardiac injeksjon22, indikerer at allogene levering av MPC-avledet exosomes (MPC-Exo) kan transiently gjenopprette DMD genuttrykk i MDX mus. Denne artikkelen fokuserer på MPC-Exo rensing og transplantasjon teknikker.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1064px;" width="1064">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:424px;">0.22-&#956;m Filter</td>
			<td style="width:280px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:185px;">09-720-004</td>
			<td style="width:175px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">15-cm Cell Culture Dish</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>157150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">24-gauge catheter</td>
			<td style="width:280px;">TERUMO</td>
			<td>SR-OX2419CA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">31-gauge insulin needle</td>
			<td style="width:280px;">BD</td>
			<td>328291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">4% paraformaldehyde&#160;</td>
			<td style="width:280px;">Affymetrix</td>
			<td>AAJ19943K2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">50 mL Centrifuge Tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>339652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">6-0 suture</td>
			<td style="width:280px;">Pro Advantage by NDC</td>
			<td>P420697</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG</td>
			<td style="width:280px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-11008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Antibiotic Antimycotic Solution</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>30-004-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-Dystrophin antibody</td>
			<td style="width:280px;">Abcam</td>
			<td>ab15277</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Antigen retriever&#160;</td>
			<td style="width:280px;">Aptum Biologics</td>
			<td>R2100-US</td>
			<td>Antigen recovery</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Autofluorescence Quenching Kit&#160;</td>
			<td style="width:280px;">Vector Laboratories</td>
			<td>SP-8400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">C2C12 cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1772</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Centrifuge</td>
			<td>Unico</td>
			<td>C8606</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Change-A-Tip High Temp Cauteries</td>
			<td>Bovie Medical Corporation</td>
			<td>HIT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Confocal microscopy</td>
			<td style="width:280px;">Zeiss</td>
			<td>Zeiss 780 Upright Confocal</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DBA/2J-mdx mice</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>013141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>10-013-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>35-011-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Goat serum&#160;</td>
			<td style="width:280px;">MP Biomedicals, LLC</td>
			<td>191356</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Isoflurane</td>
			<td style="width:280px;">Patterson Veterinary</td>
			<td>07-893-1389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ketamine</td>
			<td style="width:280px;">Henry Schein</td>
			<td>056344</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mounting Medium with DAPI&#160;</td>
			<td style="width:280px;">Vector Laboratories</td>
			<td>H-1500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mouse Retractor Set</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td>SURGI-5001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether</td>
			<td style="width:280px;">Fisher Scientific</td>
			<td>BP151-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rodent ventilator</td>
			<td style="width:280px;">Harvard Apparatus</td>
			<td>55-7066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SW-28 Ti rotor</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>342207</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">The Vevo 2100 Imaging Platform</td>
			<td style="width:280px;">FUJIFILM VisualSonics</td>
			<td>Vevo 2100</td>
			<td>Ultrasound System&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>365672</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ultra-Clear Tubes</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>344058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Xylazine (XylaMed)</td>
			<td style="width:280px;">Bimeda-MTC Animal Health Inc.</td>
			<td>1XYL003 8XYL006</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

purification and transplantation of myogenic progenitor cell derived exosomes to improve cardiac function in duchenne muscular dystrophic mice

Duchene muskeldystrofi (DMD) er en X-tilknyttet recessiv genetisk sykdom forårsaket av mangel på funksjonell dystrophin protein. Sykdommen kan ikke kureres, og som sykdommen utvikler seg, pasienten utvikler symptomer Dilaterte kardiomyopati, arytmi og hjertesvikt. DMDMDX mutant musene uttrykke ikke dystrophin, og blir ofte brukt som en musemodell av DMD. I vår siste undersøkelse, observerte vi at intramyocardial injeksjon av bredt type (WT)-myogenic stamfar celler-avledet exosomes (MPC-Exo) transiently gjenopprettet uttrykk for dystrophin i myokard DMDMDX mutant mus, som var tilknyttet med en midlertidig forbedring i hjertefunksjon tyder på at kan WT-MPC-Exo gi et alternativ å avlaste kardiale symptomer på DMD. Denne artikkelen beskriver teknikken for MPC-Exo rensing og transplantasjon i hjerter DMDMDX mutant mus.

Et flytskjema for å isolere og rensende exosomes fra C2C12 celler vises i figur 1A. For å bekrefte tilstedeværelse av exosomes, utført vi overføring elektronmikroskop analyse. Overføring elektronmikroskop bildet (figur 1B) viser morfologi av lyse og rund form blemmer av C2C12 avledet exosomes. Western blot analyse bekreftet tilstedeværelse av exosome markører, inkludert CD63 og TSG101 (figur 1</stron...

Watch this Scientific Journal Video about Purification and Transplantation of Myogenic Progenitor Cell Derived Exosomes to Improve Cardiac Function in Duchenne Muscular Dystrophic Mice at JoVE.com

Purification and Transplantation of Myogenic Progenitor Cell Derived Exosomes to Improve Cardiac Function in Duchenne Muscular Dystrophic Mice

Her presenterer vi en protokoll for å forbedre transiently hjertefunksjon i Duchenne muskeldystrofi mus ved transplanting exosomes avledet fra normal myogenic progenitor celler.

Rensing og transplantasjon av Myogenic stamfar celle avledet Exosomes for å forbedre hjertefunksjon i Duchenne muskel Dystrophic mus

Duchene Muscular Dystrophy (DMD) is an X-linked recessive genetic disease caused by a lack of functional dystrophin protein. The disease cannot be cured, ...

Denne protokollen presentere metoden for å overgangs forbedre hjertefunksjonen i Duchenne muskeldystrofi mus ved å transplantere exon avledet fra normale myogene stamceller. Den eksosomale transplantasjonen kan forbedre hjertefunksjonen hos DMD-mus i forbindelse med økt uttrykk for dystrofi i mottakerhjerter. Passende metode for exon isolasjon, rensing, og intramyokarial transplantasjon bidra til suksessen til exon transplantasjon for å forbedre hjertefunksjonen for mus med Duchenne muskeldystrofi.MPC-avledet eksosombehandling kan forbedre skjelettmuskulaturfunksjonen ved eksosommediert normal dystrophin mRNA-overføring. Denne videoen demonstrerer de kritiske teknikkene for eksosomrensing, intramyokarial eksosomlevering og ekkokardiografi etter transplantasjon. Demonstrasjonen av ekkokardiografi vil bli gjort av Yan Shen, tekniker fra laboratoriet vårt.For å begynne denne prosedyren, frø fem millioner C2C12 celler i en 15 centimeter kultur rett med 20 milliliter av komplett DMEM inneholder 10% FBS og antibiotika. Inkuber ved 37 grader Celsius med 5%karbondioksid. Deretter bruker du en svingende bøtterotor til ultracentrifuge FBS ved 100 000 ganger G og ved fire grader Celsius i 18 timer for å forberede eksosomutarmet medium.Kast pelleten og samle supernatant. Når monolayercellene når 80% samløpet i kulturfatet, erstatt hele DMEM med eksosomtarmet medium. Bruk en overføringpipette til å samle supernatanten fra cellekulturfatet hver 48.Sentrifuger rørene ved 150 ganger G i ti minutter for å fjerne de resterende cellene. Filtrer supernatanten gjennom et 0,22 mikrometerfilter for å eliminere eventuelle cellerusk og overføre det filtrerte mediet til ultraklare rør. Deretter bruker du en svingbøtterotor til å ultracentrifuge rørene ved 100, 00 ganger G og ved 4 grader Celsius i 120 minutter for å utløse eksosomer.Resuspend eksosometholdig pellet i PBS og fyll deretter hele ultraklart rør med PBS. Ultracentrifuge denne suspensjonen ved 100, 00 ganger G og ved 4 grader Celsius i 120 minutter for å eliminere forurensende proteiner. Kast den overnaturlige og resuspend eksosom pellet i 100 mikroliter pbs.Oppbevares ved minus 80 grader Celsius for fremtidig bruk. Først fikse hver bedøvet mus i liggende stilling på en kirurgisk plattform ved å sikre hvert lem med tape. Plasser en 3-0 sutur horisontalt under de øvre tennene for å holde overkjeven på plass.Deretter påfør hårfjerningskrem på venstre side av musens bryst for å fjerne granen fra huden. Bruk et 24 gauge kateter, utfør endotrakeal intubasjon via munnhulen. Og bruk en gnagerventilator for å ventilere musen med romluft med en hastighet på 195 åndedrag per minutt.Desinfiser huden med 70% alkohol og 10% povidon jod. Deretter gjør en 10 til 15 millimeter skrå snitt fra venstre sternal kant til venstre armhulen. Bruk saks for å kutte pectoralis store og pectoralis mindre.Og gjør en venstre thoracotamy gjennom den fjerde intercoastal plass. Sett forsiktig inn inntraktorbånd for å spre thoraxhulen til en bredde på 10 millimeter, og ta vare på å ikke skade venstre lunge. Etter dette, bruk to rette pinsett for å fjerne perikardiet.Trekk dem fra hverandre og plasser dem bak retractor tips for å avsløre hjertet. Bruk en 31 gauge insulin nål til å injisere enten MPC-Exo eller PBS intramyocardially inn i fremre veggen av venstre ventrikkel på ett sted. Deretter bruker du 6-0 nylonsuturer for å lukke thoraxhulen, pectoralis-musklene og huden, i rekkefølge.To dager etter PBS eksosomtransplantasjon, bedøve musene som beskrevet i tekstprotokollen. Bruk tape for å fikse en mus i liggende stilling og påfør forvarmet akustisk gel på venstre brystområde. Deretter bruker du ekkokardiografi for å vurdere venstre ventrikulær funksjon.Få parasternal lang aksevisning av venstre ventrikkel i to dimensjoner og roter deretter ultralydsonden 90 grader for å få en venstre ventrikkel kort aksevisning på papillær muskelnivå. Etter dette registrerer du M-modus ekkokardigrafiske bilder og måler venstre ventrikulær end-diastolisk diameter, venstre ventrikulært end-systolisk volum, venstre ventrikulært enddiastolisk volum og venstre ventrikulært end-systolisk volum. Hjertefrekvensen til musene bør kontrolleres minst 400 bpm for hjertemålingsfunksjonen.Etter at eksosomer er isolert og renset fra C2C12-celler, bekreftes deres tilstedeværelse ved hjelp av overføringselektronmikroskopianalyse. Transmisjonselektronmikroskopibildet viser morfologien til de lyse og runde vesikler av C2C12-avledede eksosomer. Western blot analyse bekrefter tilstedeværelsen av eksosomer markører inkludert CD63 og Tsg101.Et gjennomskinnelig ødemområde observeres etter intramyokarial injeksjon i den fremre veggen i venstre ventrikkel av MDX-mus som indikerer at injeksjonen i myokardiet er vellykket. Immunofluorescerende farging for dystrophin utføres deretter for å avgjøre om hjerte MPC-Exo levering gjenoppretter dystrophin-protein uttrykk i MDX hjerter. Delvis restaurering av dystrophin uttrykk observeres med membran lokalisering i noen av kardiomyocytter.Hjertefunksjonen måles ved ekkokardiografi to dager etter intramyokarial levering for å avgjøre om transplisering av MPC-Exo forbedrer hjertefunksjonen hos MDX-mus. MPC-Exo-behandlingen er sett for å forbedre innvendig veggbevegelse sammenlignet med PBS, noe som tyder på at MPC-Exo-transplantasjon forbedret hjertefunksjonen hos MDX-mus. Ved hjelp av en 31 gauge insulin nål med spissen på ca 20 grader er avgjørende for suksessen for levering av de fleste eksosomer inn i myokardiet og maksimerer eksponeringen av injiserte eksosomer for å være vert for kardiomyocytter.Etter prosedyren kan dystrophinuttrykk oppdages etter MPC-avledet eksosominjeksjon ved immunofluorescerende farging som indikerer at hjerte MPC-avledet eksosomlevering gjenoppretter dystrophin-proteinuttrykk. Denne teknikken vil bane vei for kardiomyopati behandling med eksosombærende terapeutiske genetiske materialer inkludert DNA, mRNA, lncRNA, eller microRNAs.

Research

JoVE Journal

Genetics

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

Oppdrett og Double-stranded RNA-mediert Gene knockdown i Hide Beetle,<em&gt; Dermestes maculatus</em

Advances in genomics have raised the possibility of probing biodiversity at an unprecedented scale. However, sequence alone will not be informative ...

Single-cell Gene Expression Profiling Using FACS and qPCR with Internal Standards

Encellede Gene Expression Profilering hjelp FACS og qPCR med interne standarder

Gene expression measurements from bulk populations of cells can obscure the considerable transcriptomic variation of individual cells within those ...

Primordial Germ Cell Transplantation for CRISPR/Cas9-based Leapfrogging in Xenopus

Primordial Germ Cell Transplantation for CRISPR/Cas9-based Leapfrogging in Xenopus

Opprinnelige celletransplantasjon for CRISPR/Cas9-baserte sprang framover i Xenopus

The creation of mutant lines by genome editing is accelerating genetic analysis in many organisms. CRISPR/Cas9 methods have been adapted for use in the ...

Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation

Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation

Fosteret Microinjection og transplantasjon teknikk for Nasonia vitripennis genomet manipulasjon

The jewel wasp Nasonia vitripennis has emerged as an effective model system for the study of processes including sex determination, haplo-diploid sex ...

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9

Svært effektiv Gene avbrudd i Murine og menneskelig blodkreft stamfar celler av CRISPR/Cas9

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. ...

Bronchoalveolar Lavage Exosomes in Lipopolysaccharide-induced Septic Lung Injury

Bronchoalveolar Lavage Exosomes lipopolysakkarid-indusert septisk lungen skade

Acute lung injury (ALI) and acute respiratory distress syndrome (ARDS) represent a heterogeneous group of lung diseases which continues to have a high ...

A Combinatorial Single-cell Approach to Characterize the Molecular and Immunophenotypic Heterogeneity of Human Stem and Progenitor Populations

En kombinasjon encellede tilnærming som karakteriserer den molekylære og Immunophenotypic heterogenitet menneskelige stammen og stamfar bestander

Immunophenotypic characterization and molecular analysis have long been used to delineate heterogeneity and define distinct cell populations. FACS is ...

Dissection of Enhancer Function Using Multiplex CRISPR-based Enhancer Interference in Cell Lines

Disseksjon Enhancer funksjon med Multiplex CRISPR-baserte Enhancer forstyrrelser i linjer

Multiple enhancers often regulate a given gene, yet for most genes, it remains unclear which enhancers are necessary for gene expression, and how these ...

Isolation, Characterization and MicroRNA-based Genetic Modification of Human Dental Follicle Stem Cells

Isolering og karakterisering MicroRNA-baserte genetisk modifisering av menneskelig Dental hårsekken stamceller

To date, several stem cell types at different developmental stages are in the focus for the treatment of degenerative diseases. Yet, certain aspects, such ...

Preparation and Gene Modification of Nonhuman Primate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells

Forberedelse og genet modifikasjon Nonhuman primas blodkreft stilk og Progenitor celler

Hematopoietic stem and progenitor cell (HSPC) transplantation has been a cornerstone therapy for leukemia and other cancers for nearly half a century, ...