Name: purification and transplantation of myogenic progenitor cell derived exosomes to improve cardiac function in duchenne muscular dystrophic mice
Uploaded: 2019-04-10T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Purification and Transplantation of Myogenic Progenitor Cell Derived Exosomes to Improve Cardiac Function in Duchenne Muscular Dystrophic Mice at JoVE.com

Tang fue parcialmente financiado por la American Heart Association: NIH-AR070029, NIH-HL086555, GRNT31430008, HL134354 de NIH.

Los animales fueron tratados según protocolos aprobados y normas de bienestar animal del institucional cuidado Animal y del Comité de uso del colegio médico de Georgia en la Universidad de Augusta.
1. aislamiento y purificación de exosomas derivados de MPC
<ol><li>Semilla 5 x 106 C2C12 células en una placa de cultivo celular de 15 cm con 20 mL completa Dulbecco modifican medio del águila (DMEM) con 10% suero bovino fetal (FBS), 100 U/mL de penicilina G y estreptomicina 100 d...

<ol>
	<li>Yiu, E. M., Kornberg, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Duchenne+muscular+dystrophy.">Duchenne muscular dystrophy.</a> Journal of Paediatrics and Child Health. 51 (8), 759-764 (2015).</li><li>Nudel, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Duchenne+muscular+dystrophy+gene+product+is+not+identical+in+muscle+and+brain.">Duchenne muscular dystrophy gene product is not identical in muscle and brain.</a> Nature. 337 (6202), 76-78 (1989).</li><li>Rae, M. G., O'Malley, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cognitive+dysfunction+in+Duchenne+muscular+dystrophy:+a+possible+role+for+neuromodulatory+immune+molecules.">Cognitive dysfunction in Duchenne muscular dystrophy: a possible role for neuromodulatory immune molecules.</a> Journal of Neurophysiology. 116 (3), 1304-1315 (2016).</li><li>Mah, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+systematic+review+and+meta-analysis+on+the+epidemiology+of+Duchenne+and+Becker+muscular+dystrophy.">A systematic review and meta-analysis on the epidemiology of Duchenne and Becker muscular dystrophy.</a> Neuromuscular Disorders. 24 (6), 482-491 (2014).</li><li>D'Amario, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+current+approach+to+heart+failure+in+Duchenne+muscular+dystrophy.">A current approach to heart failure in Duchenne muscular dystrophy.</a> Heart. 103 (22), 1770-1779 (2017).</li><li>Koeks, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+Outcomes+in+Duchenne+Muscular+Dystrophy:+A+Study+of+5345+Patients+from+the+TREAT-NMD+DMD+Global+Database.">Clinical Outcomes in Duchenne Muscular Dystrophy: A Study of 5345 Patients from the TREAT-NMD DMD Global Database.</a> Journal of Neuromuscular Diseases. 4 (4), 293-306 (2017).</li><li>Kamdar, F., Garry, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dystrophin-Deficient+Cardiomyopathy.">Dystrophin-Deficient Cardiomyopathy.</a> Journal of the American College of Cardiology. 67 (21), 2533-2546 (2016).</li><li>Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regenerative+Therapy+for+Cardiomyopathies.">Regenerative Therapy for Cardiomyopathies.</a> Journal of Cardiovascular Translational Research. , (2018).</li><li>Fayssoil, A., Nardi, O., Orlikowski, D., Annane, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiomyopathy+in+Duchenne+muscular+dystrophy:+pathogenesis+and+therapeutics.">Cardiomyopathy in Duchenne muscular dystrophy: pathogenesis and therapeutics.</a> Heart Failure Reviews. 15 (1), 103-107 (2010).</li><li>Hagan, M., Ashraf, M., Kim, I. M., Weintraub, N. L., Tang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effective+regeneration+of+dystrophic+muscle+using+autologous+iPSC-derived+progenitors+with+CRISPR-Cas9+mediated+precise+correction.">Effective regeneration of dystrophic muscle using autologous iPSC-derived progenitors with CRISPR-Cas9 mediated precise correction.</a> Medical Hypotheses. 110, 97-100 (2018).</li><li>Quinlan, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+the+mdx+mouse+cardiomyopathy:+physiological+and+morphological+findings.">Evolution of the mdx mouse cardiomyopathy: physiological and morphological findings.</a> Neuromuscular Disorders. 14 (8-9), 491-496 (2004).</li><li>Siemionow, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Creation+of+Dystrophin+Expressing+Chimeric+Cells+of+Myoblast+Origin+as+a+Novel+Stem+Cell+Based+Therapy+for+Duchenne+Muscular+Dystrophy.">Creation of Dystrophin Expressing Chimeric Cells of Myoblast Origin as a Novel Stem Cell Based Therapy for Duchenne Muscular Dystrophy.</a> Stem Cell Reviews and Reports. 14 (2), 189-199 (2018).</li><li>Sienkiewicz, D., Kulak, W., Okurowska-Zawada, B., Paszko-Patej, G., Kawnik, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Duchenne+muscular+dystrophy:+current+cell+therapies.">Duchenne muscular dystrophy: current cell therapies.</a> Therapeutic Advances in Neurological Disorders. 8 (4), 166-177 (2015).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+engraftment+of+myogenic+progenitors+from+adipose-derived+stem+cells+and+muscle+regeneration+in+dystrophic+mice.">Long-term engraftment of myogenic progenitors from adipose-derived stem cells and muscle regeneration in dystrophic mice.</a> Human Molecular Genetics. 24 (21), 6029-6040 (2015).</li><li>Ju, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+of+Cardiac+Mesenchymal+Stem+Cell-Derived+Exosomes+for+Angiogenesis.">Transplantation of Cardiac Mesenchymal Stem Cell-Derived Exosomes for Angiogenesis.</a> Journal of Cardiovascular Translational Research. 11 (5), 429-437 (2018).</li><li>Ju, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+of+Cardiac+Mesenchymal+Stem+Cell-Derived+Exosomes+Promotes+Repair+in+Ischemic+Myocardium.">Transplantation of Cardiac Mesenchymal Stem Cell-Derived Exosomes Promotes Repair in Ischemic Myocardium.</a> Journal of Cardiovascular Translational Research. 11 (5), 420-428 (2018).</li><li>Ruan, X. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suxiao+Jiuxin+pill+promotes+exosome+secretion+from+mouse+cardiac+mesenchymal+stem+cells+in+vitro.">Suxiao Jiuxin pill promotes exosome secretion from mouse cardiac mesenchymal stem cells in vitro.</a> Acta Pharmacologica Sinica. 39 (4), 569-578 (2018).</li><li>Ruan, X. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+from+Suxiao+Jiuxin+pill-treated+cardiac+mesenchymal+stem+cells+decrease+H3K27+demethylase+UTX+expression+in+mouse+cardiomyocytes+in+vitro.">Exosomes from Suxiao Jiuxin pill-treated cardiac mesenchymal stem cells decrease H3K27 demethylase UTX expression in mouse cardiomyocytes in vitro.</a> Acta Pharmacologica Sinica. 39 (4), 579-586 (2018).</li><li>Chen, Y., Tang, Y., Fan, G. C., Duan, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles+as+novel+biomarkers+and+pharmaceutic+targets+of+diseases.">Extracellular vesicles as novel biomarkers and pharmaceutic targets of diseases.</a> Acta Pharmacologica Sinica. 39 (4), 499-500 (2018).</li><li>Chen, Y., Tang, Y., Long, W., Zhang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+Cell-Released+Microvesicles+and+Exosomes+as+Novel+Biomarkers+and+Treatments+of+Diseases.">Stem Cell-Released Microvesicles and Exosomes as Novel Biomarkers and Treatments of Diseases.</a> Stem Cells International. 2016, 2417268 (2016).</li><li>Murphy, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+role+of+extracellular+vesicles+in+musculoskeletal+diseases.">Emerging role of extracellular vesicles in musculoskeletal diseases.</a> Molecular Aspects of Medicine. 60, 123-128 (2018).</li><li>Su, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosome-Derived+Dystrophin+from+Allograft+Myogenic+Progenitors+Improves+Cardiac+Function+in+Duchenne+Muscular+Dystrophic+Mice.">Exosome-Derived Dystrophin from Allograft Myogenic Progenitors Improves Cardiac Function in Duchenne Muscular Dystrophic Mice.</a> Journal of Cardiovascular Translational Research. , (2018).</li><li>Hu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosome-mediated+shuttling+of+microRNA-29+regulates+HIV+Tat+and+morphine-mediated+neuronal+dysfunction.">Exosome-mediated shuttling of microRNA-29 regulates HIV Tat and morphine-mediated neuronal dysfunction.</a> Cell Death &amp; Disease. 3, 381 (2012).</li><li>Bayoumi, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+carvedilol-responsive+microRNA,+miR-125b-5p+protects+the+heart+from+acute+myocardial+infarction+by+repressing+pro-apoptotic+bak1+and+klf13+in+cardiomyocytes.">A carvedilol-responsive microRNA, miR-125b-5p protects the heart from acute myocardial infarction by repressing pro-apoptotic bak1 and klf13 in cardiomyocytes.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 114, 72-82 (2018).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes/microvesicles+from+induced+pluripotent+stem+cells+deliver+cardioprotective+miRNAs+and+prevent+cardiomyocyte+apoptosis+in+the+ischemic+myocardium.">Exosomes/microvesicles from induced pluripotent stem cells deliver cardioprotective miRNAs and prevent cardiomyocyte apoptosis in the ischemic myocardium.</a> International Journal of Cardiology. 192, 61-69 (2015).</li><li>Cheruvanky, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+isolation+of+urinary+exosomal+biomarkers+using+a+nanomembrane+ultrafiltration+concentrator.">Rapid isolation of urinary exosomal biomarkers using a nanomembrane ultrafiltration concentrator.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. 292 (5), 1657-1661 (2007).</li><li>Oksvold, M. P., Neurauter, A., Pedersen, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetic+bead-based+isolation+of+exosomes.">Magnetic bead-based isolation of exosomes.</a> Methods in Molecular Biology. 1218, 465-481 (2015).</li><li>Pedersen, K. W., Kierulf, B., Neurauter, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+and+Generic+Isolation+of+Extracellular+Vesicles+with+Magnetic+Beads.">Specific and Generic Isolation of Extracellular Vesicles with Magnetic Beads.</a> Methods in Molecular Biology. 1660, 65-87 (2017).</li><li>Teng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+Stem+Cell-Derived+Exosomes+Improve+the+Microenvironment+of+Infarcted+Myocardium+Contributing+to+Angiogenesis+and+Anti-Inflammation.">Mesenchymal Stem Cell-Derived Exosomes Improve the Microenvironment of Infarcted Myocardium Contributing to Angiogenesis and Anti-Inflammation.</a> Cellular Physiology and Biochemistry. 37 (6), 2415-2424 (2015).</li><li>Aminzadeh, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosome-Mediated+Benefits+of+Cell+Therapy+in+Mouse+and+Human+Models+of+Duchenne+Muscular+Dystrophy.">Exosome-Mediated Benefits of Cell Therapy in Mouse and Human Models of Duchenne Muscular Dystrophy.</a> Stem Cell Reports. 10 (3), 942-955 (2018).</li></ol>

El método de aislamiento de exosomas pura es esencial para el estudio de la función de exosomas. Una de las técnicas comunes para el aislamiento de exosomas es polietilenglicoles (PEGs) mediada por precipitación17,18,25. Exosomas pueden ser precipitada en las clavijas y peleteado por centrifugación a baja velocidad. Mediada por PEG purificación es muy conveniente y de bajo costo, no necesita ningún equipo avanzado, pero h...

Distrofia muscular de Duchenne (DMD) es una X-ligado recesiva, progresiva enfermedad neuromuscular causada por una mutación en el gen de la DMD y la pérdida de distrofina funcional1. Distrofina se expresa principalmente en el miocardio y músculo esquelético y menos se expresa en el músculo liso, glándulas endocrinas y neuronas2,3. DMD es el tipo más común de distrofia muscular con una incidencia de uno por cada 3.500 a 5.000 niños recién nacidos en todo el mundo4,5. Individuos suelen desarrollan necrosis muscular progresiva, pérdida de independiente a pie en la adolescencia temprana y la muerte en las décadas de segunda a tercera de sus vidas debido a la insuficiencia cardíaca y la insuficiencia respiratoria6.
Miocardiopatía dilatada, arritmias e insuficiencia cardíaca congestiva son manifestaciones cardiovasculares comunes de DMD7,8. No se puede curar la enfermedad, tratamiento de apoyo puede mejorar los síntomas o retrasar la progresión de la insuficiencia cardíaca, pero es muy difícil mejorar la función de corazón9,10.
Similares para los pacientes con DMD distrofia muscular X-ligado (MDX) ratones son deficientes en la proteína de distrofina y presente síntomas de cardiomiopatía11y por lo tanto son ampliamente utilizados en la investigación DMD asociado miocardiopatía. Con el fin de restaurar la distrofina en los músculos afectados, terapia de células madre alogénico ha demostrado para ser un eficaz tratamiento para la DMD12,13,14. Exosomas, vesículas de membrana 30-150 nm secretadas por varios tipos celulares, juegan un papel clave en la comunicación de célula a célula a través de transporte de material genético, ARN mensajero (ARNm) como no-codificación RNAs15,16,17 ,18,19,20,21.
Nuestros estudios previos han demostrado que los exosomas derivados de células progenitoras miógeno (MPC), como línea de celular C2C12, pueden transferir dystrophin mRNA al host cardiomiocitos después de inyección cardiaca directa22, indicando que entrega alogénico de Exosomas derivados de MPC (MPC-Exo) transitorio pueden restaurar la expresión del gen DMD en ratones MDX. Este artículo se centra en técnicas de purificación y trasplante MPC-Exo.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1064px;" width="1064">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:424px;">0.22-&#956;m Filter</td>
			<td style="width:280px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:185px;">09-720-004</td>
			<td style="width:175px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">15-cm Cell Culture Dish</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>157150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">24-gauge catheter</td>
			<td style="width:280px;">TERUMO</td>
			<td>SR-OX2419CA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">31-gauge insulin needle</td>
			<td style="width:280px;">BD</td>
			<td>328291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">4% paraformaldehyde&#160;</td>
			<td style="width:280px;">Affymetrix</td>
			<td>AAJ19943K2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">50 mL Centrifuge Tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>339652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">6-0 suture</td>
			<td style="width:280px;">Pro Advantage by NDC</td>
			<td>P420697</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG</td>
			<td style="width:280px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-11008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Antibiotic Antimycotic Solution</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>30-004-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-Dystrophin antibody</td>
			<td style="width:280px;">Abcam</td>
			<td>ab15277</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Antigen retriever&#160;</td>
			<td style="width:280px;">Aptum Biologics</td>
			<td>R2100-US</td>
			<td>Antigen recovery</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Autofluorescence Quenching Kit&#160;</td>
			<td style="width:280px;">Vector Laboratories</td>
			<td>SP-8400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">C2C12 cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1772</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Centrifuge</td>
			<td>Unico</td>
			<td>C8606</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Change-A-Tip High Temp Cauteries</td>
			<td>Bovie Medical Corporation</td>
			<td>HIT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Confocal microscopy</td>
			<td style="width:280px;">Zeiss</td>
			<td>Zeiss 780 Upright Confocal</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DBA/2J-mdx mice</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>013141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>10-013-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>35-011-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Goat serum&#160;</td>
			<td style="width:280px;">MP Biomedicals, LLC</td>
			<td>191356</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Isoflurane</td>
			<td style="width:280px;">Patterson Veterinary</td>
			<td>07-893-1389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ketamine</td>
			<td style="width:280px;">Henry Schein</td>
			<td>056344</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mounting Medium with DAPI&#160;</td>
			<td style="width:280px;">Vector Laboratories</td>
			<td>H-1500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mouse Retractor Set</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td>SURGI-5001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether</td>
			<td style="width:280px;">Fisher Scientific</td>
			<td>BP151-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rodent ventilator</td>
			<td style="width:280px;">Harvard Apparatus</td>
			<td>55-7066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SW-28 Ti rotor</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>342207</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">The Vevo 2100 Imaging Platform</td>
			<td style="width:280px;">FUJIFILM VisualSonics</td>
			<td>Vevo 2100</td>
			<td>Ultrasound System&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>365672</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ultra-Clear Tubes</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>344058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Xylazine (XylaMed)</td>
			<td style="width:280px;">Bimeda-MTC Animal Health Inc.</td>
			<td>1XYL003 8XYL006</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

purification and transplantation of myogenic progenitor cell derived exosomes to improve cardiac function in duchenne muscular dystrophic mice

Distrofia Muscular de Duchenne (DMD) es una enfermedad genética recesiva x-ligada causada por una carencia de la proteína distrofina funcional. No se puede curar la enfermedad, y conforme avanza la enfermedad, el paciente desarrolla síntomas de insuficiencia cardíaca congestiva, miocardiopatía dilatada y arritmias. Los ratones mutantes DMDMDX no expresan distrofina y se utilizan comúnmente como un modelo de ratón de la DMD. En nuestro reciente estudio, se observó que la inyección intramiocárdica de tipo ancho (WT)-progenitor miógena exosomas derivados de células (MPC-Exo) transitoriamente restauran la expresión de distrofina en el miocardio de ratones mutantes DMDMDX , asociada con una mejora transitoria de la función cardiaca, lo que sugiere que WT-MPC-Exo puede proporcionar una opción para aliviar los síntomas cardiacos de la DMD. Este artículo describe la técnica de purificación de MPC-Exo y el trasplante en corazones de ratones mutantes DMDMDX .

Un diagrama de flujo para aislar y purificar exosomas de células C2C12 se muestra en la figura 1A. Para confirmar la presencia de exosomas, realizamos análisis de microscopia electrónica de transmisión. Imagen de microscopía electrónica de transmisión (figura 1B) muestra la morfología de las vesículas de forma brillante y redonda de exosomas C2C12 derivados. Mancha blanca /negra occidental análisis confirmaron la prese...

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Purification and Transplantation of Myogenic Progenitor Cell Derived Exosomes to Improve Cardiac Function in Duchenne Muscular Dystrophic Mice

Aquí, presentamos un protocolo para mejorar transitoriamente la función cardiaca en ratones de la distrofia muscular de Duchenne mediante el trasplante de exosomas derivados de células progenitoras miógena normal.

Purificación y trasplante de células progenitoras miógena derivan exosomas para mejorar la función cardiaca en ratones distróficos musculares de Duchenne

Duchene Muscular Dystrophy (DMD) is an X-linked recessive genetic disease caused by a lack of functional dystrophin protein. The disease cannot be cured, ...

Este protocolo presenta el método para mejorar transitoriamente la función cardíaca en los ratones con distrofia muscular de Duchenne mediante el trasplante de exón derivado de células progenitoras miogénicas normales. El trasplante exosomal puede mejorar la función cardíaca en ratones con DMD en asociación con una mayor expresión de distrofia en los corazones receptores. El método adecuado para el aislamiento de exones, la purificación y el trasplante intramiocardio contribuyen al éxito del trasplante de exón para mejorar la función cardíaca de los ratones con la distrofia muscular de Duchenne.La terapia de exosomas derivada de MPC podría mejorar la función del músculo esquelético mediante la transferencia de ARNm de distrofina normal mediada por exosomas. Este video demuestra las técnicas críticas para la purificación de exosomas, la administración de exosomas intramiocardiales y la ecocardiografía después del trasplante. La demostración de ecocardiografía será realizada por Yan Shen, técnico de nuestro laboratorio.Para comenzar este procedimiento, sembrar cinco millones de células C2C12 en un plato de cultivo de 15 centímetros con 20 mililitros de DMEM completo que contiene 10%FBS y antibióticos. Incubar a 37 grados centígrados con un 5% de dióxido de carbono. A continuación, utilice un rotor de cubo oscilante para ultracentrífuir FBS a 100.000 veces G y a cuatro grados Celsius durante 18 horas para preparar el medio agotado por exosomas.Deseche el pellet y recoja el sobrenadante. Cuando las células monocapa alcancen el 80% de confluencia en el plato de cultivo, reemplace el DMEM completo por un medio agotado por exosomas. Utilice una pipeta de transferencia para recoger el sobrenadante del plato de cultivo celular cada 48 horas.Centrifugar los tubos a 150 veces G durante diez minutos para extraer las células restantes. Filtrar el sobrenadante a través de un filtro de 0,22 micrómetros para eliminar cualquier residero celular y transferir el medio filtrado a tubos ultra claros. A continuación, utilice un rotor de cubo oscilante para ultracentrífater los tubos a 100, 00 veces G y a 4 grados Celsius durante 120 minutos para precipitar los exosomas.Resuspender el pellet que contiene exosoma en PBS y luego llenar todo el tubo ultra-claro con PBS. Ultracentrífaza esta suspensión a 100, 00 veces G y a 4 grados Celsius durante 120 minutos para eliminar las proteínas contaminantes. Deseche el sobrenadante y resuspendir el pellet exosoma en 100 microlitros de PBS.Conservar a menos 80 grados Centígrados para uso futuro. Primero, fije cada ratón anestesiado en la posición supina en una plataforma quirúrgica asegurando cada extremidad con cinta adhesiva. Coloque una sutura 3-0 horizontalmente debajo de los dientes superiores para mantener la mandíbula superior en su lugar.A continuación, aplica crema depilatoria en el lado izquierdo del pecho del ratón para quitar el abeto de la piel. Usando un catéter de calibre 24, realice la intubación endotraqueal a través de la cavidad oral. Y utilice un respirador de roedores para ventilar el ratón con aire de la habitación a una velocidad de 195 respiraciones por minuto.Desinfectar la piel con 70%alcohol y 10%yodo povidona. Luego haz una incisión oblicua de 10 a 15 milímetros desde el borde esternal izquierdo hasta la axila izquierda. Use tijeras para cortar el pectoral mayor y pectoralis menor.Y hacer una toracota izquierda a través del cuarto espacio intercostero. Inserte suavemente las bandas retráctiles para extender la cavidad torácica a una anchura de 10 milímetros teniendo cuidado de no dañar el pulmón izquierdo. Después de esto, use dos pinzas rectas para eliminar el pericardio.Tire de ellos y colóquelos detrás de las puntas del retractor para exponer el corazón. Utilice una aguja de insulina de calibre 31 para inyectar MPC-Exo o PBS intramiocardimente en la pared anterior del ventrículo izquierdo en un sitio. Luego, usa suturas de nylon 6-0 para cerrar la cavidad torácica, los músculos pectorales y la piel, en secuencia.Dos días después del trasplante de exosomas de PBS, anestesia a los ratones como se describe en el protocolo de texto. Utilice cinta adhesiva para fijar un ratón en posición supina y aplique gel acústico precalentado en la zona izquierda del pecho. A continuación, utilice la ecocardiografía para evaluar la función ventricular izquierda.Obtener la vista de eje largo parasternal del ventrículo izquierdo en dos dimensiones y luego girar la sonda de ultrasonido 90 grados para obtener una vista del eje corto del ventrículo izquierdo a nivel muscular papilar. Después de esto, grabe imágenes ecocardiográficas en modo M y mida el diámetro diastólico final del ventrículo izquierdo, el volumen sistólico final ventricular izquierdo, el volumen diastólico final del ventrículo izquierdo y el volumen sistólico final del ventrículo izquierdo. La frecuencia cardíaca de los ratones debe controlarse al menos 400 lpm para la función de medición cardíaca.Después de que los exosomas se aíslen y se purifican a partir de células C2C12, su presencia se confirma mediante el análisis de microscopía electrónica de transmisión. La imagen de microscopía electrónica de transmisión muestra la morfología de las vesículas brillantes y redondas de los exosomas derivados de C2C12. El análisis de manchas occidentales confirma la presencia de marcadores de exosomas, incluidos CD63 y Tsg101.Se observa un área de edema translúcido después de la inyección intramiocardio en la pared anterior del ventrículo izquierdo de ratones mdx que indica que la inyección en el miocardio es exitosa. La tinción inmunofluorescente para la distrofina se realiza entonces para determinar si la entrega MPC-Exo cardíaca restaura la expresión de distrofina-proteína en corazones mdx. La restauración parcial de la expresión de distrofina se observa con la localización de la membrana en algunos de los cardiomiocitos.La función cardíaca se mide mediante ecocardiografía dos días después del parto intramiocardio para determinar si la translación de MPC-Exo mejora la función cardíaca en ratones mdx. El tratamiento MPC-Exo se ve para mejorar el movimiento de la pared interior en comparación con PBS, lo que sugiere que el trasplante MPC-Exo mejoró la función cardíaca en ratones mdx. El uso de una aguja de insulina de calibre 31 con la punta a unos 20 grados es fundamental para el éxito para la entrega de la mayoría de los exosomas en el miocardio y maximiza la exposición de exosomas inyectados para albergar cardiomiocitos.Después del procedimiento, la expresión de distrofina se puede detectar después de la inyección de exosoma derivada de MPC por tinción inmunofluorescente que indica que la administración de exosomas derivada de MPC cardíaco restaura la expresión de la proteína distrfina. Esta técnica allanará el camino para el tratamiento de la cardiomiopatía con materiales genéticos terapéuticos portadores de exosomas, incluyendo ADN, ARNm, lncRNA o microRNAs.

Research

JoVE Journal

Genetics

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La cría y el doble-stranded RNA mediada gen desmontables en el Hide Escarabajo,<em&gt; Dermestes maculatus</em

Advances in genomics have raised the possibility of probing biodiversity at an unprecedented scale. However, sequence alone will not be informative ...

Investigación

Genética

Single-cell Gene Expression Profiling Using FACS and qPCR with Internal Standards

Una sola célula de perfiles de expresión génica El uso de FACS y qPCR con las Normas Internas

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Microinyección de embriones y la técnica de trasplante para la manipulación del genoma de Nasonia vitripennis

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