Name: purification and transplantation of myogenic progenitor cell derived exosomes to improve cardiac function in duchenne muscular dystrophic mice
Uploaded: 2019-04-10T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Purification and Transplantation of Myogenic Progenitor Cell Derived Exosomes to Improve Cardiac Function in Duchenne Muscular Dystrophic Mice at JoVE.com

Tang foram parcialmente suportado pela associação americana do coração: GRNT31430008, NIH-AR070029, HL086555-NIH NIH-HL134354.

Os animais foram tratados de acordo com protocolos aprovados e normas de bem-estar animal do Comité de utilização da faculdade médica de Geórgia na Universidade de Augusta e institucional Cuidado Animal.
1. isolamento e purificação de MPC-derivado Exosomes
<ol><li>Semente de 5 x 106 C2C12 células em um prato de cultura de célula 15 cm com de 20 mL Dulbecco completa modificado médio da águia (DMEM) contendo 10% de soro fetal bovino (FBS), 100 de U/mL penicilina G e 100 e...

<ol>
	<li>Yiu, E. M., Kornberg, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Duchenne+muscular+dystrophy.">Duchenne muscular dystrophy.</a> Journal of Paediatrics and Child Health. 51 (8), 759-764 (2015).</li><li>Nudel, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Duchenne+muscular+dystrophy+gene+product+is+not+identical+in+muscle+and+brain.">Duchenne muscular dystrophy gene product is not identical in muscle and brain.</a> Nature. 337 (6202), 76-78 (1989).</li><li>Rae, M. G., O'Malley, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cognitive+dysfunction+in+Duchenne+muscular+dystrophy:+a+possible+role+for+neuromodulatory+immune+molecules.">Cognitive dysfunction in Duchenne muscular dystrophy: a possible role for neuromodulatory immune molecules.</a> Journal of Neurophysiology. 116 (3), 1304-1315 (2016).</li><li>Mah, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+systematic+review+and+meta-analysis+on+the+epidemiology+of+Duchenne+and+Becker+muscular+dystrophy.">A systematic review and meta-analysis on the epidemiology of Duchenne and Becker muscular dystrophy.</a> Neuromuscular Disorders. 24 (6), 482-491 (2014).</li><li>D'Amario, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+current+approach+to+heart+failure+in+Duchenne+muscular+dystrophy.">A current approach to heart failure in Duchenne muscular dystrophy.</a> Heart. 103 (22), 1770-1779 (2017).</li><li>Koeks, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+Outcomes+in+Duchenne+Muscular+Dystrophy:+A+Study+of+5345+Patients+from+the+TREAT-NMD+DMD+Global+Database.">Clinical Outcomes in Duchenne Muscular Dystrophy: A Study of 5345 Patients from the TREAT-NMD DMD Global Database.</a> Journal of Neuromuscular Diseases. 4 (4), 293-306 (2017).</li><li>Kamdar, F., Garry, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dystrophin-Deficient+Cardiomyopathy.">Dystrophin-Deficient Cardiomyopathy.</a> Journal of the American College of Cardiology. 67 (21), 2533-2546 (2016).</li><li>Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regenerative+Therapy+for+Cardiomyopathies.">Regenerative Therapy for Cardiomyopathies.</a> Journal of Cardiovascular Translational Research. , (2018).</li><li>Fayssoil, A., Nardi, O., Orlikowski, D., Annane, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiomyopathy+in+Duchenne+muscular+dystrophy:+pathogenesis+and+therapeutics.">Cardiomyopathy in Duchenne muscular dystrophy: pathogenesis and therapeutics.</a> Heart Failure Reviews. 15 (1), 103-107 (2010).</li><li>Hagan, M., Ashraf, M., Kim, I. 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F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suxiao+Jiuxin+pill+promotes+exosome+secretion+from+mouse+cardiac+mesenchymal+stem+cells+in+vitro.">Suxiao Jiuxin pill promotes exosome secretion from mouse cardiac mesenchymal stem cells in vitro.</a> Acta Pharmacologica Sinica. 39 (4), 569-578 (2018).</li><li>Ruan, X. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+from+Suxiao+Jiuxin+pill-treated+cardiac+mesenchymal+stem+cells+decrease+H3K27+demethylase+UTX+expression+in+mouse+cardiomyocytes+in+vitro.">Exosomes from Suxiao Jiuxin pill-treated cardiac mesenchymal stem cells decrease H3K27 demethylase UTX expression in mouse cardiomyocytes in vitro.</a> Acta Pharmacologica Sinica. 39 (4), 579-586 (2018).</li><li>Chen, Y., Tang, Y., Fan, G. C., Duan, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles+as+novel+biomarkers+and+pharmaceutic+targets+of+diseases.">Extracellular vesicles as novel biomarkers and pharmaceutic targets of diseases.</a> Acta Pharmacologica Sinica. 39 (4), 499-500 (2018).</li><li>Chen, Y., Tang, Y., Long, W., Zhang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+Cell-Released+Microvesicles+and+Exosomes+as+Novel+Biomarkers+and+Treatments+of+Diseases.">Stem Cell-Released Microvesicles and Exosomes as Novel Biomarkers and Treatments of Diseases.</a> Stem Cells International. 2016, 2417268 (2016).</li><li>Murphy, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+role+of+extracellular+vesicles+in+musculoskeletal+diseases.">Emerging role of extracellular vesicles in musculoskeletal diseases.</a> Molecular Aspects of Medicine. 60, 123-128 (2018).</li><li>Su, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosome-Derived+Dystrophin+from+Allograft+Myogenic+Progenitors+Improves+Cardiac+Function+in+Duchenne+Muscular+Dystrophic+Mice.">Exosome-Derived Dystrophin from Allograft Myogenic Progenitors Improves Cardiac Function in Duchenne Muscular Dystrophic Mice.</a> Journal of Cardiovascular Translational Research. , (2018).</li><li>Hu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosome-mediated+shuttling+of+microRNA-29+regulates+HIV+Tat+and+morphine-mediated+neuronal+dysfunction.">Exosome-mediated shuttling of microRNA-29 regulates HIV Tat and morphine-mediated neuronal dysfunction.</a> Cell Death &amp; Disease. 3, 381 (2012).</li><li>Bayoumi, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+carvedilol-responsive+microRNA,+miR-125b-5p+protects+the+heart+from+acute+myocardial+infarction+by+repressing+pro-apoptotic+bak1+and+klf13+in+cardiomyocytes.">A carvedilol-responsive microRNA, miR-125b-5p protects the heart from acute myocardial infarction by repressing pro-apoptotic bak1 and klf13 in cardiomyocytes.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 114, 72-82 (2018).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes/microvesicles+from+induced+pluripotent+stem+cells+deliver+cardioprotective+miRNAs+and+prevent+cardiomyocyte+apoptosis+in+the+ischemic+myocardium.">Exosomes/microvesicles from induced pluripotent stem cells deliver cardioprotective miRNAs and prevent cardiomyocyte apoptosis in the ischemic myocardium.</a> International Journal of Cardiology. 192, 61-69 (2015).</li><li>Cheruvanky, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+isolation+of+urinary+exosomal+biomarkers+using+a+nanomembrane+ultrafiltration+concentrator.">Rapid isolation of urinary exosomal biomarkers using a nanomembrane ultrafiltration concentrator.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. 292 (5), 1657-1661 (2007).</li><li>Oksvold, M. P., Neurauter, A., Pedersen, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetic+bead-based+isolation+of+exosomes.">Magnetic bead-based isolation of exosomes.</a> Methods in Molecular Biology. 1218, 465-481 (2015).</li><li>Pedersen, K. W., Kierulf, B., Neurauter, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+and+Generic+Isolation+of+Extracellular+Vesicles+with+Magnetic+Beads.">Specific and Generic Isolation of Extracellular Vesicles with Magnetic Beads.</a> Methods in Molecular Biology. 1660, 65-87 (2017).</li><li>Teng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+Stem+Cell-Derived+Exosomes+Improve+the+Microenvironment+of+Infarcted+Myocardium+Contributing+to+Angiogenesis+and+Anti-Inflammation.">Mesenchymal Stem Cell-Derived Exosomes Improve the Microenvironment of Infarcted Myocardium Contributing to Angiogenesis and Anti-Inflammation.</a> Cellular Physiology and Biochemistry. 37 (6), 2415-2424 (2015).</li><li>Aminzadeh, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosome-Mediated+Benefits+of+Cell+Therapy+in+Mouse+and+Human+Models+of+Duchenne+Muscular+Dystrophy.">Exosome-Mediated Benefits of Cell Therapy in Mouse and Human Models of Duchenne Muscular Dystrophy.</a> Stem Cell Reports. 10 (3), 942-955 (2018).</li></ol>

O método de isolar exosomes puro é essencial para estudar a função de exosomes. Uma das técnicas comuns de isolamento do exossomo é Polietilenoglicóis (PEGs) mediada por precipitação17,18,25. Exosomes pode ser precipitado em PEGs e peletizado por centrifugação de baixa velocidade. PEG-mediada purificação é muito conveniente e de baixo custo, não necessita de nenhum equipamento avançado, mas há preocupação com ...

Distrofia muscular de Duchenne (DMD) é uma ligada ao X recessiva, progressiva doença neuromuscular causada por uma mutação no gene DMD e a perda de distrofina funcional1. Distrofina é expressa principalmente no miocárdio e músculo esquelético e manifesta-se menos no músculo liso, glândulas endócrinas e neurônios2,3. DMD é o tipo mais comum de distrofia muscular, com uma incidência de 1 por 3.500 a 5.000 meninos recém-nascidos em todo o mundo4,5. Indivíduos normalmente desenvolvem necrose muscular progressiva, perda de andar independente pelo início da adolescência e morte nas décadas de suas vidas devido a insuficiência cardíaca e insuficiência respiratória6segundo para terceiro.
Cardiomiopatia dilatada, arritmias e insuficiência cardíaca congestiva são manifestações cardiovasculares comuns de DMD7,8. A doença não pode ser curada, tratamento de suporte pode melhorar os sintomas ou retardar a progressão da insuficiência cardíaca, mas é muito difícil melhorar a função de coração9,10.
Semelhante aos pacientes DMD, distrofia ligada ao X (MDX) ratos são deficientes em proteína distrofina e os sintomas de cardiomiopatia11e, portanto, são amplamente utilizados na pesquisa de cardiomiopatia DMD associado. A fim de restaurar a distrofina em músculos afetados, terapia de células-tronco alogênico provou para ser um tratamento eficaz para DMD12,13,14. Exosomes, 30-150 vesículas de membrana nm secretadas por vários tipos de células, desempenham um papel fundamental na comunicação célula a célula através do transporte de material genético, como o ARN mensageiro (ARNm) e não-codificantes RNAs15,16,17 ,18,19,20,21.
Nossos estudos anteriores mostraram que o exosomes, derivado de células progenitoras miogênico (MPC), tais como linha de celular C2C12, pode transferir distrofina mRNA para anfitrião cardiomyocytes após injeção direta cardíaca22, indicando que entrega alogênico de MPC-derivado exosomes (MPC-Exo) transitoriamente pode restaurar a expressão do gene DMD em camundongos MDX. Este artigo centra-se em técnicas de purificação e transplante de MPC-Exo.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1064px;" width="1064">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:424px;">0.22-&#956;m Filter</td>
			<td style="width:280px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:185px;">09-720-004</td>
			<td style="width:175px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">15-cm Cell Culture Dish</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>157150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">24-gauge catheter</td>
			<td style="width:280px;">TERUMO</td>
			<td>SR-OX2419CA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">31-gauge insulin needle</td>
			<td style="width:280px;">BD</td>
			<td>328291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">4% paraformaldehyde&#160;</td>
			<td style="width:280px;">Affymetrix</td>
			<td>AAJ19943K2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">50 mL Centrifuge Tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>339652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">6-0 suture</td>
			<td style="width:280px;">Pro Advantage by NDC</td>
			<td>P420697</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG</td>
			<td style="width:280px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-11008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Antibiotic Antimycotic Solution</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>30-004-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-Dystrophin antibody</td>
			<td style="width:280px;">Abcam</td>
			<td>ab15277</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Antigen retriever&#160;</td>
			<td style="width:280px;">Aptum Biologics</td>
			<td>R2100-US</td>
			<td>Antigen recovery</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Autofluorescence Quenching Kit&#160;</td>
			<td style="width:280px;">Vector Laboratories</td>
			<td>SP-8400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">C2C12 cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1772</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Centrifuge</td>
			<td>Unico</td>
			<td>C8606</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Change-A-Tip High Temp Cauteries</td>
			<td>Bovie Medical Corporation</td>
			<td>HIT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Confocal microscopy</td>
			<td style="width:280px;">Zeiss</td>
			<td>Zeiss 780 Upright Confocal</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DBA/2J-mdx mice</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>013141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>10-013-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>35-011-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Goat serum&#160;</td>
			<td style="width:280px;">MP Biomedicals, LLC</td>
			<td>191356</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Isoflurane</td>
			<td style="width:280px;">Patterson Veterinary</td>
			<td>07-893-1389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ketamine</td>
			<td style="width:280px;">Henry Schein</td>
			<td>056344</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mounting Medium with DAPI&#160;</td>
			<td style="width:280px;">Vector Laboratories</td>
			<td>H-1500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mouse Retractor Set</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td>SURGI-5001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether</td>
			<td style="width:280px;">Fisher Scientific</td>
			<td>BP151-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rodent ventilator</td>
			<td style="width:280px;">Harvard Apparatus</td>
			<td>55-7066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SW-28 Ti rotor</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>342207</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">The Vevo 2100 Imaging Platform</td>
			<td style="width:280px;">FUJIFILM VisualSonics</td>
			<td>Vevo 2100</td>
			<td>Ultrasound System&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>365672</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ultra-Clear Tubes</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>344058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Xylazine (XylaMed)</td>
			<td style="width:280px;">Bimeda-MTC Animal Health Inc.</td>
			<td>1XYL003 8XYL006</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

purification and transplantation of myogenic progenitor cell derived exosomes to improve cardiac function in duchenne muscular dystrophic mice

Distrofia Muscular Duchene (DMD) é uma doença de genética recessiva ligada ao X causada pela falta da proteína distrofina funcional. A doença não pode ser curada, e como a doença progride, o paciente desenvolve sintomas de insuficiência cardíaca congestiva, arritmia e cardiomiopatia dilatada. Os ratos mutantes DMDMDX não expressam distrofina e são comumente usados como um modelo do rato da DMD. Em nosso estudo recente, observamos aquela injeção Intramiocárdica do tipo largura (WT)-exosomes de derivado de células progenitoras miogênico (MPC-Exo) restaurado transitoriamente a expressão da distrofina no miocárdio de ratos mutantes DMDMDX , que foi associado com uma melhoria transitória da função cardíaca, sugerindo que WT-MPC-Exo pode fornecer uma opção para aliviar os sintomas cardíacos de DMD. Este artigo descreve a técnica de purificação de MPC-Exo e transplante em corações de ratos mutantes DMDMDX .

Um fluxograma para isolamento e purificação de exosomes de C2C12 células é mostrado na Figura 1A. Para confirmar a presença de exosomes, foram realizadas análises de microscopia eletrônica de transmissão. Imagem de microscopia eletrônica de transmissão (Figura 1B) mostra a morfologia das vesículas de exosomes de C2C12 derivado forma brilhante e redonda. Análise ocidental do borrão confirmou a presença de marcadores...

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Purification and Transplantation of Myogenic Progenitor Cell Derived Exosomes to Improve Cardiac Function in Duchenne Muscular Dystrophic Mice

Aqui, apresentamos um protocolo para melhorar a função cardíaca em camundongos de distrofia muscular de Duchenne transitoriamente transplantando exosomes derivado de células progenitoras miogênico normal.

Purificação e transplante de células progenitoras miogênico derivado Exosomes para melhorar a função cardíaca em camundongos distróficos Muscular de Duchenne

Duchene Muscular Dystrophy (DMD) is an X-linked recessive genetic disease caused by a lack of functional dystrophin protein. The disease cannot be cured, ...

Este protocolo apresenta o método para melhorar transicionalmente a função cardíaca nos camundongos de distrofia muscular de Duchenne, transplantando exon derivado de células progenitoras miogênicas normais. O transplante exosmal pode melhorar a função cardíaca em camundongos DMD em associação com o aumento da expressão de distrofia em corações receptores. Método apropriado para isolamento de exon, purificação e transplante intramialárdico contribuem para o sucesso do transplante de exon para melhorar a função cardíaca para camundongos com a distrofia muscular de Duchenne.A terapia exososome derivada do MPC pode melhorar a função muscular esquelética pela transferência normal de distrofina mRNA mediada por distropina. Este vídeo demonstra as técnicas críticas para purificação exósia, parto exossomo intramocárdio e pós-transplante de ecocardiografia. A demonstração da ecocardiografia será feita por Yan Shen, técnico do nosso laboratório.Para iniciar este procedimento, semente cinco milhões de células C2C12 em um prato de cultura de 15 centímetros com 20 mililitros de DMEM completo contendo 10% FBS e antibióticos. Incubar a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono. Em seguida, use um rotor de balde balançando para ultracentrifugar FBS a 100.000 vezes G e a quatro graus Celsius por 18 horas para preparar o meio exosome-esgotado.Descarte a pelota e colete o supernasce. Quando as células monocamadas atingirem 80% de confluência no prato de cultura, substitua o DMEM completo por meio exossomo esgotado. Use uma pipeta de transferência para coletar o supernascedor do prato de cultura celular a cada 48 horas.Centrifugar os tubos a 150 vezes G durante dez minutos para remover as células restantes. Filtre o supernatante através de um filtro de 0,22 micrômetro para eliminar quaisquer detritos celulares e transfira os tubos filtrados para ultra-claros. Em seguida, use um rotor de balde de balanço para ultracentrifugar os tubos a 100, 00 vezes G e a 4 graus Celsius por 120 minutos para precipitar os exossomos.Resuspenha a pelota contendo exossomo na PBS e, em seguida, encha todo o tubo ultra-claro com PBS. Ultracentrizar esta suspensão a 100, 00 vezes G e a 4 graus Celsius por 120 minutos para eliminar proteínas contaminantes. Descarte o supernatante e resuspenja a pelota exososome em 100 microliters de PBS.Armazene a menos 80 graus Celsius para uso futuro. Primeiro, conserte cada rato anestesiado na posição supina em uma plataforma cirúrgica, protegendo cada membro com fita. Coloque uma sutura 3-0 horizontalmente abaixo dos dentes superiores para manter a mandíbula superior no lugar.Em seguida, aplique creme depilatório no lado esquerdo do peito do rato para remover o abeto da pele. Utilizando um cateter calibre 24, realize a intubação endotraqueal através da cavidade oral. E use um ventilador de roedores para ventilar o mouse com ar da sala a uma taxa de 195 respirações por minuto.Desinfete a pele com 70% de álcool e 10% de iodo povidone. Em seguida, faça uma incisão oblíqua de 10 a 15 milímetros da borda popa esquerda para a axila esquerda. Use uma tesoura para cortar o peitoral maior e peitoral menor.E faça uma thoracotamy esquerda através do quarto espaço intercostal. Insira suavemente faixas retráteis para espalhar a cavidade torácica a uma largura de 10 milímetros, tomando cuidado para não danificar o pulmão esquerdo. Depois disso, use duas pinças retas para remover o pericárdio.Puxe-os separados e coloque-os atrás das pontas do retrátil para expor o coração. Use uma agulha de insulina calibre 31 para injetar mpc-exo ou PBS intramyocardially na parede anterior do ventrículo esquerdo em um local. Em seguida, use suturas de nylon 6-0 para fechar a cavidade torácica, os músculos peitoral e a pele, em sequência.Dois dias após o transplante exossomo da PBS, anestesiar os camundongos conforme descrito no protocolo de texto. Use fita para fixar um mouse na posição supina e aplique gel acústico pré-aquecido na área do peito esquerdo. Em seguida, use ecocardiografia para avaliar a função ventricular esquerda.Obtenha a visão do eixo longo parasténal do ventrículo esquerdo em duas dimensões e, em seguida, gire a sonda de ultrassom 90 graus para obter uma visão de eixo curto ventrículo esquerdo no nível muscular papilar. Depois disso, grave imagens ecocardiográficas do modo M e meça o diâmetro ventricular final-diastólico esquerdo, o volume ventricular esquerdo end-sistólico, o volume ventricular esquerdo final-diastólico e o volume ventricular esquerdo end-sistólica. A frequência cardíaca dos camundongos deve ser controlada pelo menos 400 bpm para a função de medição cardíaca.Após exossomos serem isolados e purificados das células C2C12, sua presença é confirmada usando a análise de microscopia eletrônica de transmissão. A imagem de microscopia eletrônica de transmissão mostra a morfologia das vesículas brilhantes e redondas dos exosóis derivados de C2C12. A análise da mancha ocidental confirma a presença de marcadores exosóis, incluindo CD63 e Tsg101.Uma área de edema translúcido é observada após a injeção intramiocárdia na parede anterior do ventrículo esquerdo de camundongos mdx, o que indica que a injeção no miocárdio é bem sucedida. A coloração imunofluorescente para distrofina é então realizada para determinar se o parto cardíaco MPC-Exo restaura a expressão de proteína de distrofina em corações mdx. A restauração parcial da expressão da distrofina é observada com localização de membrana em alguns cardiomiócitos.A função cardíaca é medida pela ecocardiografia dois dias após a entrega intramocárida para determinar se a transplação do MPC-Exo melhora a função cardíaca em camundongos mdx. O tratamento MPC-Exo é visto para melhorar o movimento da parede interior em comparação com a PBS, sugerindo que o transplante MPC-Exo melhorou a função cardíaca em camundongos mdx. Usar uma agulha de insulina calibre 31 com a ponta a cerca de 20 graus é fundamental para o sucesso para a entrega da maioria dos exossomos no miocárdio e maximiza a exposição de exossomos injetados para hospedar cardiomócitos.Após o procedimento, a expressão da distrofina pode ser detectada após a injeção exosóica derivada do MPC por manchas imunofluorescentes indicando que a entrega exosóica derivada de MPC cardíaco restaura a expressão de proteína de distrfina. Esta técnica abrirá caminho para o tratamento da cardiomiopatia com materiais genéticos terapêuticos exossomos, incluindo DNA, mRNA, lncRNA ou microRNAs.

Research

JoVE Journal

Genetics

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

Criação e Double-stranded mediada por RNA silenciamento de genes na Esconder Beetle,<em&gt; Dermestes maculatus</em

Advances in genomics have raised the possibility of probing biodiversity at an unprecedented scale. However, sequence alone will not be informative ...

Genética

Single-cell Gene Expression Profiling Using FACS and qPCR with Internal Standards

Perfil de expressão gênica de célula única usando FACS e qPCR com controles internos

Gene expression measurements from bulk populations of cells can obscure the considerable transcriptomic variation of individual cells within those ...

Primordial Germ Cell Transplantation for CRISPR/Cas9-based Leapfrogging in Xenopus

Primordial Germ Cell Transplantation for CRISPR/Cas9-based Leapfrogging in Xenopus

Transplante de células de germes primordial para baseado em CRISPR/Cas9 saltos em Xenopus

The creation of mutant lines by genome editing is accelerating genetic analysis in many organisms. CRISPR/Cas9 methods have been adapted for use in the ...

Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation

Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation

Microinjeção de embrião e a técnica de transplante para manipulação de genoma Nasonia vitripennis

The jewel wasp Nasonia vitripennis has emerged as an effective model system for the study of processes including sex determination, haplo-diploid sex ...

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9

Disrupção do Gene altamente eficiente de células progenitoras hematopoiéticas murino e humano por CRISPR/Cas9

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. ...

Bronchoalveolar Lavage Exosomes in Lipopolysaccharide-induced Septic Lung Injury

Exosomes de lavagem broncoalveolar em lesão pulmonar séptico induzidas pelo lipopolissacarídeo

Acute lung injury (ALI) and acute respiratory distress syndrome (ARDS) represent a heterogeneous group of lung diseases which continues to have a high ...

A Combinatorial Single-cell Approach to Characterize the Molecular and Immunophenotypic Heterogeneity of Human Stem and Progenitor Populations

Uma combinatória célula única abordagem para caracterizar o Molecular e imunofenotípica heterogeneidade de tronco humano e populações de Progenitor

Immunophenotypic characterization and molecular analysis have long been used to delineate heterogeneity and define distinct cell populations. FACS is ...

Dissection of Enhancer Function Using Multiplex CRISPR-based Enhancer Interference in Cell Lines

Dissecação do Enhancer função usando interferência Multiplex Enhancer CRISPR-baseado em linhas de células

Multiple enhancers often regulate a given gene, yet for most genes, it remains unclear which enhancers are necessary for gene expression, and how these ...

Isolation, Characterization and MicroRNA-based Genetic Modification of Human Dental Follicle Stem Cells

Isolamento, caracterização e baseada em MicroRNA modificação genética de células-tronco humanas folículo Dental

To date, several stem cell types at different developmental stages are in the focus for the treatment of degenerative diseases. Yet, certain aspects, such ...

Preparation and Gene Modification of Nonhuman Primate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells

Preparação e modificação genética de primatas não humanos tronco hematopoiéticas e células progenitoras

Hematopoietic stem and progenitor cell (HSPC) transplantation has been a cornerstone therapy for leukemia and other cancers for nearly half a century, ...